Imunoprecipitação da Cromatina eficiente usando Limitando quantidades de biomassa

Resumo

Nós descrevemos um método robusto para cromatina imunoprecipitação utilizando células T primárias. O método baseia-se em métodos normais, mas utiliza um conjunto específico de condições e reagentes que melhoram a eficiência de uma quantidade limitada de células. Importante, é apresentada uma descrição detalhada da fase de análise de dados.

Resumo

Cromatina imunoprecipitação (CHIP) é um método amplamente utilizado para determinar as interações entre diferentes proteínas com o DNA na cromatina de células vivas. Exemplos incluem sequências específicas de DNA de ligação fatores de transcrição, histonas e seus diferentes estados de modificação, enzimas como RNA polimerases e fatores auxiliares e componentes de reparação do ADN. Apesar de sua onipresença, há uma falta de up-to-date, metodologias detalhadas para ambos banco preparação do material e para a análise precisa permitindo métricas quantitativas de interação. Devido a esta falta de informação, e também porque, como qualquer imunoprecipitação, as condições devem ser re-otimizado para novos conjuntos de condições experimentais, o ensaio chip é suscetível a resultados imprecisos ou mal quantitativa.

Nosso protocolo é em última análise, derivada do trabalho seminal no fator de transcrição: interações DNA ^1,2, mas incorpora uma série de melhorias para sensibilizantesvidade e reprodutibilidade para os tipos de células de difícil obtenção. O protocolo foi utilizado com sucesso ^3,4, ambos utilizando qPCR para quantificar o enriquecimento do ADN, ou uma variante usando semi-quantitativa do protocolo abaixo.

Esta análise quantitativa de material amplificado por PCR é realizada computacionalmente, e representa um factor limitante no ensaio. Controlos e outras considerações importantes incluem a utilização de um isotipo do anticorpo, bem como a avaliação de uma região do ADN genómico de controlo, tal como uma região intergénica não predito para ser ligado pela proteína sob estudo (ou antecipados não apresentam alterações ao abrigo as condições experimentais). Além disso, uma curva padrão de material de entrada para cada amostra de chip é usada para determinar os níveis absolutos de enriquecimento do material experimental. Uso de curvas padrão ajuda a levar em conta as diferenças entre conjuntos de primers, independentemente de como eles são projetados com cuidado, e também a eficiência diferemcias em toda a gama de concentrações de modelo para um único conjunto de primers. Nosso protocolo é diferente de outros que estão disponíveis ^5-8 em que extensivamente cobrir a, fase posterior análise.

Protocolo

1. Isolamento de mouse Esplenopatias Naïve células T CD4

1. Sacrificar o mouse em uma forma humana consistente com o uso do Comité (IACUC) protocolos institucionais Cuidados e Animal. Dissecar o baço e colocá-lo em uma placa de Petri contendo 10 ml de DMEM com 10% de FBS.
2. Esmagar o baço usando fosco extremidades de duas lâminas de vidro para liberar os esplenócitos. Transferência da suspensão de células num tubo cónico de 15 ml.
3. Recolher as células por centrifugação a 200 xg (~ 1200 rpm durante uma centrífuga clínica típica, com um diâmetro do rotor) durante 5 min a 4 ° C.
4. Ressuspender as células em 2 ml de tampão ACK para lisar as células vermelhas do sangue, 1 min, à temperatura ambiente (RT). Parar a reacção pela adição de 8 ml de DMEM com FBS.
5. Recolher as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
6. Ressuspender as células em 5 ml de DMEM contendo FBS e passar através de um filtro de malha de 70 (BD Falcon, Cat # 352350). Contar as células e procederpara o isolamento de células T CD4 + naive, utilizando um kit de isolamento de CD4 (Miltenyi, Cat # 130-095-248), utilizando as instruções do fabricante. Recolher as células T CD4 + naive por centrifugação a 200 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células em 10 ml de DMEM com FBS.

