LabVIEW operado Osmometer nanolitro Novel de Investigações de gelo ligação às proteínas

Resumo

Proteínas de ligação de gelo (IBPS), também conhecidas como proteínas anticongelantes, inibir o crescimento do gelo e são um aditivo promissor para uso na criopreservação de tecidos. A principal ferramenta utilizada para investigar IBPS é o osmómetro nanolitro. Nós desenvolvemos uma casa projetada fase de arrefecimento montado em um microscópio óptico e controlados usando uma custom-built rotina LabVIEW. O osmómetro nanolitro descrito aqui manipulado a temperatura da amostra de forma ultra-sensíveis.

Resumo

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish¹, plants^{2, 3}, arthropods^{4, 5}, fungi⁶, and bacteria⁷. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested^8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears¹¹, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 °C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.

We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously^{9, 10}, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.

To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)¹². This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies' group (Queens University)¹⁰. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs^{5, 13}. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations^{14, 15}. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber¹³. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere¹⁶.

The Cold Stage System

The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 μm in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Protocolo

0. Procedimentos preliminares

1. Capilar de vidro para injectáveis ​​solução. Usando um extrator capilar (Narishige, Tóquio, Japão), preparar uma pipeta afiada com uma abertura fina a partir de um tubo capilar de vidro micro (Marca GMBH, Wertheim, Alemanha). O tamanho da abertura deve ser verificada por passagem de ar através do capilar para obter borbulhante fina em água limpa. Se o capilar é fechado, então pode-se abri-lo por quebrar sua borda. Isto pode ser feito por prensagem ou arranhar o suavemente contra a água contendo paredes do tubo. Prepare o capilar tal que a abertura está quase bloqueada, mas é suficientemente aberta para permitir a formação de sub-milímetros bolhas.
2. Limpeza de cobre disco. Sonicar os discos de cobre durante 10 min em 0,1% de Micro-90 sabão (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, EUA), depois lava-se com água duplamente destilada. Introduzir os discos em uma solução de isopropanol (técnico) e sonicar novamente durante 10 min. Barbatanaaliado, seque os discos usando ar filtrado. Esta fase de limpeza é crítico para evitar a contaminação entre IBP experimentos.
3. De camada dupla montagem lamela. A montagem lamela foi preparada para permitir a observação da amostra sem condensação de humidade sobre a superfície do vidro de cobertura. Isto foi conseguido através da colocação de uma partícula de Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, EUA), (2 mm de diâmetro) entre duas lamelas, que foram, em seguida, colados com uma pistola de cola quente. Esta configuração impedido condensação que poderia bloquear a vista quando a amostra foi arrefecida a baixa temperatura e elimina a necessidade de soprar ar seco para a janela de observação.

1. Estágio de resfriamento Set-up

1. Ligue a entrada do fluxo de água e de saída da fase de arrefecimento a 4 mm de diâmetro interno Tygon tubos (Saint-Gobain, Paris, França), e ligar o tubo de entrada de água do fluxo de uma bomba de água.
2. Ligar um tubo Tygon 4 milímetros de diâmetro interno para a entrada da etapa de arrefecimento tó fornecer ar seco. O ar foi seco utilizando uma coluna de linha Drierite.
3. Operar as bombas de ar e água. Note-se que os elementos de resfriamento não deve ser executado sem um dissipador de calor.
4. Ligue o controlador de temperatura, câmera e rotineira LabVIEW.

2. Preparação da Amostra

1. Colocar uma gota 3-4 ul de imersão em óleo B (laboratórios Cargille, Cedar Grove, New Jersey, EUA), no lado de trás de um disco de 7 mm de diâmetro de cobre com 500 furos perfurados uM através do disco.
2. Posicionar o disco de cobre na fase de arrefecimento, com o lado voltado para baixo de imersão em óleo.
3. Ligar o tubo capilar (a ponta chanfrada) para um tubo de 0,7 milímetros Tygon diâmetro interno ligada na outra extremidade a uma seringa de vidro de 2 ml (Poulten-Graf, Wertheim, Alemanha).
4. Antes de utilizar o tubo capilar, verificar a pequena abertura do capilar de forma que a abertura é um tamanho apropriado (ver os procedimentos preliminares).
5. Insira lentamente o glass capilar para o tubo de amostra preparada IBP proteína (2,4 uM Mp IBP-GFP em 20 mM de CaCl ₂ e 25 mM Tris-HCl a pH 8, ver referência ¹⁰ para os pormenores de preparação) e puxar a seringa de vidro até que o capilar de vidro contém 0,1 ul da solução de proteína.
6. Iniciar a gravação de vídeo através do software LabVIEW.
7. Inserir a ponta afiada do capilar de vidro (contendo a solução de proteína) em um dos furos do disco de cobre na fase de arrefecimento.
8. Enquanto observa através do microscópio (Olympus, Tokyo, Japan, objectiva 10x), cuidadosamente penetrar a camada de óleo de imersão com a ponta capilar de vidro, e pressionar a seringa de vidro (muito delicadamente) para entregar uma pequena quantidade (~ 10 nl) da proteína solução para criar uma gotícula uM 200.
9. Cobrir o furo na fase de arrefecimento, com a montagem de dupla camada lamela (ver os procedimentos preliminares).

