Ensaio Escolha Vertical labirinto em T para a resposta de Artrópodes para odores

Resumo

A vertical, olfatômetro labirinto em T é descrito para o ensaio da resposta comportamental de artrópodes. O olfactómetro permite que o experimentador para medir escolhas realizadas por indivíduos de teste quando submetidos a dois campos de odor potencial. Ambos atração e repulsão de odores pode ser medida com este dispositivo.

Resumo

Dada a importância econômica dos insetos e aracnídeos como pragas de culturas agrícolas, ambientes urbanos ou como vetores de doenças de plantas e humanos, várias tecnologias estão sendo desenvolvidas como ferramentas de controle. Um subconjunto dessas ferramentas foca modificar o comportamento dos artrópodes por atracção ou repulsão. Portanto, os artrópodes são frequentemente o foco das investigações do comportamento. Várias ferramentas foram desenvolvidas para medir o comportamento de artrópodes, incluindo túneis de vento, moinhos de vôo, servospheres, e vários tipos de olfatômetros. O objetivo dessas ferramentas é para medir a resposta do inseto ou aracnídeo a estímulos visuais ou mais frequentemente olfativo. O oflactometer T labirinto vertical descrito aqui mede opções realizadas por insetos em resposta a atrativos ou repelentes. É um dispositivo de ensaio de elevado rendimento que tira proveito da fototaxia positivo (atracção à luz) e negativos (geotaxis tendência para andar ou voar para cima) exibidas pelos artrópodes muitos. O olfactometer é constituído por um tubo de vidro de 30 cm, que é dividido em dois com uma tira de Teflon formando um labirinto em T. Cada metade serve como um braço do olfatômetro permitindo que os indivíduos do teste que fazer uma escolha entre dois campos de odor potencial em ensaios envolvendo atrativos. Nos ensaios envolvendo repelentes, a falta de resposta normal a attractants conhecidos também pode ser medida como uma terceira variável.

Introdução

Artrópodes (incluindo insetos e aracnídeos) são muitas vezes definidas como pragas, porque quer competir com o consumo humano em ambientes agrícolas ou urbanas ou transmitir patógenos causadores de doenças ^1. Uma grande quantidade de investimento é feito no desenvolvimento de ferramentas de controle de pragas. Estas ferramentas podem variar muito e progresso significativo foi feito no desenvolvimento de ferramentas biorational que quer modificar ou explorar o comportamento natural de pragas com o uso de atrativos comportamentais ou repelentes ^2,3.

Artrópodos muitas vezes dependem de sinais olfativos ou sugestões para acasalar e / ou de acolhimento local ^4. Portanto descoberta de atrativos efetivos ou repelentes de pragas muitas vezes pode levar ao desenvolvimento de ferramentas de controle. Este processo de descoberta envolve várias etapas. Primeiro, o comportamento natural do assunto de teste deve ser entendida. Por exemplo, deve-se determinar se um sexo de uma dada espécie atrai o opostosexo por localização companheiro. Se assim for, deve-se determinar se esta atracção é mediada por uma substância química e química que onde é produzido. Os próximos passos incluem determinar quando o produto químico é produzido e a sua eventual identificação. Durante todo este processo, a resposta do sujeito de teste (insecto ou ácaro) comportamental a odorantes deve ser testado. Inicialmente, o comportamento do sujeito de teste será testado para o material natural. Por exemplo, a resposta de uma mariposa macho podem ser testados à do extracto da sua conspecific fêmea glândula pheromone. Alternativamente, a resposta de um herbívoro aos odores naturais da sua planta hospedeira pode ser testada. Enquanto estas investigações, muitas vezes têm um foco prático no desenvolvimento de ferramentas de gestão de ^5,6, que também pode ser aplicado para a pesquisa que aborda questões mais fundamentais, como a especiação ^7. Passos seguintes envolvem a testar a resposta do artrópode de versões sintéticas de produtos naturais identificados.

