Os tecidos músculo esquelético de engenharia a partir de células progenitoras mioblastos murinos e Aplicação da estimulação elétrica

Resumo

Tecido muscular de engenharia tem um grande potencial na medicina regenerativa, como modelo de doença e também como uma fonte alternativa para a carne. Aqui descreve-se a engenharia de uma construção de músculo, neste caso, a partir de células progenitoras, mioblastos de rato e a estimulação por pulsos eléctricos.

Resumo

Tecidos musculares engenharia pode ser utilizado para diversos fins, que incluem a produção de tecidos para utilização como um modelo de doença in vitro, por exemplo, para estudar as úlceras de pressão, para a medicina regenerativa e como uma alternativa a carne ^1. As primeiras construções relatados musculares 3D foram feitos há muitos anos e pioneiros no campo são Vandenburgh e colegas ^2,3. Avanços na engenharia de tecidos músculo não são apenas o resultado do ganho enorme no conhecimento de fatores bioquímicos, células-tronco e células progenitoras, mas estão em base particular em conhecimentos obtidos por pesquisadores que os fatores físicos desempenham papéis essenciais no controle do comportamento de células e tecidos de desenvolvimento. Estado-da-arte da engenharia muscular constrói atualmente consistem de construções de células-povoadas de hidrogel. No nosso laboratório que geralmente são constituídos por células mioblastos de murino progenitoras isoladas, a partir de murinos músculos dos membros posteriores ou de uma linha celular C2C12 de mioblastos de murino, mixado com uma mistura de colagénio / Matrigel e semeadas entre dois pontos de ancoragem, que imita os ligamentos musculares. Outras células podem ser considerados, bem como, por exemplo, linhas celulares alternativos, tais como os mioblastos L6 de rato neonatal musculares ^4, células progenitoras, células derivadas ⁵ derivadas de tecidos musculares adultas a partir de outras espécies, tais como ⁶ humana ou células pluripotentes estaminais ainda induzidas (células iPS) ⁷ . Contractilidade celular faz com que o alinhamento das células ao longo do eixo longitudinal da construção de ^8,9 e diferenciação das células progenitoras musculares após cerca de uma semana de cultura. Além disso, a aplicação de estimulação eléctrica pode melhorar o processo de diferenciação, em certa medida ^8. Devido ao seu tamanho limitado (8 x 2 x 0,5 mm) do tecido completo pode ser analisada utilizando microscopia confocal para monitorar a viabilidade por exemplo, diferenciação de células e de alinhamento. Dependendo da aplicação específica, os requisitos para a engineetecido muscular vermelho pode variar; por exemplo, utilização em medicina regenerativa requer o escalonamento do tamanho dos tecidos e a vascularização, enquanto para servir como uma tradução alternativa a outras espécies de carne é necessário.

Protocolo

1. Cultura de Células de mioblastos de murino progenitoras ou células C2C12

1. Isolar as células de acordo com o protocolo inicialmente publicado por Shefer e colegas ¹⁰ e posterior adaptada por Collins et al. ¹¹ e Boonen et al. ¹² e armazená-los em azoto líquido. Isto requer ratos, por exemplo, C57BL / 6. Os métodos alternativos são usadas em outros laboratórios, por exemplo, um método publicado em Journal of Experiments visualizadas por Li Y et al. ^13. Para os reagentes e equipamentos que são referidos na tabela da página 7 e 8. A partir do músculo de um rato irá geralmente obter células suficientes para criopreservar cerca de 20 frascos em azoto líquido. Em seguida, inicia o protocolo de descongelar as células a partir da armazenagem de azoto líquido.
2. Colocar as células a partir de um frasco para um 25 cm ² Matrigel (1 mg / ml) frasco de cultura de tecido revestido e adicionar meio de crescimento (GM) que consiste em (335 ml de DMEM avançada, 100 ml fetal bovine soro (FBS), 50 ml HS, 5 ml penicilina / estreptomicina, 5 ml de L-glutamina, 5 ml de extracto de embriões de galinha (CEE)).

Nota: revestimento durante 2 h à temperatura ambiente e remover o Matrigel por aspiração.

