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Resumo

Ritmos circadianos voluntária rodas execução de atividade em mamíferos está intimamente ligado às oscilações moleculares de um relógio mestre no cérebro. Como tal, estes ritmos diários de comportamento pode ser utilizado para estudar a influência dos factores genéticos, farmacológicos e ambientais sobre o funcionamento deste relógio circadiano.

Resumo

Quando os roedores têm acesso livre a uma roda de corrida em sua gaiola, uso voluntário desta roda vai depender da hora do dia 1-5. Roedores noturnos, incluindo ratos, hamsters e ratos, são ativos durante a noite e relativamente inativo durante o dia. Muitas outras medidas comportamentais e fisiológicas também apresentam ritmos diários, mas em roedores, correndo rodas actividade serve como uma medida particularmente fiável e conveniente da saída do relógio circadiano mestre, o núcleo supraquiasmático (SCN) do hipotálamo. De um modo geral, por meio de um processo chamado de arrastamento, o padrão diário de execução rodas actividade irá, naturalmente, se alinham com o ciclo de claro-escuro do ambiente (ciclo LD; por exemplo, 12 horas de luz: 12 h-escuro). No entanto ritmos circadianos são gerados endogenamente padrões de comportamento que apresentam um período de ~ 24 horas, e persistem na escuridão constante. Assim, na ausência de um ciclo LD, a gravação e análise de funcionamento da roda-actividade podeser utilizado para determinar o tempo subjectivo do dia. Porque estes ritmos são dirigidos pelo relógio circadiano no subjectivo da hora do dia, é referido como o tempo circadiano (CT). Em contraste, quando um ciclo LD está presente, a hora do dia, isto é determinado pelo ciclo LD ambiental é chamado o tempo zeitgeber (ZT).

Embora os ritmos circadianos em funcionamento roda-atividade são geralmente ligados ao relógio SCN 6-8, osciladores circadianos em muitas outras regiões do cérebro e do corpo 9-14 também poderiam estar envolvidos na regulação dos ritmos de actividade diária. Por exemplo, ritmos diários de alimentos antecipatória actividade não requerem o SCN 15,16 e em vez disso, estão correlacionadas com alterações na actividade de SCN-extra osciladores 17-20. Assim, as gravações de execução rodas actividade pode fornecer informação comportamental importante, não só sobre a saída do relógio mestre SCN, mas também da actividade de SCN-extra osciladores. Abaixo descrIBE o equipamento e os métodos utilizados para registrar, analisar e exibir ritmos circadianos de atividade locomotora em roedores de laboratório.