3. Medição de Actividade TH

1. Préss botão do arrefecimento e ajustar a temperatura a -40 ° C.
2. Inicialmente, a gota de solução será clara. A baixas temperaturas, tipicamente na gama de -30 ° C a -35 ° C, gota a muda de cor, indicando que a solução tenha sido congelada. Imediatamente após a amostra ter congelado, aumentar a temperatura lentamente até que o gelo começa a derreter a granel. Um aumento gradual da temperatura é necessária para evitar a ultrapassagem da temperatura que pode resultar na fusão completa da amostra.
3. Mudar para um objectivo de 50x e começar a derreter o gelo, ajustando a temperatura. Este ajuste é interativo, e os passos finais são normalmente realizadas utilizando medidas de temperatura de pequenas 0,002 ° C. Continuar a fundir antes de um único cristal permanece. O tamanho final do cristal deve ser cerca de 10 um. A temperatura mais alta à qual tenha cessado de fusão é determinado como sendo o ponto de fusão e é determinado com precisão na fase posterior análise vídeo.
4. Ajustar a temperatura para alguns centésimos de um grau Celsius abaixo do ponto de fusão do cristal e começar uma rampa de temperatura com um atraso de 10 minutos. Ajuste a velocidade de rampa, como desejado. Durante este tempo, o cristal será exposto aos IBPS.
5. Após a conclusão do período de exposição de 10 min, a temperatura diminui automaticamente sob o controlo de rotina de LabVIEW.
6. Observar a forma dos cristais à medida que diminui a temperatura. Em algum momento, a súbita explosão de cristal de gelo pode ser observado. A temperatura à qual ocorre esta é conhecida como a temperatura de ruptura do cristal.
7. Usar a análise de vídeo para determinar o ponto de fusão preciso e a temperatura de ruptura. Primeiro, por meio de análise de vídeo, encontrar o ponto de fusão precisa. Recorde-se que a mais alta temperatura a que tenha deixado de fusão é determinado como sendo o ponto de fusão. Documentar este ponto de fusão, em um programa de planilha. Em seguida, determinar a temperatura de ruptura precisa de cristal, e documentar este valortambém. A diferença entre o ponto de fusão e o ponto de congelação, temperatura de ruptura ou de cristal, é a actividade de histerese térmica da solução de IBP.

4. Medição da Actividade TH tempo-dependente

1. Seguir o protocolo descrito nas Secções 3,1-3,3 para preparar um único cristal de gelo.
2. Após a formação do cristal, ajustar o tempo de retardamento da rampa conforme desejado, e ligar a rampa.
3. A temperatura irá diminuir a uma taxa fixa (de acordo com os requisitos dos operadores) automaticamente uma vez que o tempo de atraso de rampa passou.
4. Documentar a temperatura a que ocorre a ruptura de cristal. Calcula-se o tempo de exposição (o tempo entre a formação de cristais e do impulso de cristal).
5. Repita a experiência para vários tempos de atraso e representar graficamente a actividade TH como uma função do tempo de exposição para avaliar a dependência do tempo da actividade TH.

Resultados

A medição do tempo de dependência TH

O LabVIEW operado osmómetro nanolitro facilita o desempenho de medições precisas de atividade TH. A taxa de redução da temperatura constante permitiu a medição da dependência do tempo TH. O controle preciso da temperatura activado pelo osmómetro nanolitro era crucial para estas experiências. O tempo de exposição de um cristal de gelo para os IBPS em solução é definido como o período de tempo desde a formação do cristal (no final do processo de fusão) até que o crescimento súbito de gelo em volta do cristal (burst cristal). Nós descobrimos que o tempo de exposição dos cristais de gelo para os IBPS crucialmente afectaram a actividade TH. Períodos curtos de exposição ao IBP (alguns segundos), produzida uma actividade TH baixo na solução Mp IBP-GFP (2,4 mM) (Figura 5). A atividade TH aumentou com o tempo de exposição IBP até atingir um patamar de 4 minutos de exposição IBP. A concentrações mais elevadas do IBP, a placaau foi alcançado em menor tempo.