2. Preparação da cromatina

1. Adicionar 37% de formaldeído até uma concentração final de 1% para a suspensão de células em DMEM e agitar suavemente à temperatura ambiente (por exemplo, usando um Nutator) durante 15 minutos para reticular ADN: proteína.
2. Parar de reticulação por adição de 1 M de glicina para uma concentração final de 125 mM. Continuar a agitar durante 5 min à TA.
3. Recolher as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min a 4 ° C.
4. Lave as células por ressuspensão em 5 ml de inibidores de protease de gelados contendo PBS. Lavar com inibidores de PBS gelado contendo protease 3 vezes no total e recolher as células por centrifugação a 4 ° C.
5. Ressuspender as células em 1 mltampão de lise celular gelado contendo inibidores de protease. Incubar no gelo por 15 min. A eficiência da lise das células pode ser determinada por ressuspensão uma pequena alíquota de células em solução de 0,4% de azul de tripano (Sigma, Cat # T8154) e observando-se com um microscópio.
6. Recolher os núcleos por centrifugação a 200 xg (tipicamente ~ 1200 rpm) durante 5 min a 4 ° C. Descartar cuidadosamente o sobrenadante.
7. Ressuspender o núcleos em 500 ul de tampão de lise nuclear contendo inibidores de protease. Incubar no gelo por 15 min.
8. Sonicate as células usando um Sonicator Misonix 3000, a sonda tamanho 1,6 milímetros: Nível de saída 4, 15 seg explosão, quatro vezes no gelo. Cada amostra deve ser resfriado em gelo por 1-2 minutos antes sonicando-lo novamente para evitar o superaquecimento das amostras. O sobreaquecimento pode provocar a reversão das ligações transversais.
9. Centrifugar a cromatina sonicado a 16.000 xg (~ 13.200 rpm numa microcentrífuga) durante 5 min a 4 ° C.
10. Dê uma alíquota de 20 mL de supern claroatant, adicionar corante de carga de ADN e verificar o DNA sonicado por electroforese através de um gel de agarose a 2% (tamanho ideal do DNA sonicado para a maioria das aplicações é de 200-500 pb).
11. Determinar a concentração de ADN, utilizando um espectrofotómetro de UV. Cromatina cortado pode ser usado imediatamente para configurar reação de imunoprecipitação da cromatina ou armazenadas a -80 ° C. Normalmente obtemos 7,5-10 DNA mg 2-3 x 10 ⁶ células T CD4 purificadas por mouse.