Protocolo

1. Alojamento dos animais

  1. Cage: A fim de registrar a atividade corrida rodas de um roedor individual, cada gaiola deve abrigar um roedor e única corrida rodas. Porque rodas de corrida pode ser considerado uma forma de enriquecimento, todos os roedores em qualquer estudo devem ter acesso semelhante a uma roda de corrida.
  2. Mudanças cama: manejo dos animais, bem como alterações em gaiolas ou roupa de cama todos podem ter não fóticos efeitos sobre os ritmos circadianos 21-23, assim, as gaiolas com malha de piso são ideais porque eles minimizar o contato com o animal. Não obstante a disponibilidade de tal uma bandeja de sistema, mudanças cama devem ser evitados durante fases críticas de um experimento. As alternativas incluem uso da cama mais duradouro, o que permitiria mais mudanças gaiola pouco frequentes, ou gaiolas de mudança em uma programação pseudo-aleatório.
  3. Caixas de isolamento: gaiolas devem ser guardados em caixas de isolamento de som que são atenuadas, luz co-ntrolled, e bem ventilado. Dependendo do tamanho e configuração das caixas de isolamento, o número de gaiolas dentro de cada caixa variará tipicamente de 1-8. Quando abrigando várias gaiolas em uma caixa de isolamento único, um deve estar ciente de que vários odores e sons vindos de outros animais pode ter efeitos de confusão sobre o comportamento circadiano de animais individuais. Para evitar esses problemas, deve-se tentar abrigar uma gaiola por caixa de isolamento.
  4. Ventilação: fluxo de ar adequado é fundamental para fazer as caixas de um ambiente confortável casa para roedores. O ventilador em cada caixa deve ser coberto, de modo a evitar que a luz de fora da área de atingir o interior. Além disso, os fãs vão tipicamente retirar o ar da caixa e explodi-lo para o quarto. Pequenas à prova de luz aberturas permitem a entrada de ar nas caixas de isolamento a partir de vários pontos, e ajuda a evitar brisas desconfortáveis. A fim de verificar se há ventilação adequada, a temperatura no interior da caixa de isolamento (quandofechado, durante várias horas, com as luzes acesas) deve ser virtualmente idêntico ao da temperatura da sala em que está inserido.
  5. Iluminação: a intensidade da luz ambiente deve ser o mesmo em todas as jaulas. Organizar uma única luz em um local semelhante acima de cada gaiola, e use sempre a mesma marca / tipo de lâmpada. Use iluminação de intensidade moderada (100-300 lux) ao nível gaiola. Evite níveis de iluminação excessivamente altas, que são mais susceptíveis de produzir alterações diretas sobre o comportamento atribuíveis à luz em vez de o sistema circadiano, per se (máscara, por exemplo).
  6. Escuridão / luz vermelha ofuscante: Se é necessário para tratar ou tratar os animais no escuro (por exemplo, na escuridão constante ou noturno), óculos de visão noturna deve ser usado. Alternativamente, porque o sistema circadiano é relativamente insensível ao vermelho-comprimentos de onda, a iluminação vermelha fraca pode ser usado. A luz vermelha específica que você usa deve ser testado para garantir que ele não Alter actividade corrida rodas (mascaramento, por exemplo) ou ajustar o relógio circadiano (por exemplo, produzir uma mudança de fase).

2. Coleta de dados (veja a Figura 1 - Vitalview configuração de hardware)

  1. Correndo rodas: o diâmetro ea ergonomia da roda de corrida irá mudar a quantidade de uso de 24. Assim, o uso rodas menores e mais leves para ratos, e maiores rodas mais pesadas para ratos. Ao lavar e re-instalar rodas, assegurar que as rodas são capazes de girar sem obstáculos, não "cambalear", e que a gravação micro-interruptores são ativados por cada volta da roda.
  2. Micro-chaves: cada revolução da roda de corrida deve ativar um magnético ou mecânico micro-interruptor. Informações do micro-interruptor é transmitido através de um canal único e registadas por um computador que pode bin os dados ao longo do tempo (por exemplo, a cada 2, 5, 6, ou 10 minutos).
  3. Hardware do computador: Nossa running rodas gravações são feitas com Vitalview, uma plataforma de hardware e software desenvolvido pela Mini Mitter ( http://www.minimitter.com/vitalview_software.cfm ). No entanto, existem outras plataformas de gravação, tais como ClockLab, desenvolvido pela Actimetrics ( http://www.actimetrics.com/ClockLab/ ). Ambas as plataformas reunir dados de várias fontes de canal único (por exemplo, um micro-interruptor único ativado por uma única roda em execução) em um arquivo único computador. Os dados de canais individuais pode então ser representada e analisada separadamente numa data posterior.

3. Gravações de dados

  1. Arquivos: As plataformas de software acima mencionados podem ser usados ​​para separar canais únicos para que os arquivos individuais são criados para cada registro de funcionamento da roda. Esses dados são melhor visualizados e gráficos com especial designeprogramas tais como d ActiView (Minimitter, Bend, OR), Circadia ou Clocklab (Actimetrics, Wilmette, IL), que podem produzir e periodogramas actograms. No entanto, canal único arquivos também podem ser abertos e analisados ​​utilizando programas de planilhas gerais, tais como Excel (Microsoft, Redmond, WA).
  2. Calculando Tempo Circadiano (TC): CT 12 é, por definição, o início da execução da roda-actividade em roedores noturnos. Em paralelo com o dia 24 hr, por convenção, um dia circadiano é dividido em 24 hr circadiano. Por conseguinte, se o período de funcionamento livre circadiano é 24 hr 30 min, medido pelo relógio de parede, CT 0 ocorrerá aproximadamente 12 h 15 min, depois CT12.

