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Resumo

Ditranol (DT; 1,8-di-hidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) foi previamente relatada como uma matriz de DLAMI para a imagiologia de tecido de pequenas moléculas; protocolos para a utilização de DT para a imagiologia de MALDI de lípidos endógenos na superfície de cortes de tecido por positivo-ion MALDI-MS em um ultra-alta resolução quadrupolo-FTICR instrumento são fornecidos aqui.

Resumo

Imagiologia de espectrometria de massa (MSI) determina os padrões de localização e distribuição espacial dos compostos sobre a superfície de uma secção de tecido, utilizando principalmente MALDI (matriz assistida de laser de dessorção / ionização) baseada em técnicas analíticas. São necessárias novas matrizes para pequena molécula MSI, que podem melhorar a análise de baixo peso molecular (MW) compostos. Essas matrizes deve fornecer sinais de analitos aumentou, enquanto a diminuir sinais de fundo MALDI. Além disso, o uso de instrumentos de ultra-alta resolução, tais como a transformada de Fourier de iões ciclotrão ressonância (FTICR) espectrómetros de massa, tem a capacidade de resolver os sinais de analito a partir de sinais de matriz, e este pode superar parcialmente muitos problemas associados com o fundo proveniente da MALDI matriz. A redução nas intensidades dos clusters matriz metaestáveis ​​por FTICR MS também pode ajudar a superar algumas das interferências associadas com picos de matriz de outros instrumentos. De alta resoluçãoinstrumentos, como os espectrômetros de massa FTICR são vantajosas, pois podem produzir padrões de distribuição de muitos compostos simultaneamente enquanto continua a fornecer confiança em identificações químicas. Ditranol (DT; 1,8-di-hidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) foi previamente relatada como uma matriz de DLAMI para a imagiologia de tecidos. Neste trabalho, um protocolo para a utilização da DT por MALDI imagiologia de lípidos endógenos das superfícies de secções de tecido de mamífero, por positiva de iões de MALDI-MS, de um quadrupolo híbrido ultra-resolução tem sido fornecida instrumento FTICR.

Introdução

Imagiologia de espectrometria de massa (MSI) é uma técnica analítica para determinar os padrões de localização e distribuição espacial dos compostos sobre a superfície de uma secção de tecido de 1,2. Matrix assistida a laser dessorção / ionização (MALDI) MSI para a análise de peptídeos e proteínas tem sido usado por mais de uma década e tem havido grandes melhorias em métodos para a preparação da amostra, a sensibilidade de detecção, resolução espacial, reprodutibilidade e processamento de dados 3,4. Ao combinar informações das secções histologicamente coradas e experimentos MSI, patologistas são capazes de correlacionar as distribuições de compostos específicos, com características interessantes fisiopatologicamente 5.

Os padrões de distribuição de moléculas pequenas, incluindo drogas exógenas 6,7 e seus metabolitos 8-10 também foram interrogados por MALDI-MS imagiologia do tecido 11. Os lipídios são, talvez, o cla mais amplamente estudadoss de compostos com imagens MALDI, tanto em MS 12-17 e MS / MS 18 modos. O uso de MALDI MSI molécula pequena imagem tem sido limitado por vários factores: 1) matrizes MALDI são eles próprios moléculas pequenas (tipicamente de m / z <500), que geram os sinais iónicos abundantes. Estes sinais abundantes pode suprimir a ionização de analitos de pequenas moléculas e interferir com a sua detecção 19,20. Livre de solvente revestimento de matriz 21, matriz de sublimação 22, e matriz de pré-revestidas MALDI MS 23, entre outros, têm sido desenvolvidos para melhorar a MSI de pequenas moléculas.

