Novo método de triagem para a evolução dirigida de enzimas termoestáveis ​​Bacteriolytic

Resumo

Um método de evolução dirigida novo específico para o domínio da engenharia termoestabilidade foi desenvolvido e, consequentemente, para as enzimas bacteriolytic validado. Depois de apenas uma rodada de mutagénese ao acaso, uma enzima evoluiu bacteriolytic, PlyC 29C3, exibido duas vezes maior do que a actividade residual quando comparada com a proteína de tipo selvagem, após incubação a temperatura elevada.

Resumo

Evolução dirigida é definida como um método para aproveitar a selecção natural, a fim de engendrar proteínas adquirir propriedades específicas que não estão associados com a proteína na natureza. A literatura tem fornecido numerosos exemplos sobre a implementação de evolução dirigida com sucesso alterar especificidade molecular e catálise ^1. A principal vantagem da utilização de evolução dirigida, em vez de mais racional abordagens para a engenharia molecular refere-se ao volume e diversidade de variantes que podem ser rastreados ^2. Uma possível aplicação de evolução dirigida envolve a melhoria da estabilidade estrutural de enzimas, tais como bacteriolytic endolysins. Bacteriófago codificar e expressar endolysins de hidrolisar uma ligação covalente crítico no peptidoglicano (ie parede celular) de bactérias, resultando na lise da célula hospedeira e libertação de viriões da progenia. Notavelmente, estas enzimas têm a capacidade de induzir a lise extrinsecamente à susceptibilidadeveis bactérias na ausência de fago e, além disso, têm sido validada tanto in vitro como in vivo para o seu potencial terapêutico ^3-5. O assunto do nosso estudo envolve a evolução dirigida endolysin PlyC, que é composta de subunidades PlyCB PlyCA e ^6. Quando purificada e adicionada extrinsecamente, a holoenzima PlyC lisa estreptococos do grupo A (GAS), assim como outros grupos de estreptococos em uma questão de segundos e, além disso, tem sido validado in vivo contra GAS ^7. Significativamente, a monitorização cinética enzimática residual após incubação a temperatura elevada fornece evidência nítida de que PlyC perde actividade lítica abruptamente a 45 ° C, o que sugere uma vida útil curta terapêutica, que pode limitar o desenvolvimento adicional desta enzima. Novos estudos revelam a falta de estabilidade térmica é observado apenas para a subunidade PlyCA, enquanto que a subunidade PlyCB é estável até ~ 90 ° C (observação não publicada). Além de PlyC, existem sárias exemplos na literatura que descrevem a natureza termolábil de endolysins. Por exemplo, o Staphylococcus aureus endolysin LysK e Streptococcus pneumoniae endolysins Cpl-1 e Pal perder actividade espontaneamente a 42 ° C, 43,5 ° C e 50,2 ° C, respectivamente ^8-10. De acordo com a equação de Arrhenius, que relaciona a velocidade de uma reacção química com a presente temperatura no sistema em particular, um aumento da estabilidade térmica irá correlacionar com um aumento da esperança de vida de prateleira ^11. Para este fim, a evolução dirigida foi demonstrado ser uma ferramenta útil para a alteração da actividade térmica de várias moléculas na natureza, mas nunca esta tecnologia particular foi explorada com sucesso para o estudo das enzimas bacteriolytic. Da mesma forma, as contas de sucesso de progredir a estabilidade estrutural desta classe específica de agentes antimicrobianos em conjunto são inexistentes. Neste vídeo, nós empregamos uma nova metodologia que utiliza um erro-pruma ADN polimerase, seguido por um processo de triagem optimizada utilizando um formato de placa de 96 bem de microtitulação para a identificação de mutações para a subunidade PlyCA do endolysin estreptocócica PlyC que se correlacionam com um aumento na estabilidade cinética enzimática (Figura 1). Resultados após apenas uma rodada de mutagénese aleatória sugerem a metodologia é gerar variantes PlyC que retêm mais do que duas vezes a actividade residual quando comparada à de tipo selvagem (WT) PlyC após tratamento a uma temperatura elevada.