3. Subcultura das células de aproximadamente 1:03 a cada 3 dias.
   Isso significa que: no dia 3: células passagem de um 25 centímetros ² para um frasco de 75 cm ^2, no dia 6: as células de passagem de um frasco de 75 cm ² para dois 150 centímetros ² frascos (com 30 min preplating em frascos sem revestimento). No dia 9 de transferência de um balão de 150 centímetros ² a 1 150 centímetros triplo ^{Frasco de 2,} ou se não estiver disponível a três frascos de 150 centímetros ² (se necessário preplate novamente dependendo do fenótipo das células). No dia 12, as células estão prontas para semear em uma construção muscular.

Notas: - Por triplo 150 cm ^2, o número de células será de aproximadamente 4,5 x 10 ⁶ células.
- Use vials de isolamentos diferentes para misturá-las para se obter uma população mista de células na altura da sementeira.

Nota: Se você optar por não trabalhar com células primárias, mioblastos C2C12 são uma boa alternativa.

2. Engenharia de tecidos músculo esquelético

1. Prepare cola de silicone misturando-se o "elastómero" com o "agente de cura" (10:1). Cortar + / - 5 mm segmentos quadrados de velcro com um lado triangular (casa-como a forma, a Figura 1). Cola o velcro para os poços de uma placa de cultura de 6 poços em um espaço de aproximadamente 12 mm entre os quadrados.

Notas: - Só use o lado macio do velcro e enfrentar esta para cima o lado.
- Certifique-se de que os telhados se enfrentam.
- Apenas cobrir o velcro com cola de silicone, não espalhar cola por todo o bem.
- Para a estimulação elétrica depois é relevante para alinhar as construções na direção vertical do pl bemcomeu (ao longo do eixo).

2. Deixa-se secar durante a noite num forno de vácuo, não aquecida, principalmente para remover as bolhas de ar. Esterilizar por adição de EtOH a 70% aos poços e incubar durante 15 min. Enxaguar 3x com PBS e colocadas sob UV, durante 15 minutos. Remover todo o PBS a partir dos poços e o Velcro e coloque na incubadora até à sua utilização.
3. Descongelar Matrigel solução no frigorífico e preparar a solução de colagénio para a concentração desejada, pouco antes de fazer as construções em 3D. Dilui-se o colagénio de estoque com ácido acético a 0,02% estéril (concentração final de 3,2 mg / ml).

Nota: deixar tudo no gelo.

4. Tripsinizar as células, ressuspender em GM e contagem. Deixar as células num tubo de centrifugadora na incubadora.
5. Adicionar a quantidade desejada de solução de colagénio para o número de construções que pretende fazer a um tubo (de acordo com a Tabela 1), adicionar NaOH 0,5 M a esta solução de colagénio até uma cor de rosa claro color é o que indica um valor de pH de 7,5. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo e evitar a formação de bolhas. Em seguida, adicione o Matrigel e misture muito delicadamente mas completamente. Por fim, adicionar o GM-se à mistura de colagénio / Matrigel (para as quantidades apropriadas ver Tabela 1).

Notas: - Execute cada passo no gelo! Matrigel e colagénio será prontamente gel à temperatura crescente.
- Lembre-se que a cor realmente é rosa! Um aumento no pH também induzir a gelificação rápida.
- A concentração final de colagénio: 1,6 mg / ml.

6. Centrifugar a quantidade desejada de células a 1.000 rpm durante 5 minutos e remove-se o sobrenadante.

Nota: - Consoante a actividade das células do número de células por construção necessita de ser ajustada. Tipicamente, o número de células situa-se entre 750.000 e 1.250.000 células por construção.

7. Utilizar parte da mistura de gel para ressuspender o sedimento celulare transferir as células para a mistura restante e misturar cuidadosamente, mas sem a introdução de bolhas de ar.
8. Levar as placas pré-aquecidos bem fora da incubadora e pipeta 0,35 -0,4 ml da mistura de células-gel na primeira Velcro. Então, começar a pipetar a mistura a partir do centro, entre os locais de fixação e estender-se ao Velcro. Finalmente, a utilização do restante do gel para encher o espaço entre as duas escoras de velcro e de pipeta em torno dos pedaços de velcro.
9. Verifique cuidadosamente após 5-10 min se os géis são sólidos o suficiente para ser transferido, ou seja, bata suavemente os pratos e inspecionar visualmente se o gel é rígida. Se assim for, coloque cuidadosamente os pratos em uma incubadora. Geralmente, eles podem ser recolhidos depois de dez minutos. Em seguida, após 1-2 horas, gentilmente sobrepor cada gel com 4 mL de GM quente.

