Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de<em&gt; Cotilédone Arabidopsis</em&gt; Epiderme durante a germinação

Resumo

Nós descrevemos um protocolo com lâminas de câmara e de mídia para imobilizar cotilédones de plantas para imagem confocal da epiderme durante vários dias de desenvolvimento, documentação diferenciação estomática. Proteínas fluoróforo com a tag pode ser monitorado de forma dinâmica por expressão e localização subcelular, aumentando a compreensão de seus possíveis papéis durante a divisão celular e diferenciação do tipo de célula.

Resumo

Imagiologia in vivo na dinâmica do comportamento celular ao longo de uma sequência de desenvolvimento pode ser uma técnica eficaz para a compreensão dos mecanismos da padronização do tecido. Durante o desenvolvimento do animal, a proliferação celular e os eventos chave padronização ocorrer muito rapidamente. Por exemplo, em Caenorhabditis elegans todas as divisões celulares necessários para o plano do corpo larval são concluídas dentro de seis horas após a fertilização, com sete ciclos mitóticos ^1; as mitoses 16 ou mais de embriogênese Drosophila ocorrer em menos de 24 horas ^2. Em contraste, as divisões celulares durante o desenvolvimento da planta é lenta, tipicamente da ordem de um dia ^3,4,5. Isso impõe um desafio único e uma necessidade de longo prazo de imagem ao vivo para documentar comportamentos dinâmicos de divisão celular e diferenciação eventos durante a organogênese planta. Epiderme Arabidopsis é um sistema excelente modelo para sinalização de investigação, o destino de células e desenvolvimento em plantas. No cotilédone, este tecido é constituída por ar e as células resistentes à água do pavimento intercalados com estômatos uniformemente distribuída, válvulas que abrem e fecham para controlar as trocas gasosas e a perda de água. O espaçamento adequado dos estomas estes é crítico para a sua função, e o seu desenvolvimento segue uma sequência de divisão assimétrica e etapas de diferenciação de células da epiderme para produzir organizada (Fig. 1).

Este protocolo permite a observação de células e proteínas na epiderme ao longo de vários dias de desenvolvimento. Este intervalo de tempo permite a documentação precisa de células-tronco divisões e diferenciação das células epidérmicas, incluindo estômatos e células epidérmicas pavimento. As proteínas fluorescentes podem ser fundidos com proteínas de interesse para avaliar a sua dinâmica durante a divisão celular e processos de diferenciação. Esta técnica permite compreender a localização de uma nova proteína, POLAR ^6, durante a fase de proliferação de células da linhagem estomática-in the Arabidopsis epiderme cotilédone, onde é expresso em células de eventos anteriores de divisão assimétricos e move-se para uma área característica do córtex célula ocorre pouco antes da divisão. As imagens podem ser registrados e vídeo simplificada facilmente produzida usando o software de domínio público para visualizar localização de proteínas dinâmica e tipos celulares como eles mudam com o tempo.

Protocolo

1. Esterilização de sementes

1. Preparar a solução de esterilização de sementes: lixívia 33%, 0,1% de Triton X-100.
2. Coloque as sementes que transportam construção repórter fluorescente desejada (s) e genótipo (s) em 1,7 ml de tubo e aplicar 1 ml da solução de esterilização. Incubar em Nutator durante 15 min.
3. Em um capuz estéril, utilizar uma pipeta para remover a solução de esterilização a partir do tubo, deixando atrás de sementes. Enxágüe com 1 ml de água estéril. Repita quatro vezes.
4. Incubar a 4 ° C durante dois dias ou mais.

