Identificação de bactérias metabolicamente ativas no intestino do Generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA Isótopos Estáveis ​​Sondagem Usando<sup&gt; 13</sup&gt; C-Glicose

Resumo

A comunidade bacteriana activa associada ao intestino de Spodoptera littoralis, foi determinada por-estável-sondagem isótopo (SIP) acoplado a pyrosequencing. Usando essa metodologia, a identificação das espécies de bactérias metabolicamente ativas dentro da comunidade foi feito com alta resolução e precisão.

Resumo

Guts da maioria dos insetos são habitadas por comunidades complexas de bactérias não patogênicas simbióticas. Dentro dessas comunidades microbianas é possível identificar comensais ou bactérias mutualistas espécie. Os últimos, têm sido observados para servir várias funções ao inseto, ou seja, ajudar na reprodução de insetos ^1, aumentando a resposta imune ^2, produção de feromônio ^3, bem como a nutrição, incluindo a síntese de aminoácidos essenciais ^4, entre outros.

Devido à importância dessas associações, foram feitos muitos esforços para caracterizar as comunidades de baixo para os membros individuais. No entanto, a maioria desses esforços foram ou baseados em métodos de cultivo ou contado com a geração de fragmentos de genes 16S rRNA que foram seqüenciados para a identificação final. Infelizmente, estas abordagens apenas identificadas as espécies de bactérias presentes no intestino e, desde que não informatião sobre a actividade metabólica dos microrganismos.

Para caracterizar a espécie de bactérias metabolicamente activas no intestino de um insecto, que utilizado isótopo estável sondagem (SIP) in vivo utilizando ¹³ C-glucose como um substrato universal. Esta é uma técnica de cultura livre de promissor que permite a ligação de Filogenias microbianas para a sua actividade metabólica específica. Isto é possível por rastreamento de isótopos estáveis, marcado átomos de substratos em biomarcadores microbianos, tais como o ADN e ARN ^5. A incorporação de ¹³ C isótopos para DNA aumenta a densidade do ADN marcado em comparação com a não marcado ⁽¹² C) uma. No final, o ADN ^{de 13} C-rotulado ou RNA é separado por ultracentrifugação de gradiente de densidade a partir ^{de 12-C} sem rótulo semelhante um ^6. A análise molecular subsequente dos isotopómeros ácidos nucleicos separados proporciona a ligação entre a actividade metabólica e a identidade das espécies.

Aqui, apresentamos o protocolo usado para caracterizar as bactérias metabolicamente ativas no intestino de um inseto generalista (nosso sistema modelo), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). A análise filogenética do DNA foi feito utilizando pyrosequencing, o que permitiu alta resolução e precisão na identificação do intestino do insecto comunidade bacteriana. Como substrato principal, ¹³ C-glucose marcada foi utilizada nas experiências. O substrato foi alimentado aos insectos por meio de uma dieta artificial.

Introdução

Associações simbióticas Insect-bacterianos são conhecidos por um grande número de espécies de insetos ^7. Nestas associações simbióticas, microrganismos desempenham um papel importante no crescimento e desenvolvimento de insectos. Os micróbios têm sido mostrados para contribuir para a reprodução de insectos ^1, feromona biossíntese ^3, nutrição, incluindo a síntese de aminoácidos essenciais, ^4, e a digestão de alimentos inacessível ao hospedeiro. Apesar da grande variedade de associações gut-bacteriana, muito menos se sabe sobre o papel funcional que desempenham em favor do inseto. Só no caso de as térmitas, a digestão simbiótica de lignocelulose realizada por procariotas, protozoários e fungos, tem sido amplamente estudada ^8,9. Em contraste com isso, pouco se sabe sobre a associação simbiótica presente no intestino dos insetos generalistas, ou seja, o curuquerê, Spodoptera littoralis. Além disso, devido à sua mudança freqüente de plantas hospedeiras, em geralist insetos e seus intestino comunidades bacterianas associadas estão permanentemente expostos a novos desafios vinculados a seus hábitos alimentares consumir plantas com uma infinidade de fitoquímicos. Ao lado desta, o ambiente do intestino em lepidópteros, representa por si só um ambiente hostil para o crescimento de bactérias por causa do elevado pH do intestino ^10. Particularmente, no caso de S. littoralis, que varia de 10,5 no intestino anterior, ca. 9 no intestino médio para um pH de cerca de 7 no intestino posterior ^11. Por outro lado, a comunidade bacteriana associada com o intestino de S. littoralis é simples. Tang, Freitak, et al. ¹² relataram um máximo de 36 filotipos pertencentes a um total de 7 espécies de bactérias diferentes, como os únicos membros da comunidade bacteriana associada a esse inseto. Além disso, qualquer processo de criação complicado é necessário para o crescimento dos insectos no laboratório. Além disso, este e o curto ciclo de vida do insecto facilitar multi-gestudos enerational, transformando esta espécie em um sistema modelo ideal para o estudo de interações gut-micróbio.