Novas matrizes que podem melhorar a análise de compostos de baixa MW são de grande interesse na pequena molécula MSI. Estas matrizes devem proporcionar sinais de analitos aumentou com sinais de matriz diminuiu. No modo positivo de iões, 2,5-di-hidroxibenzóico Ácido (DHB) e-4-hidroxicinâmico α-ciano de ácido (CHCA) são os dois comumente utilizadas matrizes de MALDI MS para 24 MSI . A matriz ideal seria formar pequenos cristais, de modo a preservar a localização espacial dos analitos. DHB tende a formar cristais de maiores dimensões, por conseguinte, a aplicação da matriz usando sublimação foi desenvolvida para ultrapassar parcialmente o problema, e permitiu a utilização desta matriz para imagiologia sensível de fosfolípidos 22,25. 9-aminoacridina foi usado para MSI de analitos próticos no modo positivo de iões 26, e para os nucleótidos e fosfolípidos no modo de ião negativo 26-29. 2-Mercaptobenzotiazole tem sido encontrado para dar detecção MALDI eficiente de lipidos 30, e tem sido utilizado para a imagem do cérebro do rato gangliósidos 31. A resolução ultra-alta de Fourier íon ciclotron de ressonância (FTICR) espectrômetros de massa tanto pode aliviar este problema, resolvendo sinais de analitos a partir de sinais de matriz 32. Outra vantagem do uso de FTICR-MS é que as intensidades dos aglomerados de matriz são metastáveis ​​reduçãoed 33, o que também reduz essas interferências 27.

O uso de ditranol (DT; 1,8-di-hidroxi-9 ,10-dihydroanthracen-9-ona) na forma de uma matriz de DLAMI para a imagiologia de tecidos tem sido previamente reportado 34. No presente trabalho, um protocolo detalhado é fornecida para a utilização de DT para o MSI de lípidos endógenos na superfície das secções de tecido da lente de bovino, no modo de iões positivos.

Protocolo

1. Seccionamento Tissue

  1. Flash-congelar as amostras de emissão, uma vez colhidas, utilizando nitrogênio líquido, enviá-los em gelo seco (se o transporte for necessário), e armazená-los a -80 ° C até o corte do tecido. (Se forem utilizadas amostras comerciais, assegurar que as amostras são preparadas deste modo.)
  2. Corte órgãos para um tamanho gerenciável para atender a meta de MALDI. Apare quaisquer partes não desejadas do órgão. Para este estudo descrito aqui, as lentes de bovino foram decapsulated utilizando um procedimento previamente descrito 35 antes de seccionamento de tecidos.
  3. Remover órgãos inteiros a partir do freezer -80 ° C e corrigi-los em uma fase de corte de tecidos criogênico. Para corrigir uma lente de vitelo, coloque uma ou duas gotas de água na fase de corte de tecidos de um criostato. Rapidamente coloque a lente na água antes de ela se solidifica. Alternativamente, a temperatura de corte óptima (OCT) compostos também podem ser usados ​​para fixar um tecido para a fase de corte. Se forem utilizados compostos outubro, um minimal quantidade de outubro deve ser aplicada, e deverá ser tomado cuidado para assegurar que as secções de tecido de corte não será contaminada com compostos outubro que podem interferir com a detecção e ionização dos analitos 5,36,37.
  4. Permitir que a temperatura no interior do criostato para equilibrar a -18 ° C. Temperaturas mais baixas ou altas podem ser usadas para os tecidos moles ou duras, respectivamente. Em seguida, corte o tecido equatorialmente em 20 mM fatias grossas. Use 10-15 uM rodelas grossas para a maioria dos tecidos, no entanto, por causa da fragilidade do tecido da lente de bovino, foram utilizados 20 uM de espessura. Para tecido lente bovina, descarte as seções primeiros tecidos e só usar fatias que estão perto ou no plano equatorial.
  5. Se um tecido ocular é trabalhada, utilizar de 1,5 mL de ácido fórmico (98% em pureza, LC-MS grau) para prewet a superfície de um óxido de índio e estanho (ITO) revestido lâmina de vidro.
  6. Transferir cuidadosamente as secções de tecido para a superfície do ITO-cociado vidro lâmina de microscópio dentro do criostato. O corte de tecido rapidamente descongelar e vai se tornar firmemente afixada à superfície do slide. Geralmente, várias secções de tecido podem ser montados numa mesma lâmina revestida de ITO desta forma.
  7. Liofilização o slide por 15 minutos antes da aplicação da matriz MALDI.
  8. Para os testes de matriz, dissolver as matrizes individuais, em solventes apropriados. Identificar manualmente 1 ml de cada solução de matriz para a secção de tecido. Além disso, identificar um padrão de calibração de pequenas moléculas para o tecido para verificação da sensibilidade MALDI.
  9. Adicione três marcas de ensino para a lâmina de vidro ITO revestido por escrever sobre a superfície não condutora da lâmina de vidro ITO revestido com uma caneta corretiva-fluido. Pegue uma imagem óptica do slide tecido usando um scanner de mesa e guardá-lo em um formato adequado, como tiff ou jpg.

