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Method Article
Nós apresentamos uma técnica para etiquetar neurônios no sistema nervoso central (SNC) de Drosophila Embriões, o que permite a análise da morfologia neuronal ou por luz transmitida ou microscopia confocal.
Neste artigo vamos descrever como individualmente rotular neurônios no sistema nervoso central embrionário de Drosophila melanogaster por injecção juxtacellular do DiI marcador fluorescente membrana lipofílica. Este método permite a visualização da morfologia das células neuronais em grande detalhe. É possível marcar qualquer célula no sistema nervoso central: os corpos celulares dos neurónios-alvo são visualizadas sob óptica DIC ou por expressão de um marcador fluorescente tal como GFP genética. Após a marcação, o DiI pode ser transformado em um castanho mancha permanente por fotoconversão para permitir a visualização da morfologia das células, com luz transmitida e óptica DIC. Alternativamente, as células marcadas com DiI pode ser observada directamente em microscopia confocal, permitindo geneticamente introduzidos proteínas repórter fluorescentes a ser colocalised. A técnica pode ser usada em qualquer animal, independentemente do genótipo, tornando possível a análise fenótipos mutantes a resolução de células simples.
O conhecimento da morfologia neuronal ao nível das células individuais é um requisito chave para a compreensão da conectividade neuronal e função do SNC. Assim, desde os primeiros dias da neurociência, os pesquisadores têm procurado desenvolver técnicas única célula de rotulagem (ver 7 para um tratamento histórico da questão). Os métodos clássicos, tais como a coloração de Golgi proporcionar excelente resolução da morfologia neuronal, mas não são adequados, se se procura identificar um tipo específico de neurónios de uma forma dirigida, tal como a coloração ocorre de uma forma aleatória. O desenvolvimento de métodos para a coloração de células isoladas através de injecção intra celular ou juxtacellular de corantes a partir de um microeléctrodo dirigida a exigência de rotulagem específico.
A aplicação de uma única injecção de corante para neurónio Drosophila apresentou um desafio importante, devido ao tamanho pequeno de tanto o organismo e dos seus neurónios. No entanto, a coloração único neurónio de Drosophila embrionárias Neurônios foi alcançado em meados dos anos 1980 no laboratório de Corey Goodman 15. Enquanto o método tem sido eminentemente útil e forneceu algumas informações importantes sobre mecanismos de desenvolvimento neuronal em Drosophila ao longo dos últimos 20-30 anos (por exemplo, 2, 10), muitos trabalhadores têm se esquivado de que, em grande parte por causa de suas exigências técnicas.
A disponibilidade nos anos mais recentes de técnicas genéticas para a rotulagem de neurônios em Drosophila também tem contribuído para a impopularidade da injeção único neurônio corante. Expressão GAL4-dirigido de construções de membrana-alvo GFP pode fornecer excelente resolução de morfologia neural 1, 20. No entanto, este método tem certas limitações: a expressão muitas vezes inevitável da GFP em células múltiplas podem obscurecer a estrutura de neurónios individuais e um condutor da linha de GAL4 pode não estar disponível para conduzir a expressão de um neurónio particular de interesse. O MarcM (Análise de mosaico com um representantemarcador de células ressible) Método 8 pode fornecer a rotulagem de qualquer neurónio essencialmente ao nível da célula individual, mas não pode ser utilizada com sucesso no embrião e larvas cedo por causa da rotação lenta da proteína GAL80.
Dadas estas limitações de rotulagem genética, acreditamos que a injecção de corante único neurónio no embrião de Drosophila continua a ser uma técnica valiosa e merece uma aplicação mais ampla. Para promover este objectivo, oferecemos aqui uma descrição detalhada do método. Uma ilustração de sua energia é fornecida pela nossa recente de conta a morfologia do conjunto completo de interneurônios neuromeres abdominais do embrião de Drosophila tardio 14. Neste estudo, o que revelou a variabilidade tanto morfológica individuais tipos de células neuronais e os princípios da organização neuromere no SNC do embrião, não teria sido possível com qualquer outro método de marcação disponíveis.
Temos utilizado duas variantes ligeiramente diferentes do método único neurônio rotulagem em nossos laboratórios. As diferenças referem-se à colheita de embriões, dechorionisation, devitellinisation e passos de filetagem de embriões. Figura 1 apresenta uma visão geral das etapas comuns e divergentes das variantes.
1. Preparação de micro-agulhas de dissecção Embrião e Micropipetas para injeção Dye
2. Coleta, Montagem e Dissecção de Embriões
Devitellinisation filetagem e são feitas manualmente, utilizando qualquer um dos dois métodos descritos no 2.3A e 2.3b.
3. Enchimento de Micropipetas Injeção
Metade encher um Eppendorf de 0,5 ml com tubo de microcentrífugauma solução a 0,1% do corante carbocynanine DiI (Molecular Probes, Eugene, OR) em etanol a 100% (não deixe de utilizar EtOH "seca" de modo a evitar a precipitação DiI). Fazer um furo estreito na tampa do tubo e insira a ponta romba da micropipeta através do orifício na tampa. Permitir que o DiI ascender até o filamento durante pelo menos 5 min. (Sempre cobrir o furo na tampa quando não preenchendo uma micropipeta para evitar a evaporação do etanol).
O equipamento necessário para a injecção do corante neurónios (Figura 3).