Com o advento das tecnologias de seqüenciamento baseadas na PCR, o número de estudos que tratam de intestino biota de vários organismos (ou seja, os seres humanos, insetos, ou organismos marinhos) tem aumentado. Além disso, os resultados são independentes do isolamento e cultivo das bactérias intestinais abrigado como no passado. Quase 99% das bactérias não são cultiváveis ​​e a simulação das condições ambientais prevalecentes no intestino é difícil ^12. Usando PCR, os fragmentos de genes de rRNA 16S (um gene marcador filogenético amplamente utilizado entre as bactérias) pode ser amplificado de forma selectiva um molde de ADN mista de comunidades bacterianas do intestino, sequenciados, e clonado. Com essas informações, o usuário é capaz de identificar as espécies de bactérias depois de recuperar as informações da seqüência de bases de dados públicas ^13,14. No entanto, a sequenciação de abordagens para descrever bacterianacomunidades continuam a ser insuficientes, devido à falta de informações sobre a contribuição metabólica intrínseca de cada espécie dentro da comunidade.

Stable-isótopo sondagem (SIP) é uma técnica sem cultura promissor. Ele é frequentemente usado em microbiologia ambiental para analisar filogenias microbianas associadas a determinadas atividades metabólicas. Isto é conseguido através do rastreamento de isótopos estáveis, marcado átomos de substratos em biomarcadores microbianos, tais como os ácidos gordos derivados de fosfolípidos, DNA e RNA de ^5. Ao considerar os ácidos nucleicos, a metodologia baseia-se na separação de ¹³ de ADN marcado com C ou de ARN a partir do ADN não marcado por ultracentrifugação em gradiente de densidade de ^6. Devido a esta ligação directa entre o marcador de ADN e actividade metabólica, uma análise molecular jusante dos ácidos nucleicos identificam as espécies e fornece informações sobre as actividades metabólicas. Além disso, a combinação de ADN-SIP e pyrosequencing como aplicado porPilloni, von Netzer, ¹⁵ et al., Permite uma identificação simples e sensível em particular da espécie bacteriana presente na ¹³ fracção pesada de ADN marcada com C. Até agora, esta técnica tem sido aplicada para descrever as comunidades bacterianas envolvidas em processos biogeoquímicos em solo sob aeróbicos e anaeróbicos condições ^{16,17 18,19.} Além do uso em ciências ambientais, a técnica tem sido aplicada em ciências médicas como relatado por Reichardt, et al. ^5, que descreveu as atividades metabólicas dos diferentes grupos filogenéticos da microbiota intestinal humana em resposta a um carboidrato digerível.

Aqui usamos ¹³ C-glucose em "rótulo" o ADN das espécies de bactérias metabolicamente activas no intestino. A glicose é um açúcar utilizado pela maioria das espécies bacterianas, ao longo da via generalizada Entner-Doudoroff (ED), embora excepções são conhecidas ^20. Estejustifica o uso de ¹³ C-glicose como uma sonda metabólica confiável que fornece uma ligação entre metabólitos de interesse e a fonte de carbono ao longo de caminhos estabelecidos. Dependendo da causa científica, outros substratos, ou seja, ¹³ C-metano, ¹³ CO _2, ou plantas cultivadas sob uma atmosfera de ¹³ CO _2, podem ser usadas para tratar as actividades metabólicas.

Neste ponto, apresentamos o protocolo aplicado na caracterização metabólica da comunidade bacteriana do intestino de um inseto generalista, ou seja, S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Além disso, a técnica foi acoplada a pyrosequencing, que por sua vez permite a identificação da comunidade bacteriana do intestino de insectos, com alta resolução e precisão. Como o substrato principal, ¹³ C-glucose marcada foi utilizado durante os experimentos.

Protocolo

1. Insect Criação

1. Compre ou obter ovos garras de Spodoptera littoralis de seu próprio criação. Mantê-los em placas de Petri estéreis à temperatura ambiente (RT) até a eclosão.
2. Prepare a dieta artificial para insectos de criação como se segue:
   1. Mergulhe 500 g de feijão branco de terra durante a noite em 100 ml de água.
   2. Adicionar 9,0 g de ácido ascórbico e 75 g de ágar a 1000 ml de _H2O destilada e depois reduzi-lo.
   3. Deixe a mistura a arrefecer e, quando a mesma solidifica (para uma mistura de sólido ceroso branco) armazená-lo a 4 ° C até à sua utilização.
3. Transfira a larva a uma caixa de plástico limpo e criá-los na dieta artificial a 23-25 ​​° C, sob um regime de longo dia com 16 horas de iluminação e 8 horas de escuridão. Mude a comida todos os dias até as larvas passam por todos os seis estágios larvais.

