Um Ensaio Galvanotaxis para Análise de Precursores Neurais Cinética migração celular em um campo aplicado externamente Corrente Contínua Elétrica

Resumo

Neste protocolo demonstramos como construir câmaras personalizados que permitem a aplicação de um campo elétrico de corrente contínua para permitir lapso de tempo de imagem do cérebro adulto derivado translocação de células neurais precursor durante galvanotaxis.

Resumo

A descoberta de haste neural e células progenitoras (colectivamente denominadas células precursoras neurais) (NPCs) no cérebro de mamíferos adultos tem levado a um corpo da investigação sobre a utilização das propriedades multipotentes e proliferativa destas células para o desenvolvimento de estratégias neuroregenerative. Uma etapa essencial para o sucesso de tais estratégias é a mobilização de NPCs para um local da lesão após transplante exógena ou para aumentar a resposta dos precursores endógenos, que são encontradas na região periventricular do SNC. Assim, é essencial para compreender os mecanismos que promovem, orientar e melhorar a migração NPC. O nosso trabalho centra-se na utilização de corrente contínua de campos elétricos (dcEFs) para promover e migração NPC direta - um fenômeno conhecido como galvanotaxis. Endógenos fisiológicos campos elétricos funcionam como pistas fundamentais para a migração de células durante o desenvolvimento normal e da cicatrização. Perturbação farmacológica dotrans-neural potencial tubo em embriões axolotl provoca graves malformações do desenvolvimento ^1. No contexto da cicatrização de feridas, a taxa de reparação de córnea ferida está directamente correlacionada com a magnitude do potencial epitelial que surge após a lesão, como mostrado pela melhoria farmacológica ou ruptura dessa dcEF ^2-3. Nós demonstramos que o adulto NPCs subependimários sofrer rápida e dirigido migração catódica in vitro quando exposto a uma dcEF aplicado externamente. Neste protocolo, descrevemos nossas técnicas de laboratório para a criação de um ensaio galvanotaxis simples e eficaz para alta resolução, longo prazo de observação de translocação dirigido célula do corpo (migração) em um nível de uma única célula. Este ensaio seria adequado para investigar os mecanismos que regulam a transdução dcEF em motilidade celular através da utilização de ratinhos transgénicos ou knockout, curtas de ARN de interferência, ou agonistas / antagonistas de receptores específicos.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem manipulação de animais foram aprovados pela Universidade de Toronto Comitê Animal Care, de acordo com as diretrizes institucionais (protocolo no. 20009387). Os métodos que se seguem devem ser realizados utilizando ferramentas e técnicas estéreis, numa câmara de fluxo laminar, onde aplicável.

No texto do protocolo a seguir, a frase "EFH-SFM" refere-se a meio isento de soro suplementado com factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento de fibroblastos básico e heparina. EFH-SFM é usado quando a investigar o galvanotaxis de NPCs indiferenciadas, porque esses mitógenos manter NPCs em sua ⁴ estado indiferenciado. Ao investigar a galvanotaxis de NPCs induzidas a diferenciar-se em tipos de células maduras, "FBS-SFM" refere-se a meio isento de soro suplementado com 1% de soro fetal bovino. FBS promove a diferenciação de maduras NPCs em fenótipos neurais ^5.