Understanding como artrópodes responder aos produtos químicos exige o desenvolvimento de ferramentas adequadas para medir o seu comportamento. Os dados gerados por essas ferramentas vai depender da forma como o investigador é capaz de medir comportamentos naturais em um ambiente controlado. Mais de seis décadas atrás, olfatômetros vôo sustentado e túneis foram desenvolvidos para medir a resposta do inseto a odores ^8,9. Olfatômetros variar significativamente em design e muitas vezes são adaptados para o inseto específico ou problema a ser investigado. O objetivo deste artigo é descrever a concepção e utilização de uma orientação vertical, olfatômetro labirinto em T para medir a resposta dos insetos a odores (Figura 1). Orientação vertical do olfactómetro da tira vantagem do geotaxis negativo (tendência para se mover para cima) exibida por muitos insectos. Uma fonte de luz posicionada directamente por cima do olfactómetro aproveita o fototaxia positivo (tendência para se mover para a fonte de luz) exibida por muitos insectos. O olfactometer é particularmente útil para insectos hemípteros, que tendem a não exibir movimento prontamente em olfatômetros orientados horizontalmente e que são altamente influenciadas pela intensidade de luz no que diz respeito à orientação. No entanto, este dispositivo pode ser utilizado para uma grande variedade de insectos rastejantes voadores e, assim como aracnídeos. O olfactómetro podem ser empregues para avaliar ambos os atrativos e repelentes. No caso de attractants, o campo de odor bifurcado (Figura 1) é estabelecida com o atraidor putativo libertado de um lado contra o ar limpo libertado no lado oposto. A escolha é registada quando o insecto libertado na base do olfactómetro escolhe um dos dois campos de odor. No caso dos repelentes, um comportamento terceira é possível. Para além de um movimento ascendente em qualquer um dos dois campos de odor, a falta de movimento ascendente pode ser gravada indicando um estímulo não responsiva ou repelir estímulo dos campos tanto de odor.

Protocolo

1. Montagem de um design personalizado, dois porta-dividido T-olfactómetro descrito anteriormente no Mann et al. ¹⁰ é mostrada na Figura 1. O olfactómetro é constituído por um tubo de vidro de 30 cm, que é bifurcado em duas portas separadas com uma tira de Teflon formar um labirinto em T. Cada metade é análogo a um braço de um olfactómetro estilo 2-escolha permitindo o sujeito de teste para escolher entre dois campos de odor potencial.
   1. Ensaios de montagem e subsequente deve ocorrer dentro de uma sala com temperatura controlada ou câmara ambiental.
   2. Monte vidro olfatômetro T-labirinto vertical, como mostrado na Figura 1 e posicioná-lo sob uma lâmpada fluorescente luz 900 lux.
   3. Para a difusão de luz ideal, o conjunto deverá ser montado dentro de um 1,0 x 0,6 x 0,6 m recipiente opaco para maximizar a difusão da luz uniforme.
   4. Ligue os braços olfatômetro de fontes de odor que serão alojados em fase sólida micro-extracção / exploração de odor fonte Chamber (SPMEC) (ARS, Inc., Gainesville, FL) através de Teflon; conectores de tubo de vidro. Cada SPMEC é constituído por um tubo de vidro (17,5 cm de comprimento x 3,5 cm de largura) suportado com uma entrada e uma válvula de saída para as correntes de ar de entrada e de saída (Figura 1).
   5. Ligar o sistema de fornecimento de ar a uma fonte externa de ar humidificado e carbono-purificado que está sob pressão constante (o sistema de fornecimento de ar tem tanto um filtro de carbono para a purificação do ar interno e um borbulhador de ar para a humidificação se fontes externas estão disponíveis).
   6. Dissolver amostras químicas desejadas dentro diluente apropriado (solvente) e uma pipeta sobre um substrato de libertação lenta, tal como um pavio de algodão (Petty John Packaging, Inc., Concord, NC). O tratamento de controlo deve ser composto de um pavio de algodão impregnado com apenas solvente.
   7. Para evitar a contaminação significativa da vidraria, envolver os pavios de algodão tratados e controle no tecido laboratório (Kimwipes, Kimberly-Clark, Roswell, GA) e em lugar dos dois braços SPMEC (ARS, Inc., Gainesville, FL). No caso de amostras de plantas vivas, uma câmara de recolha de guilhotina volátil pode ser anexado ao olfactómetro contendo tratamentos em lugar do SPMEC (Figura 1).
   8. Entregar purificado e ar humidificado por meio do SPMEC (ou câmara de guilhotina voláteis) por meio de duas bombas ligadas a um sistema de fornecimento de ar (Figura 1). Manter a taxa de fluxo de ar de 0,1 L / min através de ambos os braços do olfactómetro.
2. Empregando olfactómetro para testar a resposta de repelentes de artrópodes putativos. Na presente descrição, um insecto hemípteros, psyllid citrino asiático, Diaphorina citri, foi utilizado como um teste de artrópodos. Resposta foi testada para produtos voláteis de citrinos, isoladamente ou em combinação com um (dissulfureto de dimetilo) e repelente de ar limpo como fontes de odor.
   1. Realizar todos os experimentos a uma temperatura padronizada e umidade relativa.
   2. Antes de todos os testes, expor tassuntos est para limpar ar versus ar limpo ou ar solvente contra limpa no olfatômetro labirinto em T para verificar a ausência de viés posicional ou um efeito de solvente sobre o comportamento do sujeito teste.
   3. Atribuir uma fonte de odor aleatoriamente a um dos braços do olfatômetro no início de cada bioensaio. Inverter esta posição depois de cada 10 indivíduos de teste analisadas, no mínimo, para eliminar o potencial de polarização de posicionamento.
   4. Testar a resposta de um mínimo de 30 (e até 120) cobaias por combinação.
   5. Permitir teste 100-300 sec sujeitos a exibir uma resposta comportamental com base na resposta previamente estabelecido (latência) intervalo.
   6. Sujeito registo se entra no braço do tratamento, o braço de controlo ou permanece na porta de libertação ou abaixo da divisão labirinto em T.
   7. Marcar uma escolha braço de tratamento ou controle quando um assunto de teste atravessa a divisão no labirinto em T e se move para qualquer braço olfatômetro.
   8. Marcar uma escolha braço de liberação quando um teste sem prejuízo permanece na porta de libertação ou abaixo da divisão labirinto em T.
   9. Limpar o olfactómetro e tubos de ligação cuidadosamente com uma solução de sabão a 2% e cozer os componentes de vidro a 200 ° F entre a utilização de tratamentos de odores diferentes.
   10. Para os ensaios em que putativas tratamentos repelentes são apresentados no olfactómetro labirinto em T com ou sem um tratamento químico em relação ao ar puro, comparar o número de indivíduos de teste restantes no ponto de libertação e não entrando no olfactómetro entre os tratamentos por uma análise de variância ( ANOVA) seguida pelo teste HSD de Tukey (α <0,05). Nos casos em que os indivíduos do teste deixar o braço de liberação, compare o número de escolher o braço de controle versus o braço de tratamento com qui-quadrado (χ ²⁾ análise de α <0,05.

