Procedimento para a fabricação de nanofibras biofuncionais

Resumo

Uma abordagem eficiente para a preparação de nanofibras decorados com grupos funcionais capazes de interagir especificamente com as proteínas é descrito. A primeira abordagem requer a preparação de um polímero funcionalizado com o grupo funcional apropriado. O polímero funcional é fabricado em nanofibras por electrospinning. A eficácia da ligação das nanofibras com uma proteína é estudada por microscopia confocal.

Resumo

Electrospinning é um método de transformação eficiente para a preparação de nanofibras decorados com grupos funcionais. Nanofibras decorados com grupos funcionais podem ser utilizados para estudar o material de biomarcadores interacções isto ato como biossensores com potencial como detectores de moléculas isoladas. Desenvolvemos uma abordagem eficaz para a preparação de polímeros funcionais em que a funcionalidade tem a capacidade de se ligar especificamente a uma proteína modelo. No nosso sistema modelo, o grupo funcional é 2,4-dinitrofenilo (DNP) e a proteína é anti-DNP IgE (imunoglobulina E). O polímero funcional, α, ω-bi [2,4-dinitrofenil capróico] [poli (óxido de etileno)-b-poli (2-metoxiestireno)-b-poli (óxido de etileno)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO- CDNP), é preparado por polimerização aniónica vivo. O iniciador difuncional utilizado na polimerização foi preparado por reacção de transferência de electrões de α-metilestireno e metal (espelho) de potássio. O monómero de 2-metoxiestireno foi adicionadaprimeiro para o iniciador, seguindo-se a adição do segundo monómero, óxido de etileno, e, finalmente, o polímero vivo foi terminado por metanol. O α, ω-dihydroxyl polímero [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] foi feito reagir com N-2 ,4-DNP-∈-amino capróico, por acoplamento DCC, resultando na formação de α, ω-bi [ 2,4-dinitrophenylcaproic] [poli (óxido de etileno)-b-poli (2-metoxiestireno)-b-poli (óxido de etileno)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). Os polímeros foram caracterizados por FT-IR, ^1H NMR e Cromatografia de Permeação em Gel (GPC). As distribuições de pesos moleculares dos polímeros foram estreito (1.1-1.2) e polímeros com pesos moleculares superiores a 50.000 foi usado neste estudo. Os polímeros foram pós amarelos e solúveis em tetra-hidrofurano. A solúvel em água CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / DMEG (glicol dimethoxyethylene) complexo se liga e consegue ligação estado constante com solução IgE dentro de alguns segundos. Maior peso molecular (isto é insolúvel em água em torno de 50.000) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP polímeros, contendo 1% de nanotubos de carbono de parede única (SWCNT) foram transformadas em nanofibras electroactivas (100 nm a 500 nm de diâmetro) sobre o substrato de silício. Espectroscopia de fluorescência mostra que o anti-DNP IgE interage com as nanofibras por ligação com os grupos funcionais DNP decorando as fibras. Estas observações sugerem que nanofibras adequadamente funcionalizados promessa para o desenvolvimento de dispositivo de detecção de biomarcadores.

Protocolo

1. Síntese de α, ω-dihydroxyl Polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH]

1. Montar reactor de polimerização, como mostrado na Figura 1. O reactor para esta experiência consiste em um ml de fundo redondo 100 2-pescoço balão que possui um conjunto padrão de cone exterior (Chemglass), duas placas de controlo de fluxo com torneiras de passagem (Chemglass), e uma haste de Teflon agitação. Um adaptador (Figura 1) foi utilizado para manter a Ultra Alta Pureza Azoto (UHP) que flui através do sistema, a fim de impedir que o ar e a humidade entrem no sistema inerte. Adaptador B (Figura 1), foi utilizada para injectar o monómero, solvente e iniciador para o balão de reacção.
2. Seque 200 ml de tetra-hidrofurano (THF) ao longo de metal de Na, utilizando benzof enona como indicador, para um mínimo de 6 horas sob atmosfera de azoto seco.
3. Secar 10 ml de 2-metoxiestireno sobre hidreto de cálcio, durante 24 horas.
4. Preparar um banho de temperatura fria mantida a -78 ° C, utilizando uma suspensão de isopropanol and azoto líquido.
5. Adicionar 25 ml de THF no balão de reacção de polimerização (ver Figura 1), sob azoto gasoso e manter reactor sob atmosfera de azoto através de toda a polimerização.
6. Lugar frasco de 100 ml de fundo redondo em pasta.
7. Adicionam-se 2 ml (0,27 mmol / ml) da solução de iniciador para o balão de reacção.
8. Injectar o primeiro monómero, 2-metoxiestireno (4 ml) para dentro do balão de reacção.
9. Permitir que a reacção prosseguir durante 40 min.
10. Adicionar 1 mL do segundo monómero, óxido de etileno.
11. Permitir que a polimerização prosseguir à temperatura ambiente durante dois dias.
12. Terminar o polímero com HCl (6 M) / metanol (1/20, vol / vol).
13. Purifica-se o polímero por precipitação em hexano e seco de polímero num forno de vácuo.
14. Caracterizar o polímero utilizando RMN.

