Profiling glicana de Polímeros da planta da parede celular usando Microarrays

Isabel E. Moller; Filomena A. Pettolino; Charlie Hart; Edwin R. Lampugnani; William G.T. Willats; Antony Bacic

doi:10.3791/4238

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Resumo
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Resumo

Uma técnica chamada C Omprehensive M Icroarray P Profiling olymer (CoMPP) para a caracterização de glicanos da parede celular vegetal é descrito. Este método combina a especificidade dos anticorpos monoclonais dirigidos para epitopos definidos glicano-com uma plataforma de microarray em miniatura analítico permitindo rastreio de ocorrência de glicano em uma ampla variedade de contextos biológicos.

Resumo

Paredes das células de planta são matrizes complexas de glicanos heterogéneos, que desempenham um papel importante na fisiologia e desenvolvimento de plantas e fornecer as matérias-primas para as sociedades humanas (por exemplo, as indústrias de madeira, papel, têxteis, e biocombustíveis) ^1,2. No entanto, compreender a biossíntese e função destes componentes permanece um desafio.

Glicanos de parede celular são quimicamente e conformacionalmente diversificada, devido à complexidade dos blocos de construção, os resíduos glicosilo. Estas ligações formam em posições múltiplas e diferem na estrutura do anel, a configuração isomérica ou anomérico, e, além disso, são substituídas por uma matriz de não-açúcar resíduos. Composição varia de glicano na célula diferente e / ou tipos de tecidos, ou mesmo sub-domínios de uma única célula de parede ^3. Além disso, a sua composição é também modificado durante o desenvolvimento ^1, ou em resposta a estímulos ambientais ^4.

Em excesso de 2.000 genes têm paredes celulares de plantas são matrizes complexas de glicanos heterogéneas foram previstos para ser envolvido na biossíntese de glicanos parede celular e modificação em ⁵ Arabidopsis. No entanto, relativamente poucos dos genes biossintéticos foram funcionalmente caracterizados ^4,5. Genética reversa são difíceis porque os genes expressos diferencialmente são muitas vezes, muitas vezes em níveis baixos, entre os tipos de células ^6. Além disso, estudos mutantes são muitas vezes dificultada pela redundância gene ou mecanismos compensatórios para garantir o funcionamento adequado parede celular é mantida ^7. Assim, novas abordagens são necessárias para rapidamente caracterizar a diversidade de estruturas de glicano e facilitar abordagens genômica funcional para a compreensão a síntese da parede celular e modificação.

Os anticorpos monoclonais (mAb) ^8,9 surgiram como uma ferramenta importante para a determinação da estrutura de glicano e distribuição nas plantas. Estes reconhecem distepítopos INCT presentes dentro das principais classes de glicanos da parede celular vegetal, incluindo pectinas, xiloglucanos, xilanos, mananos, glucanos e Arabinogalactanos. Recentemente o seu uso tem sido estendido para experiências em grande escala de triagem para determinar a abundância relativa de glicanos em uma ampla gama de tipos de tecido da planta e, simultaneamente, ^9,10,11.

Apresentamos aqui um microarray-based método de rastreio de glicano chamado Comprehensive Polymer Microarray Profiling (CoMPP) (Figuras 1 & 2) ^10,11, que permite múltiplas amostras (100 s) a ser rastreada utilizando uma plataforma de microarray miniaturizado com o reagente reduzida e os volumes de amostra. Os sinais no local de microarray pode ser formalmente quantificadas para dar semi-quantitativas de dados sobre a ocorrência de glicano epítopo. Esta abordagem é bem adequado para o rastreamento de alterações glicano em sistemas biológicos complexos ¹² e proporcionando uma visão global da composição da parede celular particularmente quando o conhecimento préviof este não está disponível.

Protocolo

1. Coleção de tecidos e Preparação

Recolher 100 mg de peso fresco de tecidos de planta (um mínimo de 10 mg de peso seco) em pelo menos em triplicado para cada tecido de interesse. Os passos que se seguem descrevem a preparação de material de parede celular a partir de tecidos vegetativos. No caso de tecidos de armazenamento, não-desejado amido é enzimaticamente removida antes de se proceder à extracção de polímeros da parede celular, como descrito anteriormente ^13.
Homogeneizar a amostra até um pó fino com azoto líquido utilizando um Qiagen TissueLyser II, com 24 conjuntos de tubos de adaptador e 3 mm grânulos de carboneto de tungsténio (30 Hz, 2 x 30 s). Em alternativa, se apenas alguns exemplos estão a ser tratados, de um almofariz e pilão é usado.
Transfira os homogeneizados em 10 ml de plástico tubos cónicos.
Preparar o material da parede celular, por lavagem dos homogeneizados em 10 ml de etanol a 80% v / v à temperatura ambiente e agitação em vórtex vigorosamente durante 2 min.
Centrifugue as amostras a 3500 xg e elimine o sobrenadante. Repita o etanol a 70%, pelo menos, lava três vezes ou até que o sobrenadante é claro, em particular para os tecidos que contêm clorofila.
Realizar uma lavagem final com acetona a 100% e deixar os grânulos contendo os resíduos de álcool insolúvel (AIR) secar ao ar durante a noite.
Sieve as amostras de ar com uma malha de 0,4 mm ² para conseguir um pó fino, homogéneo e para remover maior, mal partículas do solo, que por vezes ficam no homogenato.
Pesar 10 mg de amostra de ar em microtubos contendo, cada um, de 3 mm de contas de vidro para auxiliar a homogeneização das amostras.