Protocolo

1. Determinar Condições aquecimento ideal

Em primeiro lugar, deve-se determinar experimentalmente a temperatura de incubação e tempo óptimo para usar para a etapa de aquecimento no ensaio. Para o nosso modelo PlyC, é importante notar que a E. coli co-transformados com genes e plyCA plyCB em plasmídeos de expressão separados tem sido mostrado para formar a holoenzima totalmente funcional PlyC ^6. A preparação 96 da placa de microtitulação assim como as condições de crescimento celular e da técnica de revestimento subsequente réplica foram adaptados a partir de exemplos fornecidos na literatura ^12-16. Um tempo de incubação de 30 min será apropriado para este ensaio como os resultados anteriores a partir de experiências de inactivação térmica ditar uma rápida perda de actividade durante a incubação de curto prazo em ambientes superiores a temperatura fisiológica (observação não publicada). A temperatura de incubação ideal para PlyC foi elucidada através dos seguintes passos:

1. Transform a expressão construção pBAD24: plyCA (Amp ^r) na E. competente coli DH5cc pBAD33: plyCB (Cm ^r).
2. Placa dos transformantes numa placa de ágar Luria-Bertani (LB) suplementado com ampicilina (100 jig / ml) e cloranfenicol (35 mg / ml). Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.
3. Com um palito estéril, inocular uma colónia individual para cada fila de poços (Figura 2a) em 96 estéril, límpida, de fundo chato bem, com tampa de placas de microtitulação contendo 200 ul de meio LB suplementado com ampicilina e cloranfenicol.
4. Seguramente colocar a placa de microtitulação de 96 bem sobre a 37 ° C agitando incubadora e crescer as bactérias durante a noite a 300 rpm.
5. Recuperar o 96 da placa de microtitulação de 37 ° C a agitação incubadora e da placa de réplica para uma nova placa de microtitulação de 96 poços da seguinte forma:
   1. Adicionar 180 ul de meio LB suplementado com ampicilina e cloranfenicola cada poço da placa de réplica.
   2. Transferir 20 uL de bactérias a partir da placa original para os poços correspondentes na placa de réplica. Isso deve resultar em uma primeira OD ₆₀₀ de ~ 0,5.
6. Colocar a placa de forma segura sobre a réplica de 37 ° C agitando incubadora e incubar a placa durante 1 hora a 300 rpm, em seguida, adicionar o inductant. No caso dos sistemas de expressão pBAD, a arabinose inductant é de 0,25%. Outros sistemas de expressão podem exigir inductants diferentes. Colocar a placa de volta a 37 ° C agitando incubadora e agitação a 300 rpm durante uma hora adicional de 4 para permitir a expressão da proteína. Os níveis de expressão variam tipicamente entre 10-20 jag de PlyC.
7. Uma vez que a expressão da proteína concluiu, recuperar a placa de réplica e sedimentar as bactérias, colocando a 96 placa de microtitulação numa centrifugadora refrigerada que contém um rotor oscilante de balde que se encaixa 96 placas de microtitulação de poços. Centrifugar a 3000 rpm durante 10 min à temperatura ambiente.
8. Remover o sobrenadante mídia por lentamente invertendo a placa de microtitulação e gentilmente decantação da mídia.
9. Lisar as células por adição de 50 ul de B-PER Extraction Reagent II Bacterial Protein a cada poço. Incube a placa à temperatura ambiente durante 20 min.
10. Aumentar o volume de cada poço a 120 ul por adição de 70 ul de tampão fosfato salino (PBS) pH 7,2.
11. Pellet os detritos insolúveis por centrifugação celular a placa a 3000 rpm durante 10 min a 4 ° C na centrífuga refrigerada.
12. Transferir 110 uL do lisado bruto solúvel aos poços correspondentes de uma placa de 96 poços termociclador.
13. Usando 30 min como o tempo de incubação predeterminado, expor os lisados ​​solúveis actualmente residem na placa de 96 poços termociclador para uma ampla gama de gradiente de temperatura que mede 15-20 ° C. Note, o objetivo é determinar em que a temperatura de uma determinada enzima perde> atividade catalítica de 95%.
14. Após a incubação, incubar a 96 poçostermociclador placa a 4 ° C durante 5 minutos e 100 ul de transferir os lisados ​​solúveis a partir da placa de 96 poços termociclador para o local correspondente no poço 96 final bem placa de microtitulação.
15. Com um multipipettor 12 canais, adicionar 100 ul de tensão GAS D471 a cada poço. Note, D471 células são originalmente liofilizado a partir de culturas durante a noite e ressuspensos com PBS pH 7,2 para se obter uma DO ₆₀₀ de ~ 2,0.
16. Colocar imediatamente a placa de 96 poços no espectrofotómetro de microplacas e monitorizar a cinética da enzima medindo a OD _{600 a} cada 15 segundos durante 20 minutos. A incubação a temperatura mais baixa que correspondem a cavidades que não possuíam uma alteração na densidade óptica (ΔOD ≤ 0,1) é definida como a temperatura não permissiva.