2. Funcionalização de α, ω-dihydroxyl Polímero com N-2 ,4-DNP-Ε-amino capróico obter o Polym Funcionaler, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP

1. Em um balão de três tubuladuras, coloque o α, ω-dihydroxyl polímero (0,05 mmol), o ácido N-2 ,4-E-DNP-amino capróico (0,25 mmol), DCC (0,15 mmol) e DMAP (0,005 mmol) e secar em linha de vácuo durante 4 horas.
2. Destila-se diclorometano anidro (10 ml) ao balão.
3. Desligar o vácuo sob atmosfera de azoto e agita-se reacção durante 12 horas à temperatura ambiente.
4. Filtrar mistura de reacção e recuperação de polímero por precipitação por duas vezes em hexano e metanol.
5. Seco precipitou polímero numa estufa de vácuo a 40 ° C.
6. Determinar a estrutura e funcionalidade do polímero através de FT-IR e RMN H ^1.

3. Preparação da solução para CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT Electrospinning

1. Dissolver 20% w da CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP em clorobenzeno.
2. Dissolver 20% e 40% w w de Poliestireno (MW 800.000) em clorobenzeno a preparar duas soluções. Quanto maior o poliestireno molecular é utilizado para cada veze polímeros de cadeia de cadeia de emaranhamento e de obter a viscosidade óptima necessária para electrospinning.
3. Misturar as soluções de polímero preparadas em 3,1 e 3,2 para formar 1:1 e 1:2 dos polímeros e adicionar 1% p nanotubos de carbono com paredes simples (SWCNT) à mistura e agita-se durante a noite para uma distribuição uniforme de nanotubos de carbono.

4. Electrospinning of Polymer-CNT Composite

1. Montar o electrospinning configurada como mostrado na Figura 2. No lado direito da figura é a Glassman fonte de alta tensão. Próximo a ele é um stand réplica em que a bolacha de silício é ligado. Para a esquerda é uma outra posição em que a retorta seringa é montada por trás e que é a luz para a visualização do processo à medida que progride.
2. Utilizando uma seringa hipodérmica, retirar uma pequena quantidade da mistura CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polystyrene/SWCNT (cerca de 1 ml) e montar a seringa hipodérmica com o suporte de retorta.
3. Uma bolacha de silício é o monteed transversalmente a partir da seringa de forma segura a uma distância de 10 cm, e o clipe de terra da fonte de alta tensão está ligado a ele.
4. Fixar o clipe tendo a alta voltagem a ser aplicada à agulha da seringa, o êmbolo um pouco (para suspender uma gota sobre a ponta da agulha), e, neste ponto, está pronto electrospinning.
5. Potência na fonte de alta tensão e ajuste medidor de tensão a 10 kV. Dependendo da natureza dos polímeros no compósito, as tensões mais altas pode ser necessário, especialmente se nanofibras sob cem nanómetros de diâmetro são desejados.
6. Pastilha de silício desmontar e colocar em um dessecador durante a noite para secar completamente.