2. Preparação de slides Câmara Mídia

1. Misturar 20 ml de solução a 0,5% de Bacto Agar (agarose não puro) em água, num balão de 200 ml, e de micro-ondas até se dissolver. Seja cauteloso ao ferver a solução.
2. Arrefece-se a solução para cerca de 60 ° C.
3. Colete 1 ml de solução de agar com um pipetador e lentamente para aplicar a tampa de vidro no interior da câmara de corrediça (Lab-Tek II Chambered # 1.5 Sistema lamela Alemão). Solução which é muito quente ou muito rapidamente aplicado pode derreter cola ou vidro crack.
4. Imediatamente adicionar um segundo ml de solução de agar. Ágar agora deve cobrir completamente o fundo da câmara de slides. Este meio mínimo é suficiente para suportar o desenvolvimento de um dos cotilédones da planta, que contém nutrientes armazenados, durante quatro a cinco dias, mantendo a humidade e permitindo a difusão do gás.
5. Slides fresco em bancada com câmara coberta. Se frasco é coberto firmemente, a solução pode ser guardada e reaquecido para uso futuro.

3. Dissecção semente

1. Retire o tubo de sementes estéreis a partir de 4 ° C de armazenagem.
2. Colocar um tecido de papel sobre a plataforma de um microscópio de dissecação e humedecer com água. Ajustar o tecido para criar uma superfície lisa. O tecido é utilizado para estabilizar as sementes para dissecção.
3. Pipetar 20-30 sementes a partir do tubo para o tecido, tendo o cuidado de os colocar no campo do escopo de dissecação da vista.
4. Utilizando uma pinça cortantes (Roboz, # 5 ponta biologia), Remova cuidadosamente o casaco de semente de dentro de mudas. Tegumentos exteriores e interiores, tem de ser removido.
5. Quando a imagem de cotilédone, é benéfico para remover o hipocótilo e da radícula. Cotilédones contêm nutrientes suficientes para desenvolver por vários dias sob este protocolo. Se intacto, o hipocótilo irá endireitar e alongar de forma dramática, movendo o cotilédone para fora do campo de visão do lapso de tempo. Usar um bisturi para cortar os cotilédones livres do hipocótilo.
6. Segurar cotilédones dissecados imersos em água, em um microtubo ou similar.
7. Repita 3,4-3,6 até que o número desejado de cotilédones é atingido. 15-20 dissecções de sucesso são recomendados antes da montagem.

4. Os cotilédones de montagem no slide Câmara

1. Usando uma lamínula pequeno (18 mm ^2), cortou os meios de ágar e levantar toda a camada da base até o slide câmara de vidro.
2. Pipetar dissecados cotilédones com um mínimo de água de detertubo dentro da câmara de corrediça, por baixo da camada de agar levantada.
3. Abaixe cuidadosamente o agar para os cotilédones. Se o excesso de água está presente, mergulhe-o longe com um lenço de papel, tomando cuidado para não perturbar os cotilédones. As amostras não devem mais se mover facilmente quando montagem está completa.
4. Coloque a tampa no slide câmara e slides mudança para estágio do microscópio.

5. Time Lapse imagem

1. Configurar microscópio confocal invertido para o fluoróforo imagem desejada (s). LSM700 parâmetros utilizados: para GFP, excitação a 488 nm e de recolha com um filtro passa banda de 440-530 nm; para RFP, excitação a 555 nm e de recolha com um filtro passa banda de 570-610 nm.
2. Inspecione espécimes montados por danos. Programar os locais de intacta, devidamente montado cotilédones em software microscópio. No Zen 2009: foco em um cotilédone com 20x objetivo e mover objetivo de centro de slide câmara. Em Modo de Aquisição, mudar o zoom para 0,5 e tamanho </> Em que 48x48 pixels. Selecione Posições caixa e imagem de digitalização visão geral ... botão sob Posições, em seguida, aumentar o número de telha Horizontal e Vertical para 30-35. Quando a digitalização estiver concluída, clique no botão Posições sob a guia Dimensões e mira lugar em cada cotilédone para observar.
3. Configure z série abrangendo a epiderme dos cotilédones de tudo Zen samples.In 2009: Clique na caixa Z-Stack. Selecione cada posição em Lista de posição e clique no botão Mover para. Concentre-se no plano mais alto da epiderme dos cotilédones e clique no botão Definir Primeiro sob Z-Stack. Concentre-se na posição mais baixa na qual epiderme é útil visível e clique no botão Definir passado. Clique no botão ao lado Optimal, que mostra melhor a espessura z-slice, para definir. Verifique cada cotilédone para confirmar que essas configurações abranger todas as amostras, os parâmetros z não pode ser definido por indivposições idual em 2009 zen.
4. Configure série de tempo na resolução desejada e comprimento. Intervalos de 15-30 min, durante três dias são eficazes para a dinâmica das proteínas na divisão de células da epiderme. Este intervalo pode ser alterado conforme necessário. No Zen 2009: Clique na caixa de Séries Temporais. Sob série de tempo, definir Ciclos para o número de imagens desejadas usando o controle deslizante ou digitando no campo de texto. Definir Intervalo a 30 e use o menu suspenso para selecionar min.
5. Comece xyzt verificação multi-posição. Note-se que o número de posições deverá ser limitada pelas especificações de verificação, se o tempo de verificação total é maior do que o intervalo desejado, os pontos de tempo não será correcta. Um máximo de seis posições simultâneas são possíveis quando imagens GFP e RFP em 59 z fatias em um intervalo de 30 min usando nosso sistema. No Zen 2009: Tamanho do Quadro de Mudança para a resolução desejada e clique em Iniciar Experimento.