3. Cromatina imunoprecipitação (todos os passos devem ser realizados a 0-4 ° C)

1. Diluir cromatina sonicado a uma concentração de ADN de ug / ml 5-10 (volume total = 1 ml) em tampão de diluição de chip com os inibidores da protease.
2. Guardar 100 ul (10%) como entrada. Guarde no gelo.
3. Alíquota de 450 mL em cada dois tubos de 1,7 ml de microcentrífuga rotulados como controle de isotipo (rato ou coelho IgG) e anticorpos de interesse. Se forem usados ​​vários anticorpos do mesmo isotipo, um único isotipo control serão suficientes para realizar esta análise. Você vai precisar de vários controles isotipo se os anticorpos de uma fonte animal diferente ou isotipo são usados.
4. Adicionar 2-5 ug de um anticorpo específico, dependendo da especificidade do anticorpo utilizado, ou controlo de isotipo para os respectivos tubos.
5. Balançar os tubos utilizando uma Nutator a noite a 4 ° C para permitir a formação de complexos anticorpo-cromatina.
6. Adicionar 25 ul de proteína G esferas magnéticas (01:01 suspensão dos grânulos em suspensão) à mistura acima e deixa-se agitar durante pelo menos 2 horas a 4 ° C. Beads do nosso fornecedor pode ser usado diretamente.
7. Colocar os tubos de microcentrífuga com um suporte magnético e permitem que as esferas se recolher no lado magnetizado.
8. Remova cuidadosamente a solução por aspiração, sem perturbar as contas.
9. Adicionar 1 ml de solução de lavagem baixo sal e deixe balançar suavemente durante 5 min em um Nutator. Recolher os grânulos utilizando um suporte magnético e remover a solução de lavagem. Repetir uma vez.
10. Adicionar 1 ml de solução de lavagem de alto sal e deixa-se agitar durante 5 minutos num Nutator. Recolher os grânulos utilizando o suporte magnético e remover a solução de lavagem. Repetir uma vez.
11. Adicionar 1 ml de solução de lavagem de cloreto de lítio e deixa-se agitar durante 5 minutos num Nutator. Recolher os grânulos utilizando o suporte magnético e remover a solução de lavagem. Repetir uma vez. A utilização de LiCl melhora a remoção eficaz de cromatina interacções não específicas com os grânulos.
12. Adicionar 1 ml de solução TE e deixar agitar durante 5 min num Nutator. Recolher os grânulos utilizando o suporte magnético e remover a solução de lavagem.
13. Eluir o ADN a partir das pérolas por adição de 250 ul de tampão de eluição. Rocha por 15 min em temperatura ambiente. Pipeta fora o fluido e guardar este material em um novo microtubo de 1,7 ml. Repita mais uma vez e combinar ambos os eluições. Descarte as contas.
14. Para inverter as ligações cruzadas adicionar 5 M de NaCl a uma concentração final de 0,3 M e 1 ml de RNase A (20 m g / ml) para o DNA eluído. Adicionar 400 ul de tampão de eluição, para as entradas de salvas no passo 3.2, até perfazer o volume de 500 uL. Para adicionar as entradas de NaCl a 0,3 M, 1 ml de RNase A, 10 ul de EDTA 0,5 M, 20 ul de 1 M de Tris-HCl a pH 6,5 e 1 jil de proteinase K (20 mg / ml).
15. Incubar os tubos durante a noite a 65 ° C num bloco de aquecimento a seco. Para evitar a evaporação de amostras, um selo ou colocar um peso sobre os tubos para mantê-los a partir da abertura. Um forno de hibridação podem também ser usados.
16. Deixe os tubos legais para RT. Adicionar 1 ml de etanol a 100% e incubar 2 horas durante a noite, à temperatura de -80 ° C para precipitar o ADN.
17. Centrifugar os tubos a 16.000 xg durante 15 min para sedimentar o ADN. Lava-se a pelete de ADN uma vez com etanol a 70% e secar ao ar o sedimento. Ressuspender o sedimento de DNA em 100 ul de água destilada autoclavada.
18. Purifica-se o ADN utilizando colunas QIAquick e elui no volume total de 50 ul de tampão de eluição. Este ADN está pronto para utilização para a PCR.

"> 4. Preparação da reação de PCR (Todas as etapas devem ser realizadas on Ice)

1. Recolha todas as amostras de DNA de amostras de entrada chip e correspondente. Além disso, a recolha de todos os reagentes e os iniciadores de PCR para a região alvo, bem como uma região de controlo. Usar um "HotStart" Taq DNA polimerase. Vamos utilizar um ensaio à base de SYBR Green para quantificar a amplificação do ADN, neste procedimento, mas qPCR mastermix kits podem ser usadas se necessário.
2. Fazer uma diluição em série de ADN de entrada para gerar uma curva-padrão na análise de qPCR: por exemplo, 10%, 1%, 0,1% e 0,01% em tampão de eluição (a partir das colunas QIAquick na etapa 3.18). A gama de concentrações e de incremento deste conjunto de molde da curva padrão pode variar com base nos níveis esperados de enriquecimento de chip, etc Dispensar 10 pi de amostras de ADN de entrada nos respectivos poços de uma placa de 96 poços (Genemate, cat # T-3182-1 ), em duplicata.
3. Pipetar 10 ml de DNA de ChIP de controlo de isotipo, bem como um anticorpo específico no respectivopoços, em triplicado.
4. Faça uma "master mix", contendo tanto primers alvo ou primers de controle (0,1 mM concentração final de cada primer) e dispensar 10 ml em respectivos poços. Por exemplo, no modelo abaixo dispensar mistura mestre contendo iniciadores específicas em poços de cor verde e dispensar mistura principal com os iniciadores de controlo nos poços marcados a vermelho.
5. Cobrir a placa com película de PCR de vedação de plástico óptico e centrifugar a 500 xg numa centrifugadora clínica (~ 1200 rpm) durante 1 min à temperatura ambiente para recolher tudo na parte inferior do poço.
6. Iniciar a reacção da PCR. Usaremos o LightCycler 480 II (Roche) operando 480SW 1.5 software LightCycler para executar o qPCR neste exemplo.