Resultados

Atração de asiáticos cítricas (psilídeo Diaphorina citri) adultos aos odores de suas voláteis de plantas hospedeiras natal (citrus) é representado na figura 2A. Adultos de forma significativa (α <0,05) mais escolheu o braço do labirinto em T olfactómetro receber odores de plantas cítricas vivos em comparação com um controlo (ar limpo) branco.

Um exemplo de repulsão é mostrado na Figura 2B. Neste caso, os insectos foram expostos a um braço do labirinto em T voláteis de citrinos que receberam, enquanto que o segundo braço recebido voláteis a partir de uma planta cítrica que foi tratada com o dissulfureto conhecido, repelente de dimetilo ^11. Neste caso, os três tipos de comportamentos foram observados. O número de psilídeo presos no braço de liberação e não responder não diferiu estatisticamente do número de entrar no braço recebendo os odores de plantas cítricas isoladamente (Figura 2B). No entanto, não entrou no braço psyllids contendo tele planta hospedeira volátil quando co-apresentado com o repelente (Figura 2B).

Figura 1. Diagrama esquemático de orientado verticalmente olfactómetro labirinto em T ligado ao sistema de fornecimento de ar e os dispositivos de libertação de odores de tratamento. O diagrama é uma adaptação da Figura 1 na Mann et al. ^10. Um assunto de teste é colocado individualmente na câmara de lançamento do 2 porta-dividido T olfatômetro. Ela se move em direção aos odores através de uma válvula de gaveta que permite controlar o movimento ascendente no olfatômetro e impede o inseto de rastejar de volta para a área do ponto de lançamento. O tubo de 10 centímetros bifurca após o valor do portão. Uma resposta positiva a um odor é registado uma vez que o insecto se move 0,5 centímetros em um lado específico da divisão. A câmara de recolha de guilhotina volátil pode ser utilizado no lugar de um sólido de PHAse realização de micro-extração / câmara de odor de origem (SPMEC) como uma fonte de odor.

Figura 2. Resposta de asiáticos cítricas psilídeo (Diaphorina citri) adultos para voláteis de plantas cítricas hospedeiro versus o controlo de ar limpo (A) ou voláteis de citrinos contra voláteis de citrinos co-libertados com um (dissulfureto de dimetilo) repelente (B) em um T orientada verticalmente -maze olfactómetro Figura 2A:. Uma forma de análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste HSD de Tukey (α <0,05) foi realizado para comparar o número de psilídeo fazendo uma escolha entre ambos os braços (2 tratamentos, n = 120). As colunas indicadas por letras diferentes são significativamente diferentes uns dos outros (α <0,05) Figura 2B:. One-way Analysé de variância (ANOVA) seguida pelo teste HSD de Tukey (α <0,05) foi realizado para comparar o número de psilídeo fazendo uma escolha entre ambos os braços ou a permanecer no ponto de libertação (3 tratamentos, n = 120). As colunas indicadas por letras diferentes são significativamente diferentes uns dos outros (α <0,05).