Resultados

  1. Programas de computador: programas de computador especializados são normalmente utilizados na geração de actograms e do cálculo do período circadiano. Estes programas incluem, mas não estão limitados a, ActiView (Minimitter, Bend, OR) e Circadia.
  2. Actograms: Actograms fornecer uma ilustração gráfica dos padrões diários de funcionamento da roda-actividade. Há um único traçado (eixo x = 24 h) e duplo traçado (eixo x = 48 h) actograms. Ambos os métodos dias enredo seqüenciais de...

Discussão

Monitoramento ritmos de actividade diária usando rodas de corrida é o método mais utilizado e confiável para avaliar a saída do relógio circadiano mestre em roedores noturnos. Roda de rodagem de actividade, no entanto, é apenas um dos muitos aspectos do comportamento e fisiologia que pode ser monitorado continuamente. Embora a grande maioria de corrida rodas actividade ocorre durante a noite, ao longo de 30% do total de vigília ocorre durante o dia 25,26. Outros parâmetros podem ser usados ​​para...

Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer prêmios salariais, subsídios de equipamentos e fundos operacionais das Fonds de la recherche en santé Québec (FRSQ), Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia Council of Canada (NSERC), e da Concordia University Program Research Chairs (Cruc), bem como o feedback pensativo sobre este manuscrito do Dr. Jane Stewart.

Materiais

Nome do reagente Empresa Número de catálogo Comentários (opcional)

NameCompanyCatalog NumberComments
Vitalview Card & Software Mini Mitter # 855-0030-00 (Bend, OR, EUA)
DP24 Dataport Mini Mitter # 840-0024-00 (Bend, OR, EUA)
QA4 Módulo Mini Mitter # 130-0050-00 (Bend, OR, EUA)
Chave Magnética Mini Mitter # 130-0015-00 (Bend, OR, EUA)
Montagem C-50 Cable Mini Mitter # 060-0045-10 (Bend, OR, EUA)
Rato correndo conjunto da roda Mini Mitter # 640-0700-00 (Bend, OR, EUA)
Apoio Cage e bandeja Mini Mitter # 640-0400-00 (Bend, OR, EUA)
Utilizável cortar gaiola Mini Mitter # 664-2154-00 (Bend, OR, EUA)
Piso de grade para gaiola Mini Mitter # 676-2154-00 (Bend, OR, EUA)
Bandeja de Resíduos Mini Mitter # 684-2154-00 (Bend, OR, EUA)
Lâmpada habitação Microlitos Científico # R-101 (Toronto, ON, Canadá)
4V lâmpadas fluorescentes Microlitos Científico # F4T5/CW (Toronto, ON, Canadá)
Isolamento câmaras Custom construído 28 "H x 20" W x 28 "D ½" Black melamina.

Referências

  1. Pittendrigh, C. S., Daan, S. A Functional Analysis of Circadian Pacemakers in Nocturnal Rodents. V. Pacemaker Structure: A Clock for All Seasons. J. Comp. Physiol. 106, 333-355 (1976).
  2. Pittendrigh, C. S., Daan, S. A Functional Analysis of Circadian Pacemakers in Nocturnal Rodents. IV. Entrainment: Pacemaker as Clock. J. Comp. Physiol. 106, 291-331 (1976).
  3. Pittendrigh, C. S., Daan, S. A Functional Analysis of Circadian Pacemakers in Nocturnal Rodents. III. Heavy Water and Constant Light: Homeostasis of Frequency?. J. Comp. Physiol. 106, 267-290 (1976).
  4. Pittendrigh, C. S., Daan, S. A Functional Analysis of Circadian Pacemakers in Nocturnal Rodents. II. The Variability of Phase Response Curves. J. Comp. Physiol. 106, 253-266 (1976).
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