Nota:-Não faça movimentos vigorosos ao manusear as placas.

10. Substitua GM por meio de diferenciação (meio de crescimentosem extrato de embrião de galinha), após 24 horas, e substituir por meio fresco a cada 2-3 dias. No dia 7 deverá ter obtido maduros fibras musculares orientadas, como pode ser avaliado com o desenvolvimento da coloração por estrias cruzadas nas fibras musculares fundidos.

3. Estimulação Elétrica

1. Esterilizar os eléctrodos a partir da placa ionoptix (ver tabela de reagentes e equipamento) antes da utilização, com etanol a 70% e, subsequentemente, seco sob UV numa câmara de segurança. Colocar a placa com os eléctrodos para a placa de cultura com as construções e cobrir com a tampa da placa de cultura e transferência para a incubadora. Conecte o Ionoptix C-pacer com os cabos adequados.

Nota: Os eléctrodos são colocados em paralelo ao lado da construção muscular (Figura 2).

2. Aplicar o protocolo de estimulação, como previsto.

Nota: Nós usamos geralmente 4 V / cm,Pulsos 6ms com uma frequência de 2Hz. Alterar o meio de cultura a cada 24 h durante a estimulação.

Resultados

O produto final será construções musculares, como indicado na Figura 3. O tamanho do tecido será de aproximadamente 8 mm de comprimento, 2 mm de largura e 0,5 mm de espessura. A estimulação eléctrica durante a diferenciação vai alterar a expressão das isoformas de cadeia pesada de miosina, mas não aumentar grandemente o processo de diferenciação, tal como induzida pelo meio de diferenciação 8, mas a estimulação eléctrica também pode ser aplicado no final do processo para verificar a f...

Discussão

A engenharia de tecidos musculares tem um grande potencial para a utilização como um modelo de doença, para a triagem de drogas, em medicina regenerativa e para a produção de carne. No entanto, os requisitos para estas aplicações variar. Optou-se por trabalhar com uma combinação de colagénio e de matrigel, porque permite o alinhamento de colagénio e células porque as células progenitoras mioblastos requerem a presença de proteínas de membrana basal derivadas, tal como determinado em estudos anteriores 2D ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Matrigel factor de crescimento reduzido	Beckton Dickinson e
DMEM (glucose elevada) *	Gibco	42430
Avançado DMEM	Gibco	12491
Soro de cavalo	Gibco	65050-122
De soro fetal bovino	Greiner	758075
0,45 e 0,22 um filtro de seringa *	Whatmann (Schleicher e Scheull)	10462100
L-glutamina	Gibco	25030024
Penicilina / estreptomicina	Gibco	10378016
Anfotericina	Gibco	15290-018
Plástico para cultura	Greiner		Inclui frascos de cultura e pipetas
Extracto de embrião de galinha	United States Biological	C3999
Pipeta de Pasteur *	Hilgenberg		Pipetas Pasteur, com a constrição, com algodão L ponta, aberto: 230 mm de diâmetro com ponta de 0,9 - 1,1 mm
Pipeta de Pasteur *	Hilgenberg		Pipetas Pasteur, com a constrição, com algodão L ponta, aberto: 230 mm de diâmetro com ponta de 1,4 - 1,6 mm
Pipeta de Pasteur	VWR	612-1702
Colagenase tipo I*	Sigma	C0130-16
40 mM filtro célula *	BD Falcon	352340
Agulha de 19G
Elastômero	Dow Corning Corporation	3097358-1004	Silastic MDX 4-4210 #
Agente de cura	Dow Corning Corporation		Silastic MDX 4-4210 #
Velcro	Loja regular		Você pode comprar este em uma loja regular, usar apenas o lado macio
Colágeno tipo I, cauda de rato	BD Biosciences	3544236
C-Pace Pacer Cultura PE	Ionoptix
6 poços de placas de cultura de estimulação eléctrica	Beckton Dickinson-Falcon	BD Falcon # 353846
C-prato prato eletrodos cultura	Ionoptix
			* Necessária para o isolamento de células (ponto 1.1) # Juntos em um kit