Um<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio para ensaio de permeabilidade dos vasos sangüíneos

Resumo

Estamos apresentando um In vivo Ensaio para testar a permeabilidade dos vasos sanguíneos. Este ensaio baseia-se na injecção intravenosa de uma visualização do corante e subsequente da sua difusão para os espaços intersticiais.

Resumo

Este método baseia-se na injecção intravenosa de azul de Evans nos ratinhos como modelo animal de teste. Azul de Evans é um corante que se liga a albumina. Sob condições fisiológicas o endotélio é impermeável à albumina, de modo do azul de Evans encadernados restos de albumina restrito dentro dos vasos sanguíneos. Em condições patológicas que promovem o aumento da permeabilidade vascular células endoteliais parcialmente perder seus contatos próximos e com o endotélio torna-se permeável a pequenas proteínas, como a albumina. Esta condição permite o extravasamento de azul de Evans dos tecidos. Um endotélio saudável impede o extravasamento do corante nos tecidos vizinhos vascularizados. Órgãos com aumento da permeabilidade irá mostrar um aumento significativo em comparação com coloração azul órgãos com endotélio intacto. O nível de permeabilidade vascular pode ser avaliado por simples visualização ou por medição quantitativa do corante incorporado por miligrama de tecido de controlo versus animal experimental / tecido. Dois powerful aspectos deste ensaio são a simplicidade e características quantitativas. O Evans Blue, podem ser extraídos a partir de tecidos por incubação de uma quantidade específica de tecido em formamida. Evans Blue é a absorvância máxima a 620 nm e a absorvência é mínima a 740 nm. Utilizando uma curva padrão para o azul de Evans, medições da densidade óptica pode ser convertida em miligrama de corante capturado por miligrama de tecido. A análise estatística deve ser usado para avaliar diferenças significativas na permeabilidade vascular.

Introdução

Formação e manutenção de barreiras permeáveis ​​selectivos são essenciais para o desenvolvimento do órgão apropriado e ^1,2 desempenho. Linha de células endoteliais do lúmen do vaso sanguíneo e formar uma barreira semi-permeável, que é essencial para o transporte selectivo entre o sangue e o espaço intersticial de todos os órgãos. Uma barreira de permeabilidade adequada é mantida através apertados célula-a-célula junções que são estritamente controladas por factores de crescimento, citoquinas e moléculas de stress outros produtos ^3. O rompimento da barreira de células endoteliais pode resultar em aumento da permeabilidade vascular e de fuga. Estes efeitos são observados em vários estados de doença e a compreensão da sinalização sublinhado molecular requer métodos multidisciplinares ^4,5. Neste artigo, descreve um método in vivo para medir a permeabilidade vascular utilizando um modelo de rato.

O ensaio que se descreve, também conhecido como ensaio de Miles, é uma bem establtada método para testar a permeabilidade vascular in vivo. O ensaio baseia-se no facto de que, sob condições fisiológicas basais, a albumina não atravessa a barreira endotelial. Azul de Evans, um corante azóico com elevada afinidade para a albumina, é injectado na corrente sanguínea de um animal experimental e, sob condições fisiológicas, é esperado para ser restringida dentro dos vasos sanguíneos. Quando um estímulo permeabilidade vascular é adicionado, quer por aplicação tópica ou sistemicamente, os vasos sanguíneos começar a vazar proteína e, assim, também o azul de Evans, que se liga à albumina. Isto resulta numa coloração rápida azulada dos tecidos que têm vasos permeáveis.

Injecção com êxito do corante na veia da cauda do rato lateral é crítica para o bom resultado do experimento. Técnica de injecção da veia da cauda requer prática extensiva e deverá ser dominadas antes de se iniciar a experiência.

Permeabilidade vascular é altamente dependente da idade e do peso do umImal, então quando comparando diferentes linhagens de camundongos, é imperativo que os ratos ou outros assuntos de teste têm perto de datas de nascimento e peso idênticos. Outros factores que influenciam a permeabilidade da barreira endotelial são condições ambientais, tais como temperatura, humidade, e muito importante, o stress manuseamento do rato. Devido ao grande número de fatores que podem influenciar o resultado do experimento, é sempre aconselhável que o experimento é repetido pelo menos três vezes e análise estatística realizada.

Este ensaio pode ser utilizado para comparar a permeabilidade ou vaso de ratos que foram geneticamente modificadas, bem como os ratos com diferentes antecedentes genéticos. A permeabilidade pode ser determinada na presença ou na ausência de um estímulo, dependendo da função do gene, que é modulada. Este ensaio também pode ser usado ou para testar o efeito de diferentes compostos sobre a permeabilidade do vaso.