5. Caracterização de nanofibras

1. De imagem inicial de nanofibras é feita com microscópio óptico para observar a perspectiva geral das fibras.
2. Utilize Microscópio Eletrônico de Varredura para observar pequenos detalhes, como morfologia, tamanho dos poros de diâmetro, média, etc
3. Transportara imagem ainda mais com um microscópio de força atômica para observar 3-D topografia de fibras, etc

6. Especificidade de ligação de nanofibras com Proteína IgE anti-DNP

1. Prepara-se uma solução de 4 ug / l marcado por fluorescência, FITC-IgE (Fluoresceína E Isothio-cianato-imunoglobulina) em PBS-BSA (Tampão fosfato salino-Albumina de Soro Bovino) a solução.
2. Coloque um pequeno pedaço de wafer de silício em que há nanofibras sobre uma lamela bem MatTek. Incubar as nanofibras nesta solução durante uma hora. A incubação é feito com cuidado pipetando para fora, 10 ul solução IgE no wafer de silício.
3. Após a incubação, remove IgE não ligada através de lavagem por três vezes com a solução tampão de PBS-BSA. A solução de PBS é dispensada suavemente sobre a parede da cápsula MatTek, a fim de evitar esguichar o tampão directamente sobre as nanofibras. Roda o prato suavemente com a mão, para distribuir solução tampão em nanofibras. Remova cuidadosamente tampão com uma pipeta e returfa esta mais duas vezes.
4. Para o controlo, a incubação em nanofibras de IgG marcado com fluorescência (não-específico para DNP) sob as mesmas condições.
5. Visualize as fibras encadernados com um microscópio confocal para observar a ligação com a IgE. Para o nosso estudo, o microscópio confocal Leica utilizado foi TCS SP2 com 63x lente.

7. Corrente-Tensão Comportamento de nanofibras

1. Conecte dois posicionadores micro a uma fonte de corrente muito baixa, como a 6430 Keithley SourceMeter sensível. A configurado para a determinação do comportamento de tensão de corrente é mostrada na Figura 3. Esta figura mostra a estação de sonda utilizada para determinar as características iniciais IV das nanofibras. É constituída pela Bausch e Lomb Microscópio MicroZoom, um vácuo Stage mandril, e quatro microposicionadores utilizados na sondagem. No canto superior direito é a Agilent 34405A multímetro digital utilizado para medir a tensão e abaixo que é o Keithley 6430 Sub-Femtoamp medidor Fonte remoto usado para a fonte de baixas correntes que eram de entrada nas fibras.
2. Montar os braços de sonda de micro os posicionadores sobre a esteira de fibras em lados opostos com as pontas das fibras que tocam.
3. Conectar outros dois posicionadores micro a um multímetro digital, montar os braços sonda-nos entre os outros dois e desembarcar as dicas sobre o tapete de fibra. Certifique-se de que as quatro pontas são colineares como possível.
4. Quantidades variáveis ​​de entrada actual da Keithley (tipicamente na gama nanoamps).
5. Medir a queda de tensão através das pontas exteriores, para cada magnitude de corrente de origem.
6. Traçando estes valores indicam o tipo de dispositivo, o tapete funciona como fibra.

8. Resultados representativos

Polímero Funcional

"> O método para a síntese de α, ω-bi [2,4-dinitrofenil capróico] [poli (óxido de etileno)-b-poli (2-metoxiestireno)-b-poli (óxido de etileno)] (CDNP-PEO- P2MS-PEO-CDNP) é mostrado na Figura 4. ^uma estrutura do polímero funcional foi confirmada por FT-IR (Figura 5) e 500 ^MHz 1H RMN (Figura 6). O FT-IR mostra o completo desaparecimento do a-OH de absorção larga cerca de 3.500 cm ^-1, indicando funcionalização quantitativa com o grupo CDNP. Isto também é confirmado pelo espectro de RMN mostrado na Figura 6. Usando a integração dos picos do espectro de RMN, foi determinado que o CDNP-PEO polímeros-P2MS-PEO-CDNP são quantitativamente funcionalizado.

Nanofibras

Na Figura 7, uma esteira de nanofibras condutoras obtidas por electrospinning CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / poliestireno / SWCNT de clorobenzeno é shprópria. Imagens confocais obtidos mostraram que a proteína de IgE liga-se com o DNP sobre a superfície da fibra. ³ Esta é uma indicação da especificidade de ligação do electrospun DNP-polímeros para com o anticorpo IgE. A intensidade da luz é um indicador da presença de IgE nas nanofibras como a proteína é fluorescente etiquetado.