2. Matriz de Revestimento

2.1. Automated Matrix Revestimento

  1. ApAs soluções matriciais camadas, que contêm o acetonitrilo ou misto de acetonitrilo / água como solventes, automaticamente para as superfícies das secções de tecido, utilizando um Bruker ImagePrep ou um pulverizador semelhante matriz electrónica.
  2. Cobrir as bordas da superfície da frente da lâmina de vidro ITO revestido com fita de modo a que a matriz não se revestir os bordos da lâmina. Isto assegura que as marcas de ensino sobre a superfície oposta pode ser usado para o alinhamento do tecido deslizante. Não cobrir as extremidades da corrediça com a matriz à medida que são usadas como pontos de contacto para manter a condutividade eléctrica da corrediça ITO revestido.
  3. Revestir a lâmina de vidro, utilizando vinte ciclos de revestimento de matriz (2-sec pulverização, 30 seg de incubação, e 60 seg de tempo de secagem para cada ciclo).

2.2. Manual de matriz de revestimento

  1. Se os solventes orgânicos (por exemplo, clorofórmio e acetato de etilo), que são incompatíveis com os materiais da matriz pulverizador electrónico de fabricação são requivermelho, use um pulverizador airbrush pneumaticamente assistida para aplicar a matriz. Adicione a solução matriz preparada para o reservatório de solvente do injetor do airbrush e aplicar um fluxo suave de gás nitrogênio pressurizado para preparar o spray.
  2. Cobrir as bordas da superfície frontal das lâminas de vidro ITO revestido com fita de modo a que a matriz não se revestir os bordos da lâmina. Isto assegura que as marcas de ensino sobre a superfície oposta pode ser usado para o alinhamento do tecido deslizante. Não cobrir as extremidades da corrediça com a matriz à medida que são usadas como pontos de contacto para manter a condutividade eléctrica da corrediça ITO revestido.
  3. Depois de ter sido observado sprays estáveis ​​e finos, spray manualmente a matriz para que ele reveste completamente a secção de tecido. Aplique a quantidade mínima de solução matriz necessário para mal molhar a superfície durante cada ciclo para evitar uma possível deslocalização analito. Em geral, utilizam aproximadamente 10 ciclos de pulverização para o revestimento de uma matriz de corte de tecido, o número de ciclos édepende do tipo de tecido e composição da matriz.