Depois de um ecrã largo temperatura é realizado para identificar a temperatura não permissiva, os passos acima pode ser repetido ao longo de um intervalo mais estreito de temperaturas (5 ° -10 ° C) para elucidara temperatura não permissiva preciso para a enzima de interesse. Nota, a temperatura não permissiva identificadas neste ensaio pode ser diferente do que a temperatura de fusão elucidada por outros meios, devido a diferenças de volume, concentração, etc

2. Gerando a Biblioteca Mutant

A criação da biblioteca a ser rastreada mutante envolve incorporar mutações ao acaso por uma ADN-polimerase propensa a erros, com polarização de nucleótidos mínima no gene plyCA usando o GeneMorph II Kit mutagênese aleatória, como se segue:

1. Conceber iniciadores nucleotídicos a temperaturas de fusão semelhantes (T _m) entre 55-72 ° C, com os locais de restrição de escolha na extremidade 5 'e 3' do gene plyCA.
2. Uma vez que a taxa de mutação desejada é de 2-3 nucleótidos por plyCA (1,4 kb), utilizar os componentes da reacção de PCR concentrações, bem como as condições termociclador recomendadas pelo fabricante para baixo f mutaçãorequencies (0-4,5 por kb).
3. Clonar os genes mutagenizadas plyCA no vector de expressão pBAD24.
4. Transformar as construções em um DH5a: pBAD33 plyCB fundo e os transformantes de placas sobre placas de agar LB suplementado com ampicilina e cloranfenicol.
5. Além disso, transformar DH5a e placa pBAD33: plyCB com o vector de expressão de pBAD24 contendo o gene WT plyCA. As colónias da placa esta irá servir como os controlos durante a triagem.

3. 96 Preparação Placa Bem microtitulação e Condições de Crescimento Celular

1. Encher cada poço de uma placa de microtitulação de 96 poços com 200 ul de meio LB suplementado com ampicilina e cloranfenicol.
2. Seguindo o esquema de placas de microtitulação (Figura 2b), cuidadosamente seleccionar uma colónia individual a partir das placas de agar durante a noite com um palito esterilizado e inocular a bactéria designada no poço de microtitulação de 96 poços a plate. É essencial assegurar que somente uma colónia por poço é inoculado.
3. Agitar o ancorada 96 placa de microtitulação a 300 rpm durante a noite a 37 ° C.

4. Chapeamento réplica, Indução Protein Expression e Preparação Lysate

1. Siga os passos 1,5-1,11 da seção intitulada "Determinação das condições de aquecimento ideal", com uma modificação. Armazenar a placa original, a 4 ° C, após o passo de revestimento de réplica foi concluído.
2. Depois do passo 1.11, 110 ul de transferência do lisado bruto solúvel para as cavidades correspondentes de uma placa de 96 poços termociclador, excepto para o controle positivo poços A1-D1. No que respeita aos lisados ​​de controlo positivo (isto é, que não lisados ​​são aquecidas), 100 ul de transferência dos lisados ​​para as cavidades correspondentes de uma nova placa de microtitulação de 96 poços, que servirá como a placa de ensaio final para a experiência e armazenar em gelo.