6. Edição de Vídeo

1. A partir do arquivo de dados confocal, faça uma intensidade máxima z projeção de cada combinação de tempo / posição e exportação como arquivos de imagem em um formato sem perdas como TIFF. Os nomes dos arquivos devem estar em uma série por posição (por exemplo, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, etc, não POLAR-GFP_0001_pos1) para o software para combiná-los em um filme. No Zen 2009: Copiar Uso: Subconjunto sob a guia Processamento de dividir posições em arquivos separados, em seguida, projeção de intensidade máxima. Finalmente, exportar como TIFF (Arquivo: Exportação, janela de imagem Resolução completa - série).
2. Use FIJI ^7,8 para alinhar imagens sucessivas executando a macro bUnwarpJ ⁹ (Plugins: Inscrição: bUnwarpJ). Alterar o modo de registo para Mono. Todas as opções avançadas podem usar valores padrão. Para as seqüências longo lapso de tempo, baixar e instalar o macro "Affine + Registro de imagem consistente elástica 2D", que vai aplicar bUnwarpJ a uma série de imagens automaticamente, e y abertonossos dados usando arquivo: Importar: Seqüência de imagens para usá-lo. Desmarque MOPS extração de pontos de referência e de execução.
3. Use FIJI / ImageJ ou QuickTime Pro para abrir a seqüência de imagens alinhadas e salvar no formato de vídeo desejado (AVI é uma boa escolha).

Resultados

Um conjunto de pontos de tempo recolhidos informativos com este método é apresentado na Figura 3. As membranas celulares são marcados com RFP (pm-rb) e GFP é fundido com a proteína POLAR sob seu promotor nativo (POLAR :: POLAR-GFP) ⁶ Na escala de tempo de 30 min, vemos as divisões celulares, juntamente com as mudanças na localização de proteínas precedendo eles. Assimétricos divisões celulares na forma linhagem estomática em células-tronco como precursores estomat...

Discussão

Esta técnica de lapso de tempo confocal permite estudos longitudinais de expressão da proteína fluorescente etiquetado e localização em células individuais da epiderme cotilédone Arabidopsis, que, no caso de proteínas e de outros POLARES dinamicamente variáveis ​​é fundamental para uma boa compreensão da sua função. Anteriormente, sustentado de tempo de imagem lapso foi utilizado para examinar a infecção fúngica da raiz de Arabidopsis ¹¹ e meristema ^5,12 cresci...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Agar Bacto	BD	214010
Uma câmara-de slides	Nunc (Thermo Scientific)	155360	Ou duas câmaras (155.379)
Microscópio de varredura a laser confocal	Zeiss	LSM700	Software Zen 2009
20x lente objetiva	Zeiss	420650-9901	NA 0,8, Plano-Apochromat
Dissecando microscópio	Benz (Nacional)	431TBL	Acende-se a partir de baixo
º 5 fórceps, biologia ponta	Roboz instrumento cirúrgico	RS-4978	Dicas muito finassão críticas