3. MALDI MS

  1. Prepara-se uma solução de calibração de massa através da diluição da solução de "ES ajuste Mix" padrão por um factor de 1:200 em 60:40 de isopropanol: água (contendo 0,1% de ácido fórmico na mistura final).
  2. Introduzir 2 mL / min da solução "ES Sintonia Mix" diluído na dual-mode ionização electrospray (ESI) / fonte de íons MALDI no espectrômetro de massa FTICR, do lado da ESI.
  3. Utilizar o aparelho FTICR no modo ESI positivo-ion, com detecção de banda larga e um tamanho de aquisição de dados de 1.024 kb / seg. Os parâmetros típicos são ESI tensão electropulverização capilar, 3900 V; pulverizar tensão escudo, 3600 V; gás nebulizador (N 2), fluxo, 2 L / min, gás seco (N 2) e a temperatura de fluxo, de 4 L / min e 200 ° C; skimmer uma tensão de 15 V, o tempo de vôo (TOF), 0,009 s; gás de colisão (Ar) de fluxo, 0,4 L / s; fonte de íons acumulação tempo, 0,1 seg;e célula de colisão de íons acumulação tempo, 0,2 seg. Ajustar os parâmetros de operação FTICR, a fim de maximizar a sensibilidade analítica sobre a faixa de massa de m / z de 200 a 1.400, enquanto que a manutenção da boa no domínio do tempo de indução livre de cárie sinais (FID). Normalmente, os parâmetros de operação ICR são tensão ajudante, 8 V; sidekick tensão de offset, 8 V; amplificação excitação de 10; excitação tempo de pulso, 0,01-,015 seg; frente tensão da placa armadilha, 1,5 V; armadilha de volta tensão de placa, 1,6 V e tensão de entrada do analisador, -4 V. Depois de um conjunto de parâmetros de operação FTICR tem sido determinada, obter o espectro de massa ESI e calibrar o instrumento, utilizando as massas dos compostos de referência padrão na solução de "ES ajuste mistura".
  4. Para afinar o instrumento para uma operação de MALDI, dissolver várias aliquotas de 1 ul de uma solução mista e terfenadina padrão reserpina na solução da matriz a uma concentração de 1 | iM de cada, e detectar estas soluções directamente sobre uma das tissue secções (ou seja, uma secção de tecido de teste) o qual foi montado sobre uma corrediça de ITO revestido. Colocar a lâmina ITO revestido numa placa de corrediça de tecido (ou seja, um alvo de MALDI especial) e carregar o adaptador do lado de MALDI na fonte de iões ESI / MALDI dupla. Otimizar os parâmetros de funcionamento MALDI apropriadas para a potência do laser e do número de disparos de laser para a acumulação de sinal MALDI para cada digitalização em massa, etc parâmetros de operação MALDI típicos são: disparos de laser, de 50, e uma MALDI tensão da placa de 300 V.
  5. Depois de tuning, calibrar e otimizar o instrumento para experimentos MALDI-MSI, alinhe a localização física de uma secção de tecido a ser trabalhada com a sua imagem óptico registrado no software de imagem. Use as três marcas "de correcção de líquido", que tinha sido previamente colocados no lado oposto da superfície de deslizamento de ITO revestido (passo 1.9), para este alinhamento, utilizando um método de triangulação de três pontos.
  6. Realize uma ESI simultânea e MALOperação DI de modo que cada espectro de massa contém os picos de massa de referência da solução "ES Sintonia Mix" para o pós-aquisição de calibração de massa interna. Isto irá resultar na massa medição mais precisa durante o MALDI MS. Para isso, em primeiro lugar atenuar o sinal ESI, diminuindo a tensão capilar até os sinais MALDI dominar os espectros, enquanto os sinais de calibração ESI são ainda suficientemente elevada para a calibração interna de massa.
  7. Em seguida, configure um método automatizado para rastering irradiação laser. Definir as regiões de tecido a ser trabalhada e definir o tamanho adequado passo varredura laser. Note-se que tamanhos de passo menor raster fornecer imagens de tecido com maior resolução, mas requerem um tempo significativamente mais longo massa espectral aquisição e mais espaço de armazenamento de dados. O número de pixels da imagem que é dependente do tamanho do passo de varredura a laser para configurar e a dimensão do tecido. Para uma lente de bovino típico que tem um tamanho de tecido de 1 cm2, de uma imagem de tecido é geralmente composto de ca. 5000 pixels se um tamanho de passo de varredura a laser de 200 um é usado em um instrumento FTICR. Use uma análise "ponto aleatório", pois isso evita viés baseado em localização, devido à atenuação do sinal gradual durante o experimento.

4. Análise de Dados

  1. Calibrar os espectros de massa MALDI usando calibração interna para a comparação inicial e selecionar picos para MS / MS. De-isótopo e selecionar os picos monoisotópico conforme descrito anteriormente, usando um script VBA personalizada 38.
  2. Exportar o resultado listas de pico monoisotópico e introduzir os valores medidos m / z para o METLIN 39 e / ou bancos de dados de metaboloma HMDB 40 para correspondência em massa com as entradas de biblioteca. Considere o (M + H) +, (M + Na) + e (M + K) + iões durante as pesquisas de banco de dados, com um erro de massa permissível de ± 1 ppm.
  3. Gerar imagens de MALDI para todas as entidades de lípidos detectados através da secção de tecido inteiro usando imagsoftware e-análise, com uma largura de filtro de massa de 1 ppm no vértice do pico.
  4. Uma vez que as imagens tenham sido gerados para todos os valores de m / z que correspondem as entradas do banco de dados, gerar imagens para todos os outros picos, assim como para procurar padrões de distribuição exclusivas que podem ser investigados posteriormente.