Pré-incubação: um ciclo: 95 ° C / 5 min.

Amplificação: 40-45 ciclos de: 94 ° C / 5 seg, 60 ° C / 5 seg, 72 ° C/10 seg (a temperatura de recozimento deve ser de 2-3 ° C a menos do que a temperatur fusãoe um dos iniciadores).

Curva de fusão: 1 ciclo.

Refrigeração: 1 ciclo.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

10% de entrada

10% de entrada

Isotype

Específico

B

1% de Entrada

1% de Entrada

Isotype

Específico

C

0,1% de Entrada

0,1% de Entrada

Isotype

Específico

D

0,01% de entrada

0,01% de entrada

E

10% de entrada

10% de entrada

Isotype

Específico

F

1% de Entrada

1% de Entrada

Isotype

Específico

G

0,1% de Entrada

0,1% de Entrada

Isotype

Específico

H

0,01% de entrada

0,01% de entrada

Verde: Use primers região de destino.

Vermelho: Use o controle de primers região.

5. Análise

1. Programa do software qPCR para a quantificação das quantidades absolutas do ADN. Mais importante, a utilização de uma curva padrão para interpolar quantidades de ADN nas amostras específicas de isotipo e desconhecidos permite a avaliação e combinando da qualidade e eficiência de todo o iniciador se ajusta sobre a gama de concentrações encontradas nas amostras. Além disso, também proporciona uma more método fiável para converter os valores Cq (C ou C _{t p)} para enriquecimento relativo resulta de dobragem finais que usingΔΔCq e métodos relacionados.
2. Ir para o editor de amostra e marcam os poços que contêm as amostras de entrada de várias diluições (10%, 1%, 0,1% e 0,01%), com os valores da curva padrão. Rotular também os poços com amostras de chip desconhecidos, exatamente como a placa de PCR é colocado para fora. Em software equivalente utilizado em outras máquinas qPCR, designar subconjuntos correspondentes às reações para cada par de primers, o valor de curva padrão e amostra de controlo experimental e isotipo conformidade.
3. No software LightCycler, ir para o editor subconjunto e marcar os subconjuntos, incluindo os poços com amostras de entrada, bem como as amostras de aparas de desconhecidos. As amostras desconhecidas será quantificado utilizando a curva padrão gerada a partir das concentrações conhecidas de amostras de entrada para a análise. Em software equivalente utilizado em outras máquinas qPCR, designado subconjuntos corresponding para todas as reacções para cada um dos pares de iniciadores.
4. Após a amplificação por PCR é completa, realizar a análise com "Abs Quant/2nd Derivative Max" e selecionar o subconjunto para análise e pressione OK. No software equivalente utilizado noutras máquinas de qPCR, converter o valor Cq à quantidade de ADN em cada um dos subconjuntos.
5. Pressione "Calcular" que irá gerar a curva padrão utilizando concentrações conhecidas de amostras de entrada e mostrará que a quantidade absoluta de ADN presente nas amostras desconhecidas.
6. Se a qualidade do DNA cortado é bom, e se os iniciadores ligar-se especificamente à região alvo, a eficiência da PCR deveria ser próximo de 2.
7. Realizar uma análise de curva de fusão com "Tm Calling" para o mesmo subconjunto, se disponível. Um único pico indica que apenas um produto específico foi amplificado. A amplificação de DNA específica pode ser também testada por electroforese do produto de PCR, juntamente com a escada de DNA através de um gel de agarose.
8. Exportar dados como um guia-arquivo de texto delimitado, que pode ser aberto no Microsoft Excel para análise posterior.
9. Usando o Microsoft Excel, dividir a quantidade de DNA para o anticorpo específico com o controle de isotipo de primers específicos. Repita este passo para os primers da região de controle. Se forem usados ​​vários anticorpos do mesmo isotipo para diferentes imunoprecipitações, normalizar cada uma delas com os valores do mesmo controlo de isotipo. Além disso, se os pares de iniciadores múltiplos orientados são utilizadas, as quantidades de ADN a partir de um único conjunto de pares iniciadores de controlo deve ser utilizada para a normalização de cada alvo (Figuras 1 e 2). Os valores de saída representa o anticorpo imunoprecipitação enriquecimento vezes em cada local específico em relação ao fundo de imunoprecipitação anticorpo não específico.
10. Divida o enriquecimento vezes (para isotipo controle) para primers alvo, com o enriquecimento de vezes (para isotipo controle) para controle de primers região para obter enriquecimento relativo a umaregião não acoplado controlo (Figura 1). Importante, notar que por causa da geração de curvas padrão com o ADN total de entrada para cada amostra, cada um dos valores de imunoprecipitação acima interpolada a partir das curvas padrão já estão normalizados para, e expressa como a fracção do total de entrada de pelo software da máquina.
11. Se o rigor dos tampões utilizados para imunoprecipitação ou lavagem é demasiado alta, é possível que a amplificação a partir de amostras robusto imunoprecipitadas com anticorpos específicos pode ser observada, enquanto que a amplificação a partir de amostras de controlo de isotipo imunoprecipitadas não serão observadas. Em tal cenário, é melhor para subtrair a quantidade de chip de controle Isotype de chip anticorpo específico, tanto para a região alvo ea região não ligado. Enriquecimento relativa pode ser calculada dividindo a diferença para a região alvo, por diferença para a região não ligado (Figura 3).