Protocolo

1. Injecção intravenosa de azul de Evans na veia da cauda do rato Lateral

1. Prepara-se uma solução de 0,5% de azul de Evans estéril em PBS. Se necessário, esterilizar por filtração da solução para remover qualquer matéria particulada que não se dissolveu.
2. Aspirar 200 ul solução azul de Evans para uma seringa. Evitar as bolhas de ar que possam ter escapado para a seringa.
3. Coloque ratos que são de 8-12 semanas de idade para um dispositivo de retenção de modo a que o animal não seja livremente móvel, mas a cauda podem ser manipulados.
4. Colocar o dispositivo de retenção do rato sobre o seu lado, de modo a veia lateral da cauda é facilmente visível e está virada para cima.
5. Segure a cauda com a mão não-dominante entre o polegar eo dedo indicador.
6. Inserir a agulha (calibre pequeno, 27-30) a uma antecedência 10-15 graus de ângulo, bisel para cima, para dentro da veia lateral da cauda na direcção da cabeça. Manter o paralelo agulha e seringa para a cauda.
7. Do não aplicar pressão para trás para confirmar a colocação correta, pois isso poderia entrar em colapso da veia.
8. Lentamente injetar 200 ul Evans solução azul na veia da cauda do rato.
9. Observar a facilidade com que os avanços de êmbolo, tal como esta é a prova da correcta colocação da agulha na veia.
10. Coloque o mouse em sua gaiola e observá-lo durante 30 minutos.

2. Recolha de órgãos e Extração de azul de Evans dos Órgãos

1. Sacrificar os animais por deslocamento cervical. Para fins de ensaio Miles deslocamento cervical é recomendada, uma vez que limita a interferência significativa com a permeabilidade vascular. Sacrificar todos os ratinhos, ao mesmo tempo, tão rápido quanto possível. Trabalhar com grupos de 6 ratinhos ou menos, porque logo após os vasos sanguíneos se tornam mais permeáveis ​​morte.
2. Coloque os ratos em suas costas e fixar os pés em uma placa branca.
3. Abra a cavidade abdominal e torácica para expor thorórgãos Acic e abdominal.
4. Tire fotos representativas para mostrar diferenças em Evans extravasamento Azul. Incluir todos os ratos no mesmo campo, a fim de ter condições de iluminação idênticas para todos os ratos.
5. Coletar órgãos de interesse e colocá-los em tubos de 1,5 ml
6. Pesar um tubo vazio e levar o valor do equilíbrio de zero.
7. Transfira a amostra de tecido e peso,. Repetir para todas as amostras de tecido. Os tecidos podem ser secos ao ar para eliminar a variabilidade teor de água entre os diferentes órgãos.
8. . Adicionar 500 ul de formamida a cada tubo de amostra de tecido.
9. Transferir todos os tubos para um banho de água 55 ° C ou bloco de calor. Incubar durante 24-48 h, para extrair Azul de Evans do tecido.

3. Quantificação de azul de Evans extravasado no tecido intersticial

1. Centrifugar a formamida / azul de Evans mistura a pelota quaisquer fragmentos de tecido remanescentes.
2. Medir a absorvância a 610nm. Use 500 Formamida ul como em branco.
3. Calcular ng Azul de Evans extravasado por mg de tecido.
4. Traçar todos os dados em um gráfico.
5. Realizar a análise estatística para determinar diferenças significativas.

Resultados

Foi utilizado um ensaio in vivo para testar a permeabilidade vazamento navio em ratinhos de 8-12 semanas de idade. Este teste é útil para comparar a permeabilidade vascular relativa entre animais de fundo genético diferente ou em uma única estirpe de ratos submetidos a tratamentos que afectam a vasculatura. Os nossos resultados mostram que a estirpe de murganhos geneticamente modificados, criados no nosso laboratório tem um endotélio mais permeável em comparação com ratinhos de tipo selvagem. ...

Discussão

Permeabilidade vascular é um marcador para o estado fundamental do vaso sanguíneo. Aumento da permeabilidade vascular tem mostrado estar presente em várias doenças sistémicas, incluindo a diabetes, a hipertensão, e doenças auto-imunes ^6,7,8. Aumento da permeabilidade vascular tem sido mostrado para ser mediada por tensão de corte, os factores de crescimento tais como o factor de crescimento endotelial vascular e factor de crescimento de fibroblastos, os mediadores inflamatórios tais como histamina, s...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTES
Azul de Evans	SIGMA	E2129
FORMAMIDA	INVITROGEN	15515-026
PBS			Fosfato 0,2 M 1,5 M NaCl pH 7,4
			EQUIPAMENTOS
ESPECTROFOTÔMETRO	EPPENDORF	952000006
Dispositivo de retenção MOUSE	Harvard Apparatus	340012
SERINGA	BD	309659
AGULHAS	BD	305106	O calibre da agulha depende do tamanho do animal.
BALANÇO	Denver Instrument	TP-64