A Figura 8a é uma imagem AFM (microscópio de força atómica) de uma das nanofibras, obtidos por este processo e A Figura 8b mostra a dimensão deste nanofibras em particular é cerca de 150 nm de diâmetro. Por este processo fibras entre 100-700 nm são obtidos. Neste momento atual é um desafio para preparar fibras com uma dimensão específica. Isto é consistente com o que é observado por outros grupos. ⁴ Figura 9 mostra imagens de SEM de CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / poliestireno / SWCNT nanofibras e o diâmetro das nanofibras estavam entre 200 nm a 300 nm. Existem três SEM imagens de nanofibers mostrado em diferentes ampliações. Estudo das três imagens mostra as morfologias das fibras são lineares e frisado. O objetivo geral é o de preparar as fibras que são na sua maioria linear. Figura 10 mostra o gráfico IV de esteiras de nanofibras preparados a partir de CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / poliestireno / SWCNT. O gráfico mostra o comportamento de um resistor (ôhmica). Quando o antigénio é ligado aos nanofibras, esperamos ver uma mudança no comportamento IV da esteira de fibras, como esta mudança na resistência é uma característica que sugere que as fibras funcionais têm aplicação potencial como o componente activo em sensores para a detecção de moléculas isoladas .

Figura 1. Reactor de polimerização para a síntese do α, polímero ω-dihydroxyl. A) O ponto de injeção de nitrogênio para o fluxo de gás UHP. B.) O ponto de injecção para o solvente, iniciador de monómero, e. C) O navio de reação.

Figura 2. Instalação utilizada para electrospinning usando um Glassman fonte de alta tensão.

Figura 3. Configuração usada para medir parcelas IV com um Sub-femtoamp remoto SourceMeter (Keithley).

Figura 4. Uma abordagem). Sintética para a preparação de OH-PEO-P2MS-PEO-OH polímeros. B) Funcionalização de α, ω-di-hidroxi [poli (óxido de etileno)-b-poli (2-metoxiestireno)-b-poli (óxido de etileno)].

Figura 5. Espectros FT-IR de (A) OH-PEO-P2MS-PEO-OH, precursor CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP e (B) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.

Figura 6. RMN de protão de 500 MHz de CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.

Figura 7. Uma imagem) A ligação de FITC-IgE com electrospun fibras CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP de clorobenzeno. B) imagem do microscópio confocal do controle (nanofibras com IgG).

Figura 8. A) imagem de AFM electrospun Fibers CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP de clorobenzeno e B) perfil de dimensão AFM ou seja, de uma fibra mostrada na Figura 5a.

Figura 9. MEV de CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / poliestireno / SWCNT nanofibras.

Figura 10. IV trama dos tapetes de nanofibras preparados a partir de CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / poliestireno / SWCNT.

Discussão

Neste relatório, nós apresentamos uma abordagem poderosa para preparar nanofibras biofuncionais. As nanofibras são decorados com um grupo funcional que é específico para uma proteína modelo. O procedimento e abordagem relatado nesta comunicação é de natureza geral e pode ser utilizado para preparar nanofibras decorados com qualquer grupo funcional desejado. A polimerização viva aniónico é poderoso método para sintetizar estruturas poliméricas controladas covalentemente ligados a qualquer número de grupos...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Metal de sódio	Sigma-Aldrich	282065
Benzofenona	Sigma-Aldrich	239852
2-metoxiestireno	Sigma-Aldrich	563064
Tetrahidrofurano	Sigma-Aldrich	178810
Clorobenzeno	Sigma-Aldrich	319996
Solteiro CNT paredes	Sigma-Aldrich	704113
Poliestireno	Sigma-Aldrich	81416
Wafers de silício	Silício da Quest Int'l	720200
Zeiss FESEM	Carl Zeiss Inc.	Ultra 60
Probestation com Bausch & Lomb MicroZoom II Microscópio de Alto Desempenho	Bausch e Lomb
Leica sistema de digitalização confocal	Leica Microsystems	TCS SP2
Sub-femtoamp SourceMeter remoto	Keithley Instruments	6430
Autoranging multímetro digital	Keithley Instruments	175A
Bomba de seringa	Chemyx Inc.	Fusão 200
Zeiss Microscópio Óptico	Carl Zeiss Inc.	Zeiss / Axiotech