5. A confirmação das identidades dos Lipídeos fotografada

  1. Confirmar as identidades dos lípidos elevada abundância, que têm iões fragmentados característicos que podem ser detectados utilizando o instrumento FTICR (por exemplo, 184,073 para fosfolípidos), por MALDI-MS/MS. Realizar MALDI-MS/MS usando induzida por colisão de dissociação (CID) directamente sobre o tecido.
  2. Para as espécies de lípidos que não podem ser directamente confirmados por MALDI-MS/MS, usar um sistema UPLC acoplado a um espectrómetro de massa Q-TOF 34.
    1. Dissecar manualmente alíquotas contendo ~ 10 mg de tecido a partir da área onde as espécies de interesse estava localizada. Coloque essas alíquotas de tecido em 2tubos de centrífuga ml.
    2. Homogeneizar cada alíquota tecido em 250 mL de água, usando um moinho misturador com duas bolas de metal em aço inoxidável 5 milímetros.
    3. Adicionar 1 ml de solução em clorofórmio-metanol (1:3, v / v), e os tubos de vórtice. Em seguida, centrifugar os tubos utilizando uma microcentrífuga a 12000 xg durante 10 min.
    4. Recolher os sobrenadantes e seque-as em um concentrador de velocidade rotativo a vácuo.
    5. Dissolve-se os resíduos em 100 mL de isopropanol: água 30:70. Injectar uma alíquota de 10 uL na coluna UPLC de separação utilizando uma eluição de gradiente.
    6. Use as condições cromatográficas para LC-MS/MS em linha lipídicas, que foram previamente publicados 34.
    7. Corrente de iões gerar extraída (XIC) cromatogramas usando os valores teóricos, m / z, com uma janela de ± 50 ppm em torno das massas teóricas.
    8. Se os compostos autênticos para esses lípidos estão disponíveis, coincidir com os tempos de retenção dos compostos autênticos com aqueles do correspondente XIC picos das amostras de tecido. Se os compostos são a mesma, os tempos de retenção e dos espectros de MS / MS deve corresponder.
  3. Se um composto autêntico não estiver disponível, utilize o padrão de fragmentação do lípido detectado para corresponder a um padrão do espectro MS / MS a partir de uma base de dados tal como metaboloma METLIN ou HMDB. Use de novo de interpretação do espectro de massa para determinar uma possível estrutura para o lípido.

Resultados

As amostras de tecido que são seccionadas e degelo montados em lâminas de vidro ITO revestidas devem estar intactos, sem rasgo visível. Para muitos tecidos, descongele tecido direto montagem em uma lâmina de vidro ITO revestido é aceitável. Para alguns tecidos específicos, tais como lentes de bovino, extensa rompimento do tecido, muitas vezes é observado quando degelo montagem directa é utilizado (Figura 1a). De pré-revestimento da placa de vidro ITO com etanol ou ácido fórmico

Discussão

As considerações mais importantes para o sucesso MALDI MSI são: 1) a preparação do tecido, 2) escolha matriz; 3) aplicação de matriz e 4) interpretação e análise de dados. Quando a amostra e a matriz são adequadamente preparados, a aquisição de dados do MS é automatizado. A análise de dados a partir deste tipo de experiência é bastante trabalhoso.

Preparação do tecido adequado é fundamental para experimentos MALDI MSI sucesso. A fonte de tecido e o tratamento pode ter um ...

Divulgações

Não temos nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer Genoma Canadá e Genoma British Columbia para financiamento plataforma e suporte. Agradecemos também a Dra. Carol E. Parker para revisão crítica da assistência manuscrito e edição. CHL também graças a Columbia Proteômica rede britânica de apoio.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Rat LiverPel-Freez Biologicals56023-2
Bovine Calf LensPel-Freez Biologicals57114-2Sample should be decapsulated29 before use
Dithranol (DT)Sigma-Aldrich10608MALDI Matrix
α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA)Sigma-Aldrich70990MALDI Matrix
2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB)Sigma-Aldrich85707MALDI Matrix
ReserpineSigma-Aldrich83580
TerfenadineSigma-AldrichT9652
Formic AcidSigma-Aldrich14265
Ammonium FormateSigma-Aldrich14266
Ammonium HydroxideSigma-Aldrich320145
Trifluoroacetic Acid (TFA)Sigma-Aldrich302031
WaterSigma-Aldrich39253
MethanolSigma-Aldrich34860
AcetonitrileSigma-Aldrich34967
Ethyl AcetateSigma-Aldrich34972
IsopropanolSigma-Aldrich34965
ChloroformSigma-Aldrich366927
AcetoneSigma-Aldrich34850
EthanolCommercial Alcohols95%
ES Tuning MixAgilent TechnologiesG2431A
ITO Coated Glass SlidesHudson Surface TechnologyPSI1207000Ensure that samples are placed on the electrically conductive side
Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction PenBicWOSQP11
Airbrush SprayerIwataEclipse HP-CS
ImagePrepBruker249500-LS
MALDI adapterBruker235380

Referências

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