1. Isolamento e Cultura de precursores neurais (Nãomostrado em video)

1. Anestesiar um rato CD1 (6-8 semanas de idade) com isofluorano e sacrifício através de deslocamento cervical.
2. Extinguir a cabeça em etanol a 70% e decapitar o animal com tesouras de dissecação afiadas.
3. Enquanto mantém a cabeça com pinça cirúrgica, remover a pele na superfície dorsal para expor o crânio.
4. Usando um bisturi e não. Lâmina 11, marcar o crânio no seio frontal ao longo do eixo mediolateral, e também ao longo da sutura sagital na direcção rostrocaudal.
5. Descasque os ossos parietais de distância da cabeça com nenhum. 7 pinças curvas, tendo cuidado para não furar o tecido cerebral.
6. Insira uma espátula fina embaixo do cérebro a partir de debaixo do cerebelo e avançando para os bulbos olfatórios. Enquanto segurando o crânio no lugar com uma pinça, puxe o cérebro do crânio e imediatamente colocá-lo na gelada líquido cefalorraquidiano artificial (veja receitas abaixo).
7. Sob um microscópio de dissecação, utilizando estériltesouras e pinças de dissecção cortar o cérebro de meia ao longo da linha média. Rodar cada hemisfério, de modo que a superfície (cut) medial virado para cima.
8. Selecione um hemisfério, e com a superfície medial voltada para cima, localize o esplênio do corpo caloso (região posterior do corpo caloso).
9. Fazer uma incisão da superfície do córtex do esplênio do corpo caloso ao longo do eixo dorsoventral.
10. Descasque o córtex incisão em direção ao bulbo olfativo para expor as paredes medial e lateral do ventrículo lateral.
11. Girar o hemisfério, de modo que a superfície dorsal virada para cima, e usar microtesoura curvadas para cortar e recolher as paredes expostas medial e lateral, que contêm a região periventricular onde residem NPCs ^6.
12. Repita os passos 1,8-1,11 para o outro hemisfério.
13. Pipetar a tecido isolado em 7 ml de solução de tripsina (ver receita abaixo) num tubo de 15 cc, e colocar o tubo sobre um balancim de 37 ° Cincubadora durante 25 min.
14. Centrifuga-se o tubo a 1500 rpm durante 5 min, o sobrenadante aspirado, e ressuspender o tecido em 2 ml de solução de inibidor de tripsina (ver receita abaixo).
15. Tritura-se o tecido suavemente com um pequeno furo de pipetas de Pasteur 30-50 vezes com cuidado para evitar bolhas de ar.
16. Centrifuga-se o tubo a 1500 rpm durante 5 min, o sobrenadante aspirado, e ressuspender em 1-2 ml de SFM (ver receita abaixo) por trituração do pellet 3-5 vezes.
17. Centrifuga-se o tubo a 1500 rpm durante 3 minutos, aspirar o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de SFM + EFH.
18. Conte viver a densidade celular com um hemocitómetro e as células da placa num frasco de cultura T25, a uma densidade de 10 células por uL de SFM + EFH.
19. Permitir que a cultura a crescer durante 7 dias não perturbadas para render flutuantes neuroesferas primárias compostas por NPCs.