5. Tratamento térmico solúvel Lysate

1. Aqueça o controlo negativo e mutante solúvel lisados ​​atualmente confinada no termociclador placa de 96 poços no termociclador durante 30 minutos à temperatura de incubação optimizado não permissiva determinado na etapa 1.
2. Após incubação não permissiva temperatura, incubar a placa de 96 termociclador bem a 4 ° C durante 5 min.
3. Transferir 100 uL dos lisados ​​solúveis a partir da placa de 96 poços termociclador aos seus locais idênticos bem na final placa de ensaio de 96 poços de microtitulação contendo já os lisados ​​de controlo positivo solúveis.
4. Com um multipipettor 12 canais, adicionar 100 ul de tensão GAS D471 a cada poço. Imediatamente colocar a placa no espectrofotómetro de microplacas.
5. Monitorizar a cinética da enzima medindo a OD _{600 a} cada 15 segundos durante 20 minutos.
   1. Uma variante com PlyC progrediu comportamento térmico é definido como uma construção que pode diminuir a densidade óptica original em 50 por cento, em menos de 900 segundos, notemperatura não permissiva. Além disso, os controlos positivos (isto é, não-aquecido, WT PlyC) necessário exibir actividade catalítica WT (t _1/2 ≤ 100 seg) e os controlos negativos (isto é aquecida, WT PlyC) deve ser desprovido de actividade.
6. Uma vez que uma variante com PlyC progrediu comportamento térmico é identificado, recuperar a placa original, armazenada a 4 ° C e bactérias inocule do indivíduo bem específico para o mutante de interesse em meio LB fresco suplementado com ampicilina e cloranfenicol. Crescer o inoculo durante a noite a 37 ° C.
7. Extrair e purificar ADN de plasmídeo a partir da cultura e, em seguida, submeter a sequenciação, a fim de identificar as mutações de nucleótidos que inferir um comportamento térmico melhorado para PlyCA. Além disso, o complemento de uma pequena alíquota da cultura durante a noite, com glicerol a 10% e armazenar a -80 ° C para posterior utilização.

Resultados

Na conclusão do primeiro turno de mutagênese aleatória, mais de 6.000 mutantes PlyC foram rastreados e um total de 35 mutantes com potencial aumento comportamento térmico foram identificados, selecionados e seqüenciados. Análise genómica, resumidos na Tabela I, sugere que os 35 candidatos, 7 das construções continham sequências WT PlyCA ao nível da tradução, o que corresponde a falsos positivos identificados pelo ensaio. Dos restantes 28 candidatos, a gama de mutação foi de 1 a 6 mutações de nucleótidos com uma taxa de mutação média, 2,75 nucleótidos por plyCA gene, que estava na gama de 2-3 mutação nucleotídica que foram alvo. Ao nível da tradução, esta gama de mutação específica de nucleótidos e de frequência produziu uma gama mutação de aminoácidos de 1 a 5 aminoácidos, com uma taxa média de 1,9 mutação mutações de aminoácidos por PlyCA polipeptídeo.

Dos 28 candidatos com pelo menos um aminoácido Mutation, quatro destas construções mutantes foram aleatoriamente escolhidos para caracterização adicional para validar que o processo de rastreio extenso da metodologia de evolução dirigida foi de facto a funcionar correctamente. As enzimas mutantes foram purificadas PlyC a> 95% de homogeneidade com base em SDS-PAGE, conforme descrito anteriormente ^6-7. Cinética enzimática de WT PlyC e cada um dos quatro mutantes PlyC foram caracterizados em concentrações molares iguais, após incubação das enzimas purificadas de diferentes temperaturas elevadas. A actividade foi monitorizada após a adição de D471 GAS, medindo a densidade óptica a 600 nm a cada 15 seg durante 20 min. A actividade foi definida como a velocidade máxima da enzima residual após incubação de calor. Dos quatro candidatos seleccionados aleatoriamente para posterior caracterização, mutante 29C3 mostrou a maior parte do comportamento melhorado térmica. O comportamento térmico de WT PlyC e 29C3, foi investigada a diferentes temperaturas durante a incubação e de ensaio para a actividade em PBS pH 7,2 a80 nM e 40 nM, respectivamente concentrações. As experiências 45-50 ° C de incubação (Figura 3) foram realizadas num termociclador, onde as amostras foram incubadas em uma placa de parede fina termociclador 96 poço num volume total de 120 ul. A 35 ° C, 40 ° C e 45 ° C experiências de incubação (Figura 4 e 5) foram realizadas num bloco de aquecimento em que as amostras foram incubadas num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml num volume total de 1,3 ml. Todos os experimentos foram realizados em triplicado.

WT PlyC e 29C3 mostrou nenhuma diferença significativa na estabilidade cinética à temperatura ambiente (25 ° C), como descrito no primeiro conjunto de barras na Figura 3. No entanto, depois de uma incubação de curta duração, durante 30 min a partir de temperaturas que variam entre 45-50 ° C, a actividade de 29C3 foi substancialmente maior do que a actividade específica para o WT construir em cada ponto de temperatura. Por exemplo, o WT PlyC apresentado uma perda de 44% na actividade de 45,2° C ao passo que 29C3 mostrou uma perda de apenas 2% da actividade na mesma temperatura.