2. Extracção de Glicanos parede celular

Pectinas, e polímeros relacionados com as pectinas são extraídas as amostras pela adição de 500 ul de 50 mM CDTA (pH 7,5) para cada amostra.
Brevemente os tubos de vórtice para garantir o solvente está em contacto com o material da amostra e, em seguida misturar com o TissueLyser durante 3 horas a 8 Hz.
Centrifugue as amostras a 12.000 xg, cuidadosamente remover-se os sobrenadantes e armazenar a 4 ° C.
Lavar peletes em 1 ml de água desionizada para diluir e remover qualquer remanescente de vórtice, solvente e centrifuga-se a 13.000 x g. Repetir esta etapa, sem perturbar o sedimento e remover todo o líquido a partir dos tubos, antes de prosseguir para o passo seguinte.
Reticulantes glicanos são sequencialmente extraída da parede celular de pellet restante com 500 ul de NaOH 4M com 0,1% w / v NaBH4, usando o mesmo processo descrito nos passos 2,1-2,4 para a extracção CDTA. _NaBH4 é adicionada para reduzir o aldeído (ou cetona) grupo na extremidade redutora dos polissacáridos para uma base de álcool impedindo descamação de polissacarídeos.
Após centrifugação, os sobrenadantes são novamente removidos, armazenados a 4 ° C, e as pelotas lavadas duas vezes em água desionizada antes de se proceder à extracção seguinte.
Como passo opcional, os polímeros residuais, tais como a celulose são extraídos com 500 uL cadoxen (31% v / v 1,2-diaminoethane com 0,78 M CdO), utilizando o mesmo procedimento tal como descrito nos passos 2,1-2,4. Alternativamente, o teor de celulose total em peletes restantes podem ser determinadas usando ensaios acético / nítrico (ver discussão).

3. Microarrays impressão

Sobrenadantes de centrífuga contendo polímeros extraída da parede celular a 13000 xg para remover qualquer matéria particulada.
Carregar 50 ul de cada amostra para um polipropileno de 384 poços de placas de microtitulação utilizando uma disposição de pré-concebido costume em que as amostras são organizados de acordo com o tipo de tecido e do tipo de extracção.
Dilui-se a parede celular da amostra de polímero em um 0, 5 e 25 da série de diluição em série × com água desionizada.
Parâmetros como altura do pino, coleta e tempo de espera, e de lavagem são definidas no software que controla a microarrayer.
A humidade da câmara de impressão é controlada em 60% para evitar a evaporação da amostra.
O trabalho de impressão é iniciado usando LabNEXT software e de um programa, que corresponde ao esquema de microarray.
O robô utiliza pinos do canal capilar para imprimir as soluções da amostra sobre a placa de 20 x 20 centímetros membrana de nitrocelulose, que é anexada a uma placa plana na máquina. Cada ponto na matriz contém 15 nl de uma solução e é impressa em triplicado.
Microarrays idênticos são impressas lado a lado sobre a membrana e corte em matrizes individuais, após o trabalho de impressão está completa.
Em cada experimento, as matrizes podem ser modificados de modo a acomodar mais ou menos amostras, diluições ou repetições.

4. Sondagem de Microarrays glicano

Após a impressão, bloquear os microarrays individuais em 5% w / v de leite em pó desnatado dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (MPBS) à temperatura ambiente durante 2 horas para reduzir a ligação não específica.
Microarrays de sonda com anticorpos monoclonais específicos para a célula-parede glicano epítopos durante 2 h em MPBS. A maioria dos Antib monoclonalodies glicanos contra paredes celulares estão comercialmente disponíveis a partir de três empresas; Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Carbosource Serviços ( www.carbosource.net ) e (PlantProbes www.plantprobes.net ).
Incluir um controlo negativo, um microarray incubadas com MPBS e não apenas o anticorpo primário.
Lavar os microarrays 3 vezes em tampão fosfato salino (PBS) durante 5 minutos para remover ligação não específica.
Sondar os microarrays com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP) em MPBS durante 2 horas. A maioria dos anticorpos monoclonais contra glicanos da parede celular exigem anti-rato ou anti-ratazana de anticorpos secundários.
Repita os passos de lavagem 3 vezes com tampão PBS, durante 5 minutos para remover ligação não específica.
Desenvolver os microarrays utilizando cromogênico (3,3-diaminobenzidina) ou chemiluminecent (luminol) substratos.

5. Quantificação

Após o desenvolvimento, digitalizar os microarrays individuais usando uma alta resolução (1200 dpi) scanner de desktop e salvar as imagens negativas, como arquivos TIFF de 16 bits (Figura 3).
Calcular a intensidade integral de cada mancha usando Xplore Software Image Processing (LabNEXT) equipado com uma ferramenta automatizada de grade. A intensidade local integrante é derivado a partir da soma de pixels na área da grelha em torno de cada ponto.
Os dados de grade para cada microarray é exportado como um arquivo txt e pode ser importado manualmente em uma planilha do Excel para análise. Uma ferramenta online ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) foi desenvolvido para traduzir automaticamente e processar dados de arquivos txt individuais.
A intensidade de manchas integral é na média entre impressão repetições e diluições para obter um ponto "médiavalor de intensidade "para cada amostra (Figura 2). Alternativamente, os sinais de ponto correspondente a um único valor de diluição em série são utilizados para quantificar a abundância relativa de epítopo de glicano para cada amostra.
As intensidades relativas local médias entre diferentes amostras são apresentados como um mapa de calor (Figura 4), utilizando ferramentas de formatação condicional no excel ou online heatmapper ( http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). Os dados para cada tipo de anticorpo é corrigida para 100 e um valor de corte de 5% é aplicada para remover o sinal de fundo e falsos positivos.