2. Galvanotaxis Preparação Câmara

1. Coloque 3 de vidro quadrado não. 1 lamelas (22 x 22 x 0,17) ind garrafa de 6N de ácido clorídrico durante a noite.
2. No dia seguinte, utilizar uma ponta de diamante, cortador de vidro para cortar seis tiras rectangulares (22 x 5 x 0,17 mm) de vidro a partir de qualquer quadrado. 1 lamínulas.
3. Transfira os deslizamentos lavado com ácido quadrados e retangulares deslizamentos em uma capela de fluxo laminar. Lave as tiras rectangulares e quadradas, primeiro com etanol 70%, em seguida com água de cultura de tecidos de grau autoclavado, e deixa-se secar numa Kim Wipe (para esterilidade adicionado, o vidro pode ser permitido para o ar seco).
4. Aplique graxa de vácuo para o perímetro de uma superfície das lâminas de vidro quadrados, e vedá-las à base de 60 mm pratos de Petri de plástico.
5. Aplique graxa de vácuo ao longo do eixo longo de uma superfície das tiras de vidro rectangulares e selá-los às arestas opostas das lâminas de vidro quadrados (de tal forma que elas fiquem paralelas umas às outras), a fim de criar uma calha central.
6. UV-esterilizar as câmaras durante pelo menos 15 min no fluxo laminar.
7. Pipetar 250-300 ul de poli-L-Lysine para a calha central das câmaras e incubar à temperatura ambiente durante 2 horas.
8. Aproximadamente 15 minutos antes do final do período de incubação, a preparação da solução de Matrigel (ver receita abaixo).
9. Aspirar o poli-L-lisina, lave as calhas centrais com 1 ml de água esterilizada, e uL de solução da pipeta 250-300 Matrigel para as calhas centrais.
10. Incubar as câmaras, a 37 ° C durante 1 h.
11. Aspirar a solução Matrigel e lavar cuidadosamente as calhas centrais com 1-2 ml de SFM.
12. Pipetar 100 mL de EFH-SFM ou FBS-SFM para as calhas centrais e transferir as câmaras galvanotaxis para o palco de um microscópio de contagem.
13. Pipetar 3-4 ml da cultura neuroesfera contendo em uma placa de Petri de 60 mm e transferir a placa de Petri, para o estágio de microscópio de contagem.
14. Se a um objectivo de visualização de 5x, utilizar uma pipeta para transferir P10 5-8 neuroesferas inteiras (até quatro de cada vez) na calha central de cada galvanotaxiscâmara sem dissociar-los, e cuidadosamente espalhado as neuroesferas redor da calha central, sem perturbar o substrato Matrigel.
15. Adicionar um adicional de 150-200 ul EFH-SFM ou FBS-SFM para as calhas centrais.
16. Transferir as câmaras galvanotaxis em um de 37 ° C, 5% CO _2, 100% incubadora humidificada durante 17-20 h (se analisar NPCs indiferenciadas) para permitir que as neuroesferas a aderir ao substrato de Matrigel e dissociam-se em células individuais, como mostrado na Figura 1 . Se a análise de NPCs diferenciados, o período de incubação deve ser alargado para 69-72 horas para permitir a diferenciação das células.

3. Viver imagens de células Time-Lapse

1. Permitir que o sistema de imagens ao vivo de células para equilibrar a 37 ° C, 5% CO ₂ durante um período mínimo de 30 min antes do início da gravação de lapso de tempo.
2. Corte dois pedaços de 12 cm de 1 mm de diâmetro prata fio da bobina, eles de um lado, e colocá-los em Clorox blixiviação durante 20 minutos de modo a formar de Ag / AgCl.