Estudos a longo prazo de incubação, comparando a actividade residual de ambos WT PlyC e 29C3 foram adicionalmente realizada a 35 ° C e 40 ° C que envolve a medição da actividade residual em 24 e 48 pontos de tempo hr. A 35 ° C, 41% 29C3 exibido e actividade de 176% maior do que a WT PlyC a 24 e 48 h de incubação os pontos de tempo, respectivamente (Figura 4a). A 40 ° C, 28% 29C3 exibido e actividade de 107% maior do que a WT PlyC a 24 e 48 h de incubação os pontos de tempo, respectivamente (Figura 4b).

A actividade residual de WT PlyC e 29C3 foram também monitorizados a cada 20 minutos durante um total de 3 horas a 45 ° C. WT PlyC só foi capaz de manter a actividade de 21% após um período de incubação de 3 horas a esta temperatura, ao passo que 29C3 foi capaz de manter a actividade de 46%. A meia-vida (t _1/2) para WT PlyC e 29C3 foram de 67 e 147 min, respectivamente, sugere ing que 29C3 tem um aumento de 2,2 vezes na estabilidade cinética a 45 ° C (Figura 5).

Total de candidatos Round 1	35
Candidatos com WT Sequência PlyCA	7
Candidatos com ≥ Mutação Ácido Amino 1	28
- Taxa de Mutação média de nucleotídeos (nt / plyCA)	2,75
- Faixa de Mutação de nucleotídeos (nt)	1-6
- Taxa de Mutação média de Aminoácidos (AA / PlyCA)	1,9
- Faixa de Mutação de Aminoácidos (AA)	1-5

Tabela 1. Candidato Análise Genômica Pool.

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Figura 1. Metodologia de ensaio dirigido evolução. Na evolução dirigida, começa-se com a enzima de chumbo, o que seria PlyC WT para a primeira rodada. Uma biblioteca de mutantes aleatórios imparciais PlyC contendo mutações de nucleótidos para o gene plyCA é então construído por uma ADN-polimerase propensa a erros, clonado no vector de expressão de pBAD24 e transformada na E. coli estirpe DH5a contendo já pBAD33:. plyCB transformantes individuais são inoculadas em sua própria específica poço de uma placa de microtitulação de 96 cavidades. Através de um processo de rastreio extensivo, os mutantes individuais PlyC que são cataliticamente activo após incubação a uma temperatura não permitida são classificados como mutantes com estabilidade cinética melhorada. Theconstruct mostrando o comportamento mais progrediu térmica, consequentemente, torna-se a enzima de chumbo para a próxima rodada de mutagênese aleatória. No geral, há três rodadas completas de random mutagênese seguido de DNA baralhar resultando em uma molécula bacteriolytic com evoluído comportamento térmico. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. 96 modelos de microtitulação de placas para o ensaio de evolução dirigida. O esquema de placas de microtitulação durante a determinação das condições óptimas de aquecimento (figura 2a) é constituído por inoculação de um único clone parental WT PlyC em cada linha da placa de microtitulação. O diagrama esquemático da placa de microtitulação durante a triagem mutante (Figura 2b) é constituído por inoculação de cada poço na coluna 1 com um único clone parental WT PlyC bem como inocular cada cavidade nas colunas 2-12 com um clone mutante PlyC distinto. Wells A1-D1 são designados para os controles positivos dos pais, que consist de WT PlyC construções não exposto a não admissível incubação à temperatura. Poços E1-H1 são designados para os controlos negativos parentais, que consistem em construções WT PlyC que estão expostos ao não-incubação à temperatura permissível.

Figura 3. A análise cinética comparando a actividade residual WT PlyC e 29C3. Enzimas foram purificadas até à homogeneidade e foram incubadas durante 30 min num termociclador em concentrações molares iguais em ambas temperatura ambiente ou a um gradiente de temperatura que varia de 45-50 ° C. A actividade enzimática está correlacionada com a velocidade máxima apresentada, após incubação a temperatura específica. Com a excepção de 25 ° C e 47,7 ° C, a variação da actividade entre WT e 29C3 a cada temperatura correlacionada com um valor de p <0,05. Todos os dados são apresentados como a média ± SEM de três experiências independentes.