Resultados

A cromatina imunoprecipitação (CHIP) protocolo apresentado aqui controles para as diferenças, se houver, na quantidade de DNA utilizado na PCR através da utilização de um par de primers que amplifica uma região do genoma não ligado, servindo, assim, como um "controle de carga". No exemplo mostrado na Figura 3, utilizou-se a região de codificação do gene de rato ACTB como uma região não acoplada para a proteína de interesse e o local de ligação ao factor de transcriçã...

Discussão

O protocolo acima fornece um método robusto de quantificar com precisão o enriquecimento do ADN a partir dos linfócitos primários usando chip. Uma das principais razões para a robustez deste protocolo é a inclusão da diversidade biológica repetições. O protocolo acima usa três repetições, o enriquecimento para os quais é calculado de forma independente. As saídas são então calculadas para fornecer um grau de enriquecimento e desvios padrão calculados para proporcionar uma medida de variabilidade. Para ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775	Store at RT
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30256.01	Store at 4 °C
Protease Inhibitor tablets	Roche	04693116001	Store at 4 °C
Protein G magnetic beads	Active Motif	101945	Store at 4 °C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	Store at -20 °C
Proteinase K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	Store at -20 °C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Store at -20 °C
1 M Glycine			Store at RT
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)			Store at 4 °C
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			Store at RT
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)			Store at 4 °C
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)			Store at 4 °C
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)			Store at 4 °C
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)			Store at 4 °C
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)			Store at 4 °C
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)			Prepare fresh
5 M NaCl			Store at RT
0.5 M EDTA			Store at RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5			Store at RT
Table of Specific Reagents
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	Model: 421105
Magnetic Stand	Promega	Z5342
Qiaquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Model: S3000
UV Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000
Heating Block	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Refrigerated bench top centrifuge	Beckman Coulter	Model: Allegra X-12R
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
Table of Equipment