Discussão

Aqui, um dispositivo de doseamento e o protocolo são descritos para medir a resposta de artrópodes pequenos (Insecta: Hemiptera: Psyllidae) a odorantes. O método envolve um teste de escolha, permitindo que o insecto para fazer uma escolha entre dois campos odorantes no caso dos ensaios de avaliação de um atraidor putativo. Além disso, o sujeito de teste pode apresentar três tipos de comportamentos, deixando o braço de lançamento e introduzindo um dos dois campos potenciais de odor, ou permanecendo no braço de libertação, no caso de ensaios de repelência. O olfatômetro permite alta de coleta de dados a transferência, pois aproveita o geotactic negativo (tendência de se mover para cima) e phototactic positivo (tendência de se mover em direção à luz) resposta comportamental natural de artrópodes muitos. Embora a presente demonstração usa um exemplo de teste psilídeo insecto, o ensaio pode ser prontamente adaptado para os artrópodes em geral, tanto as que utilizam voo ou andando como modos predominantes de transporte.

olfatômetros projetados para medir a resposta dos insetos foram inicialmente desenvolvidos há décadas e têm desempenhado um papel importante na elucidação atrativos e repelentes de insectos ^12. Os modelos específicos de tais olfatômetros variam amplamente, no entanto, variações sobre o tema geral do ensaio de dois escolha descrito aqui, bem como, semelhantes em tubos de ensaios de Y tem sido muitas vezes utilizado para medir a resposta de artrópodes a produtos químicos. Túneis maiores de voo que podem causar a fuga contínua dos insectos ⁹ também resultaram na recolha de dados inovador elucidar os mecanismos fundamentais de vôo de insetos e orientação para semioquímicos, assim como, os dados de informação do uso prático de ferramentas de controle de pragas.

Muitas vezes, é necessário para adaptar um desenho olfactómetro e instrumentação associada para a biologia do sujeito de teste específico de artrópodes. Essas olfatômetros que podem ser usados ​​dentro de um grupo de insectos em geral são mais úteis do que os specific a um grupo pequeno, no entanto, por vezes, o significado económico de um pequeno grupo de insectos dita a necessidade de desenvolvimento de um olfactómetro muito específica e método de dosagem. O projeto descrito atualmente baseia-se em técnicas de artrópodes previamente conhecidas. Ela permite a um ensaio de dois mais padrão de escolha de Y-tubo bioensaios em que a arena experimental ou teste de escolha assume a forma de um dispositivo de vidro em forma de Y ^7. Tipicamente, um dos braços de um tal tubo em Y receberá um odorante tratamento, enquanto o outro será deixado em branco ^13. Variações sobre olfatômetros podem incluir a adição de múltiplos braços radiais ¹⁴ e até mesmo a adição de um meio de solo para o ensaio do comportamento dos organismos que se movem através do solo ^15. Ao desenvolver tais olfatômetros e ensaios associados, é importante considerar a proximidade condições naturais são replicadas e, assim, a verdadeira relevância das respostas comportamentais avaliadas em termos de biologia os indivíduos do teste. Para a lagrau rge, os dados recolhidos só será tão útil quanto a relevância do bioensaio de comportamento em relação à ecologia comportamental do organismo ^16.

O olfatômetro descritos atualmente e bioensaio comportamental é projetado especificamente para um inseto hemípteros que tende a iniciar vôo tão curto "saltos" ^16. A orientação vertical do olfactómetro e a fonte de luz de acordo facilitar o início do movimento de insectos e, assim, o comportamento subsequente orientação quimicamente mediada pode ser ensaiada de forma eficiente e com alto rendimento. Este arranjo ensaio comportamental pode provavelmente ser utilizados para uma ampla gama de voar ou andar taxa de artrópodes ou pode ser também facilmente modificado para se adequar a necessidade de não-artrópodes organismos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do Equipamento	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Duas portas dividido T-olfactómetro	Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL	Nenhum (custom made)	Se indisponível a partir de ARS, Sul Científica (Gainesville, FL) também atualmente constrói e distribui equipamentos.
Em fase sólida detenção micro-extração / câmara-fonte odor com Teflon; conectores de vidro de tubo.	Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL	RV R3-	Veja acima comentário
Ar do sistema de entrega	Analytical Research Systems (ARS), Inc. Gainesville, FL	HADS-2AFM2C.4	Veja acima comentário
Guilhotina câmara	Analítica ReseSistemas de arco (ARS), Inc. Gainesville, FL	L3GP3	Veja acima comentário