Figura 4. A análise cinética comparando a actividade residual WT PlyC de 29C3 a 35 ° C e 40 ° C. As concentrações molares de igualdade purificada WT PlyC e 29C3 foram incubadas num bloco de aquecimento a 35 ° C (Figura 4-A) ou 40 ° C (Figura 4b). A actividade enzimática residual foi medida a 24 e 48 pontos de tempo hr. A actividade exibida por cada construção foi normalizada para a velocidade máxima apresentada no ponto zero de tempo. A variação da actividade entre WT e 29C3 em cada ponto de temperatura e de tempo correlacionado com um valor de p <0,05. Todos os dados são apresentados como a média ± SEM de três experiências independentes.

Figura 5. Análise de atividade residual cinética comparandoWT PlyC de 29C3 a 45 ° C. As concentrações molares de igualdade purificada WT PlyC e 29C3 foram incubadas num bloco de aquecimento a 45 ° C e a actividade enzimática residual foi medida a cada 20 min durante 3 horas. A actividade exibida por cada construção foi normalizada para a velocidade máxima apresentada no ponto zero de tempo. Com a excepção dos pontos de dados, a 20 min, a variação da actividade entre WT e 29C3 em cada ponto de tempo correlacionado com um valor de p <0,05. Todos os dados são apresentados como a média ± SEM de três experiências independentes.

Discussão

Este protocolo, esboçado na Figura 1, apresenta uma metodologia 96 placa de microtitulação assim que permite utilizar evolução dirigida para aumentar a estabilidade térmica de qualquer enzima bacteriolytic. Através da utilização de uma DNA polimerase propensa a erros, pode-se introduzir mutações aleatórias que aumentam a estabilidade global cinética da molécula traduzida bacteriolytic de interesse, que é geralmente devido a reorganizações moleculares consistem em aumentar electrostáticas, dissulfureto de pontes e de interacções hidrofóbicas que geram melhorado empacotamento molecular, modificações avançadas de redes de superfície de carga ou reforço de um estado de maior oligomerização ^17-18. Após a introdução das mutações de nucleótidos, um procedimento de rastreio extenso foi então utilizado para identificar mutações que são termicamente benéfico. Os resultados representativos aqui apresentados foram baseadas em um ciclo de mutagénese aleatória. Na realidade, tem sido sugerido quepelo menos, três rondas sucessivas de mutagénese aleatória, cada um utilizando a mutante mais robusta como a enzima de chumbo, seguido por ADN baralhar é apropriada para este tipo de estudos dirigidos evolução do comportamento térmico ^2.

É importante compreender que, embora este protocolo identifica as mutações que aumentam a estabilidade cinética, essas variantes não necessariamente um aumento de termoestabilidade. Uma molécula é considerada termoestável quando tem a capacidade de reter a sua estrutura a uma temperatura elevada. No entanto, no ensaio apresentado, a actividade residual dos lisados ​​mutantes não são ensaiadas na mesma temperatura que foram inicialmente incubadas a durante o passo de tratamento térmico e, portanto, pode-se seleccionar a presença de mutações que promovem a re-enrolamento, em vez de termoestabilidade melhorada ^19. Enquanto nós estamos extrapolando comportamento térmico como uma indicação de estabilidade térmica, estabilidade térmica verdadeira deve ser medido empiricamente por Biophysical métodos tais como dicroísmo circular (CD), calorimetria diferencial de varredura (DSC) e fluorimetria diferencial de varredura (DSF). Os dados preliminares obtidos em experiências de CD e DSF sugerem que vários candidatos identificados a partir da metodologia apresentada, de facto exibir termoestabilidade progrediu (dados não mostrados).

Embora a metodologia aqui apresentada é específica para a implementação aumento do comportamento térmico de PlyC, esta mesma metodologia pode, adicionalmente, ser empregues para aumentar a actividade de outras enzimas térmica bacteriolytic com algumas pequenas alterações nas variáveis, tais como tampões, as taxas de mutação, as condições de aquecimento e sistemas de expressão. Uma variável importante associada a este ensaio refere-se à taxa de mutação nucleotídica do ADN-polimerase propensa a erros. Optou-se por utilizar o error-prone DNA polimerase II Mutazyme no nosso ensaio de evolução dirigida, devido à evidência experimental que sugere esta enzima particular exibe a menor quantidade de polarização comdiz respeito a que os nucleótidos são aleatoriamente incorporado no gene de interesse quando em comparação com outras técnicas de mutagénese ao acaso, como a utilização de hidroxilamina, E. mutator coli e DNA error-prone outro polyermases ^20. De um modo geral, menores taxas de mutação tendem a ser mais desejável por duas razões. Em primeiro lugar, a termoestabilidade da engenharia de proteínas normalmente consiste em relativamente poucas substituições de aminoácidos. Taxas de mutação elevadas pode causar dramáticas alterações estruturais determinadas moléculas que podem resultar em conclusivamente misfolding estrutural e discrepâncias funcionais. Por exemplo, a incorporação de resíduos de prolina e glicina podem romper estruturas alfa helicoidais secundárias ^21. Em segundo lugar, as altas taxas de mutação de nucleotídeo aumentar as possibilidades de incorporar codões de terminação prematuros, resultando em moléculas truncadas que são biologicamente inactivos. De um modo geral, menores taxas de mutação são preferidos porque baixa as taxas de erro no resultado accumulção de mutações adaptativas enquanto que as taxas de mutação mais elevadas gerar mutações neutras ou prejudiciais ^22.