Figura 1. IBPS diagrama esquemático que ilustra adsorvido em gelo. Aprovada com a permissão de ^10.

Figura 2. A fase de arrefecimento. A) Ligação a tubos no microscópio. B) Sem ligação superior. C) Diagrama esquemático.

Figura 3. Screenshot da interface do LabVIEW. ClIck aqui para ver maior figura.

Figura 4. Gráfico a estabilidade da temperatura. O controlador de temperatura foi ajustado para diminuir a temperatura de 0.01 ° C a cada 15 segundos.

Figura 5. Mp actividade TH IBP como uma função do tempo de exposição de cristal de gelo com as IBPS. Cada ponto de tempo é a média de 3-6 experiências.

Discussão

Este trabalho demonstra o funcionamento de um osmómetro nanolitro, controlado por computador, que permite medições precisas da actividade TH com controlo de temperatura excepcional. Em qualquer sistema sensível à temperatura, gradientes de temperatura indesejáveis ​​devem ser evitadas. Para evitar gradientes de temperatura no aparelho aqui apresentado, a gota de solução de teste deve ser posicionada no centro de um furo na fase de arrefecimento de cobre do disco (passo 2.7). Além disso, o cristal único deve estar no centro da gota em vez de junto das extremidades (na maioria dos casos, isto irá acontecer espontaneamente). A dependência do tempo descrito indica que a taxa de arrefecimento pode influenciar as leituras TH. Assim, sugere-se que inclua um relatório de tempo durante o qual o cristal foi exposta à solução antes do arrefecimento, assim como a velocidade de arrefecimento. Nós normalmente esperado 10 min antes da rampa para baixo a temperatura de 0.01 ° C passos cada sec 4.

Os co LabVIEW controladosfase oling foi adaptado para utilização com um microscópio invertido no qual os dispositivos microfluidicos podem ser termicamente manipulado. Este sistema facilita a realização de experimentos solução de intercâmbio de cristais de gelo e IBPS marcados com eGFP ^{9, 10, 16.} O sistema LabVIEW-controlada pode ser adaptado a uma fase Clifton, ligando o controlador de temperatura de 3040 através de um circuito de adaptação designada eléctrico. Tal sistema é operado no laboratório Davies ^17. O software LabVIEW ea designada projeto de circuito elétrico adaptação para o palco Clifton estão disponíveis mediante solicitação.

Em conclusão, nós descrevemos um osmómetro nanolitro, que facilita o controlo sensível e manipulação de temperatura e a taxa de aumento de temperatura e diminuição (0,002 com sensibilidade ° C), coordenado com uma interface de vídeo através de uma rotina de LabVIEW para análise em tempo real. Este sistema pode realizar reprodutíveis taxa controlada experiências que são important para investigar a cinética de interações IBP com gelo. Tais experiências podem resolver vários longo debatidas questões que envolvem o mecanismo de ação do IBPS.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome	Companhia	Número de catálogo / modelo	Comentários
Imersão em óleo Tipo B	Cargille Laboratories	16484
Drierite	WA Hammond Drierite	043063 2270g
Micro solução de limpeza 90	Cole-Parmer	EW-18100-11
Capilar extrator	Narishige	PB-7
Tubos capilares de vidro	Marca GnbH Pessoa	7493 21	75 mm, 1,15 Diâmetro
Temperaturacontrolador	Newport, Irvine, Califórnia, Estados Unidos	Modelo 3040	Modelo 3040
Microscópio óptico	Olimpo	Modelo BH2
Objetiva de 10x	Olimpo		Plano S 10, 0.3, 160/0.17
Objetivo 50x	Nikon		CF plano, 50X/0.55 EPI ELWD
Câmera CCD	Provideo	CVC-140
Tubos de Tygon	Saint-Gobain, em Paris, França		Formulação Tubing Tygon S-50-HL
Seringa de vidro (2 ml)	Poulten-Graf, Wertheim, Alemanha	7 10227
GPIB-PCI	National Instruments, Austin, Texas, EUA	778032-01
Vídeo quadro grabber IMAQ-PCI-1407	National Instruments, Austin, Texas, EUA	322156B-01
LabVIEW Software System Design	National Instruments, Austin, Texas, EUA	Versão 8
O software DivX Autor	Divx LLC, San Diego, CA, EUA