3. Transferir as câmaras galvanotaxis para a plataforma de um microscópio de contagem e seleccionar que câmara irá ser utilizada para a análise de células live-migração de imagem com base nos seguintes critérios: i) as neuroesferas deve ser quase completamente dissociado em células individuais e, ii) as células devem possuir morfologias redondas com pouco ou nenhum processo que se estende dos corpos celulares.
4. Transferir a câmara galvanotaxis seleccionado numa câmara de fluxo laminar, em conjunto com um qualquer quadrado separado. Uma lamínula de vidro e graxa de vácuo.
5. Lava-se a tampa desliza em primeiro lugar com 70% de etanol, em seguida, em água esterilizada, e aplicar uma tira de massa lubrificante de vácuo sobre dois bordos paralelos da lâmina de cobertura.
6. Aspirar o meio de cultura a partir da calha central da câmara, em seguida, rapidamente colocar a lâmina de cobertura (graxa lado voltado para baixo) para a câmara de tal modo que a gordura restante nas duas tiras paralelas tiras de vidro rectangulares, criando efectivamente um telhadopara a câmara.
7. Pipetar 100 mL de fresco EFH-SFM ou FBS-SFM na calha central através de ação capilar.
8. Use graxa de vácuo para criar bordas de piscinas de meios de cultura em cada extremidade da calha central, como mostrado na Figura 2.
9. Cortar duas peças 15 cm de tubo de PVC, e com uma seringa de 10 cc com uma agulha de calibre 18 para injectar a solução de agarose cuidadosamente no tubo, garantindo não formar bolhas no interior dos tubos, e permitir que o gel solidificar durante 5 min.
10. Transferir a câmara galvanotaxis ao sistema vivo de células de imagem, juntamente com o gel de agarose a tubos, Ag / AgCl, e um par de vazios 60 pratos de Petri milímetros que serão utilizados como meios de cultura reservatórios e irá conter o Ag / AgCl. Permitir que a câmara galvanotaxis para descansar dentro do 37 ° C, 5% CO ₂ ambiente durante 20-30 min.
11. Durante este tempo, preparar as tampas dos dois pratos de Petri vazias e da tampa da caixa de Petri a câmara de galvanotaxis por furos de perfuraçãoneles com uma ferramenta Dremel ou semelhante, como mostrado na Figura 3.
12. Pipetar 1-1,5 ml de EFH-SFM ou FBS-SFM para um ou outro lado da calha central, e 7-8 ml de SFM em cada placa de Petri vazia. Coloque uma placa de Petri em cada lado da calha central da câmara e galvanotaxis lugar um eléctrodo de Ag / AgCl em cada prato. Ponte o espaço entre a câmara de galvanotaxis e as placas de Petri para estabelecer a continuidade eléctrica com as pontes de gel de agarose, como se mostra na Figura 4.
13. Conectar os eletrodos de Ag / AgCl a uma fonte de alimentação externa, com um amperímetro em série para medir a corrente elétrica e ligue a fonte de alimentação. Use um voltímetro para medir a força do campo eléctrico em frente da calha central, e ajustar a saída da fonte de alimentação até que a intensidade do campo eléctrico desejado é alcançado (os ensaios realizados neste laboratório utilizam uma força dcEF de 250 mV / mm com corrente eléctrica entre 1 e 1,5 mA).
14. Iniciativate módulo do lapso de tempo no sistema de célula de imagem ao vivo, e permitir que o experimento de correr para a quantidade de tempo desejada. Após a conclusão do ensaio, as células de fixação em paraformaldeído a 4%, para análise de imunomarcação padrão.