Microscópio. Um microscópio de fase fixa deve ser utilizada para a injecção de corante neurónio, para evitar o movimento vertical do embrião durante a focagem. Qualquer movimento tal iria deslocar a pipeta depois de ter entrado em contacto com o embrião. Encontraram-se tanto a Zeiss Axioskop FS e os modelos de estágios Olympus AX50/BX50 fixas para ser bem adequado para esta finalidade. O microscópio deve ser equipado com luz transmitida DIC óptica para a visualização de neurons antes da coloração. O microscópio deve ser também uma posição vertical, em vez de um modelo invertido. Com um microscópio vertical, a ponta da micropipeta está no mesmo lado do embrião como o objectivo de visualização, enquanto que com um microscópio invertido os dois estão em lados opostos do embrião. O último arranjo compromete a qualidade da óptica DIC. O microscópio deve ser criado para microscopia de fluorescência, com um conjunto de filtros apropriados para a observação Dil. Desde DiI tem um espectro amplo comparativamente com excitação e pico máximo em 549 e 565 nm muitos conjuntos de filtros nesta faixa vai funcionar, por exemplo, os de Alexa 568, Cy3, rodamina, Red Texas ou TRITC. Embora seja conveniente para ajustar um obturador controlado electronicamente no caminho da fonte de luz de fluorescência, para permitir a operação do obturador, sem contacto das mãos com o microscópio, também eficazmente rotulada em uma configuração que só foi equipado com um disparador manual. Finalmente, uma ampliação elevada, alta numérica aperture objectiva de imersão em água é necessária para a observação durante a injecção. Este objectivo deve ser projetado para uso sem uma lamela. Temos utilizado com sucesso o Zeiss Achroplan 100x/1.0W, Olympus LUMPlan FL 100x/1.0W e Olympus LUMPlan FL / IR 60x/0.9 objetivos W.
Um micromanipulador é necessário para posicionar e mover a micropipeta durante neurónio injecção de corante. Nós temos utilizado tanto o micromanipulador Leica e um palco montado Narashige micromanipulador hidráulico de 3 eixos.
Um amplificador DC intracelular, com a facilidade de injecção de corrente, é necessário para a injecção de DiI iontoforética da micropipeta.
4. Procedimento para a injeção de contraste
5. Fotoconversão para Exame usando óptica DIC
O princípio da fotoconversão é a oxidação (foto-) de DAB pela luz fluorescente emitida pelas células coradas durante a iluminação com o comprimento de onda apropriado. Isto significa que as células vivas são photoconverted em tempo mais curto em comparação com as células fracamente coradas. Se várias células marcadas numa amostra difere muito quanto ao seu brilho isto pode levar a difficulties photoconverting em todos eles de qualidade mesma (ver Figura 4C): neste caso, pode-se decidir sobre um compromisso entre negligenciando as células mais fracas (com uma iluminação de curta) ou aceitar que as células vivas começam a inchar (usando mais iluminação) . Se todas as células são muito fracamente marcado (exigindo, portanto, a iluminação muito longa), de fundo causado por peroxidases endógenas podem tornar-se um problema. Desde DAB é tóxico que deve ser manuseado com cuidado. Os resíduos podem ser "desligado", com 7% de cloro de branqueamento.
6. Exame por microscopia confocal
A Figura 4 ilustra os resultados típicos da técnica, é descrita aqui. Figura 4A mostra um exemplo de um interneurônio DiI cheio único que foi limpa photoconverted. Ele demonstra muito bem a quantidade de detalhes estas oferecem preparações. Quando visto sob óptica DIC contexto espacial da célula marcada no interior do tecido não-rotulada envolvente se torna visível, por exemplo, a posição do corpo da célula dentro do córtex e da projecção de fibras dentro do ne...
Uma grande vantagem da Drosophila como sistema modelo é que ele permite a análise do desenvolvimento e função do nível de células únicas. Isto é especialmente útil em relação ao sistema nervoso, onde a diversidade de tipos de células é excepcionalmente elevada e a função e morfologia de células vizinhas pode ser totalmente diferente.
O método que apresentamos aqui permite a marcação de neurónios individuais, com um corante que pode ser transformada em uma mancha ...
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Este trabalho foi financiado por uma doação do DFG GMT
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nome do reagente / Material | Companhia | Número de Catálogo | Comentários |
REAGENTES | |||
DAB | Sigma-Aldrich | D-5905 | 2-3 mg / ml em 100 mM Tris-HCl, pH 7,4 |
DiI | Sondas Invitrogen / Molecular | D-282 | 1 mg / ml em etanol |
Formaldeído | Merck Millipore | 7,4% em PBS | |
Glicerina | Roth | 3783 | 70% em PBS |
Heptano Cola | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | diluir ca. 1 a 1 com n-heptano |
PBS | 1x | ||
TRIS | Roth | 4855 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
EQUIPAMENTOS | |||
Microscópio confocal | Leica | TCS SP2 | para visualizar e documentar bulas de fluorescência |
DC - ummplifier | Dragan Corporação | Cornerstone ION-100 | para executar as bulas |
Lamelas | Menzel | BB018018A1 | 18 x 18 mm |
Lamelas | Menzel | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
Dissecando microscópio | Leica | MZ8 | para preparar e disect embriões |
Plana Capilares | Hilgenberg | diâmetro exterior 1 mm; glas espessura 0,1 milímetros | |
Injeção Capilares | Produtos ciência | 100 GB TF 8P | |
R micromanipulador | Leica | para executar as bulas | |
Modelo P-97 | Sutter Instruments | para puxar capilares | |
Slides objeto | Marienfeld Superior | 1000000 | |
Microscópio científica | Zeiss | Axioskop 2 mot | para ver bulas após fotoconversão |
Microscópio científica | Olimpo | BX50 | para executar as bulas |
Câmera de vídeo Sony MC3255 | Sony / AVT Chifre | Sony MC3255 | para gravar rotulamentos após fotoconversão |
Tabela 1.
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