Para cada ronda de mutagénese aleatória, outra variável crítica que se deve optimizar envolve a temperatura de incubação utilizado durante o processo de rastreio. Selecção da temperatura não permissiva experimental é relativamente difícil. Nós inicialmente utilizada uma temperatura de incubação que foi de 10 ° C superior à temperatura não permissiva de PlyC, no entanto após o rastreio de mutantes 3000, não fomos capazes de identificar quaisquer mutações vantajosas. Tendo em mente as metodologias evolução dirigida consistem em identificar sequencialmente benéficos substituições de aminoácidos que têm efeitos aditivos, determinou-se que uma temperatura de menos rigorosas deve ser utilizado durante o processo de rastreio, mesmo que aumentou a possibilidade de geração de falsos positivos. Como tal, foi utilizada uma temperatura de incubação, que foi de apenas alguns graus acima do não-permissive temperatura e novo rastreio candidatos selecionados para descartar os falso-positivos.

Decidimos utilizar uma temperatura de incubação, que não foi muito temperado (≤ 1 ° C superior à mais baixa temperatura não permissiva) e, inversamente, não muito dura (≥ 5 ° C superior à mais baixa temperatura não permissiva). A temperatura ideal decidimos utilizar neste ensaio particular foi a 2 moderado ° C mais elevado do que o determinado experimentalmente temperatura não permissiva. Escolhendo uma temperatura que é muito suave irá resultar em uma taxa muito mais elevada de identificação de falsos positivos do que a ~ 20% foi observada (Tabela I) quando se utiliza uma temperatura de incubação moderada. Além disso, usando uma temperatura de incubação, que é muito duro pode, em última análise resultar na incapacidade para identificar mutantes com significativamente melhor comportamento térmico. Por exemplo, utilizando uma temperatura de incubação de ≥ 5 ° C teria resultado na incapacidade de identificar aprometendo mutante 29C3, assim como a maioria dos outros candidatos selecionados durante a primeira rodada de seleção.

Em suma, nós fornecemos um protocolo de enzimas de engenharia bacteriolytic para adquirir estabilidade cinética reforçada. Além disso, este mesmo ensaio, sem os passos de aquecimento, pode ser usado para o rastreio de mutações que aumentam a actividade catalítica. Aumentar tanto a atividade catalítica e estabilidade térmica é um obstáculo importante no desenvolvimento voltado para qualquer enzima terapêutico. Embora os detalhes deste protocolo são específicos para o PlyC endolysin, a metodologia pode ser adaptado a qualquer enzima bacteriolytic apenas com algumas alterações. Nós apresentamos resultados preliminares de apenas a primeira ronda de mutagénese que valida que a funcionalidade do ensaio, o que resulta na aplicação e identificação de mutações que geram um aumento na termoestabilidade molecular de magnitude significativa.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
B-PER II Reagente de Extracção Bacterial Protein	Thermo Scientific	78260
GeneMorph II Kit mutagênese aleatória	Agilent Technologies	200500
Limpar 96 Bem, Microplaca de fundo plano com tampa	BD Vacutainer Labware Médica	353072
96 Bem Nonskirted Placas PCR	Fisher Scientific	14-230-232
Rotor basculante	Eppendorf	A-2-DWP
Sal de Sódio Ampicilina	Fisher Scientific	BP1760
Cloranfenicol	Fisher Scientific	BP904
Arabinose	Fisher Scientific	BP2504
pBAD24 vetor de expressão	ATCC	87399
pBAD33 vetor de expressão	ATCC	87402