Resultados

A análise cinemática revela que, na presença de um 250 dcEF mV / mm, NPCs indiferenciadas exibem galvanotaxis altamente dirigidos e rápida para o cátodo (Figura 5A, Movie 1). Na ausência de um dcEF, o movimento aleatório das células é observada (Figura 5B, Movie 2). Neste intensidade de campo,> 98% de NPCs indiferenciadas migrar para o 6-8 hr inteiro para o qual são gravadas, e uma vez que as células mortas não migram isto sugere que eles permaneçam viáveis ​​durant...

Discussão

Este protocolo foi adaptado a partir de métodos bem estabelecidos de estudos anteriores ^7-9. Galvanotactic câmaras podem ser construídas utilizando uma variedade de técnicas diferentes, incluindo a construção de um poço de vidro separada para confinamento de sementeira de células, ou utilizando a ablação por laser de CO ₂ para a microfabricação da calha central, ^10,11. Algumas técnicas podem ser mais laboriosa ou dispendiosa do que outros. Nós descrevemos um ensaio simples ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do item	Companhia	Número de catálogo	Comentários
			Isolamento Celular Neural Precursor
2M NaCl	Sigma	S5886	11,688 g dissolvido em 100 ml de dH2O
1M KCl	Sigma	P5405	7,456 g dissolvido em 100 ml de dH2O
1M de MgCl2	Sigma	M2393	20,33 g dissolvido em 100 ml de dH2O
155 mM de NaHCO3	Sigma	S5761	1,302 g dissolvido em 100 ml de dH2O
Glicose 0,5 M	Sigma	G6152	9,01 g dissolvido em 100ml de dH2O
108 mM CaCl 2	Sigma	C7902	1,59 g dissolvido em 100 ml de dH2O
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15070
Tripsina de pâncreas bovino	Sigma	T1005
Sheep testículos hialuronidase	Sigma	H6254
Ácido quinurênico	Sigma	K3375
Ovomucóide inibidor de tripsina	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
Glucose 30%	Sigma	G6152
7,5% de NaHCO3	Sigma	S5761
HEPES 1M	Sigma	H3375	23,83 g dissolvido em 100 ml de dH2O
L-glutamina	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Reconstituir em 1 ml de mistura de hormona e alíquota em 20 unidades ul.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Reconstituir em 0,5 ml da mistura de hormona e alíquota em 20 unidades ul.
Heparina	Sigma	H3149
Apo-transferrina	R & D Systems	3188-AT	0,1 g dissolvido em 4 ml de dH 2 0
Putrescina	Sigma	P7505	Dissolver 9,61 mg em Apo-transferrina assimlução
Insulina	Sigma	I5500	Dissolver 25 mg em 0,5 ml de HCl 0,1 N e adicionar 3,5 ml de dH 2 0
Selênio	Sigma	S9133
Progesterona	Sigma	P6149
Ferramentas padrão de Dissecção	Belas Science Tools
Microscópio de dissecção	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis Preparação Câmara
Lâminas de vidro tampa quadrada	VWR	16004
Ácido clorídrico 6N	VWR	BDH3204-1
Graxa de alto vácuo	Dow Corning
60 milímetros placas de Petri	Fisher Scientific	0875713A
Poli-L-lisina	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Descongelar e alíquota em 150 unidades ul
FBS	Invitrogen	10082139	Só use se induzir a diferenciação NPC, caso contrário use SFM + meios de cultura EFH como indicado acima
Contando microscópio	Olimpo	CKX41
			Viver imagens de células Time-Lapse
Fio de prata	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Calor inatividadeated FBS	Sigma	16140071
Tubos de PVC	Fisher Scientific	80000006	3/32 "ID x 5/32" OD
Alvejante	Clorox
Seringa de 10 cc	BD	309604
Agulha de calibre 18	BD	305195
Broca Dremel	Dremel	Modelo 750
Microscópio invertido equipado com câmara, umidificado incubada	Zeiss	Axiovert-200M
			Receitas Item Volume 2M NaCl 6,2 ml 1M KCl 0,5 ml 1M de MgCl2 0,32 ml 155mm de NaHCO3 16,9 ml A glicose 1M 1 ml 108 mM CaCl 2 0,09256 ml Penicilina-estreptomicina 1 ml Água esterilizada 74 ml Líquido cefalorraquidiano artificial Item Volume ou massa Líquido cefalorraquidiano artificial 30 ml Tripsina de pâncreas bovino 40 mg Sheep testículos hialuronidase 22,8 mg Ácido quinurênico 5 mg Solução de tripsina Item Volume ou massa SFM 15 ml Ovomucóide inibidor de tripsina 10 mg Solução de tripsina Inhibitor Item Volume Água esterilizada 37 ml DMEM/F12 10X 10 ml Glucose 30% 2 ml 7,5% de NaHCO3 1,5 ml HEPES 1M 0,5 ml Transferrina, solução Putrescine 4 ml Solução a 25 mg de insulina 4 ml Selênio 100 e mu, L Progesterona 100 ul Mix hormona (100 ml no total loja, a -20 ° C) Item Volume Água esterilizada 37,5 ml DMEM/F12 10X (3:1) 5 ml Glucose 30% 1 ml 7,5% de NaHCO3 0,75 ml HEPES 1M 0,25 ml Mix de hormônio 5 ml L-glutamina 0,5 ml Penicilina-estreptomicina 0,5 ml O soro livre de mídia EFH-SFM: adicionar 10 ul de EGF, 10 | il de FGF, e 3,66 ul de Heparina FBS-SFM: adicionar 0,5 ml de FBS
Item	Volume
Matrigel	150 ul
SFM	3,6 ml

Item	Volume ou massa
UltraPure Agarose	300 mg em 10 ml de DDQ 2 0
SFM FBS inactivado pelo calor	8 ml 2 ml