2. ¹³ C-rotulagem de DNA em bactérias do intestino metabolicamente ativo

1. Dissolve-se 186,1 mg de totalmente ¹³ C-glucose marcada com água destilada e água desionizada _(ddH2O) e misture bem com 100 g de uma dieta artificial para o experimento SIP. Certifique-se de uma concentração ^{de 13} C-glucose final de 10 mM na dieta artificial. Este simula a concentração de glucose in situ no intestino de S. littoralis larvas em plantas de algodão de acordo com Shao et al. (submetido).
2. Transferência 9-15 segunda larvas saudável a partir da caixa de criação para placas de Petri de plástico estéril (uma larva por placa de Petri) contendo fresco ¹³ C-glicose cravado dieta artificial. Use dieta artificial contendo a mesma quantidade de glicose nativa ⁽¹² C-glicose), tal como descrito, para a alimentação do grupo de controlo.
3. Renove a dieta artificial com frequência durante o período de incubação (1 dia). Use condições de criação como no passo 1.3.
4. Colete nove larvas de cada tratamento para posterior processamento (extração de DNA). Cadareplicar é constituído por três indivíduos; fazer, pelo menos, três repetições por tratamento.

3. Insect Dissection

1. Limpar e desinfectar as ferramentas de dissecação no início do trabalho com etanol 70% (Ferramentas = tesoura Vannas, fórceps e bisturi com lâminas descartáveis ​​finas).
2. Pegue os insetos com uma pinça macios e lavar a pele superficialmente com água destilada. Colocá-los em gelo durante pelo menos 30 minutos para anestesiar eles.
3. Enquanto ainda anestesiados lugar deles a 0 ° C durante 1 hora para matar. Desinfetar os insetos mortos superficialmente por imersão em etanol (70%) por um par de minutos.
4. Realizar o insecto dissecção em um volume de aproximadamente 15 ml de PBS 1x depositado sobre uma placa de Petri esterilizada (NaCl 1XPBS = 137 mM, KCl 2,7 mM, 4,3 mM de Na ₂ HPO _4, 1,47 mM, KH ₂ PO _4, ajustar o pH para 7,4 , autoclave). Certifique-se de ter o corpo todo inseto totalmente imersa na solutíon durante todo o período de dissecação.
5. Comece a dissecção, fazendo uma incisão na pele ao longo do lado esquerdo do inseto direita e, começará na cabeça e terminar no ânus. Retire toda a pele, túbulos de Malpighi, e gordura corporal. Mude para tampão fresco antes de cortar aberto o intestino. Seção do intestino em primeiro plano, médio e intestino posterior, quando necessário. Armazenar o tecido no congelador (-80 a -20 ° C) até que a extracção do ADN

4. Extração de DNA e amplificação

1. Colocar o tecido de insectos em um tubo de 1,5 ml de centrífuga estéril e secar todas as amostras a 45 ° C num dispositivo de concentrador de vácuo. Esmagar o tecido seco com um pilão de plástico estéril.
2. Extrair o DNA genômico utilizando um kit adequado para a extração de DNA do solo. Transferir o tecido seco para o tubo de reacção do kit e seguir as instruções como indicado pelo fabricante.
3. Determinar a concentração do ADN eluído final, utilizando um espectrofotómetro.
4. Verifya extração com sucesso do DNA metagenômica microbiana do intestino do inseto através da preparação de um ensaio de PCR diagnóstico usando eubacterianas primers gerais 27f (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3) e 1492r (5 - GGTTACCTTGTTACGACTT -3). Definir a reacção de PCR como se segue:
   1. Definir uma mistura de reacção de 50 ul contendo 1x tampão, 1,5 mM de MgCl _2, 10 mM de quatro trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTPs), 2,5 U de Taq DNA polimerase, 0,5 mM de cada iniciador e 60 ng do ADN extraído como molde.
   2. Executar as reacções de PCR utilizando um termociclador como se segue: desnaturação inicial a 94 ° C durante 3 min, seguido por 35 ciclos de: 94 ° C durante 45 seg, emparelhamento a 55 ° C durante 30 seg e extensão a 72 ° C durante 1 min . Usar um passo de extensão final a 72 ° C durante 10 min.
   3. Verificar a amplificação com êxito por PCR em agarose a 1% da electroforese de brometo de etídio (EB) gel corado (dissolver 1 g de agarose em 100 ml de tampão 1 x TAE e mancha com 1ml EB). Depósito 5 jul of thproduto e PCR + 1ml de 6x corante de carregamento para os bolsos de gel. (1x TAE = 40 mM Tris-Base, 20 mM de ácido acético glacial, 1 mM de EDTA, ajustado a pH 8).
   4. Executar o gel utilizando tampão 1xTAE a 300 V, 115 mA, durante ca. 20 min em uma câmara de eletroforese. Usando uma câmara de documentação de gel (transiluminador UV ligado a uma câmera digital e computador) observar o gel e comparar o tamanho do seu produto final com o marcador de gene também carregado, o tamanho correto dos amplicons deve ser de aproximadamente 1,5 kb.
5. Armazenar os produtos de PCR sob condições de congelamento profundo, preferencialmente -80 ° C, até utilização.

5. Separação do CsCl DNA Gradiente Ultracentrifugação

1. Preparar os reagentes para os gradientes de ultracentrifugação como se segue:
   1. Prepara-se uma M de cloreto de césio (CsCl), solução 7,163 dissolvendo gradualmente 603,0 g de CsCl em _ddH2O e encher-se até um volume final de 500 ml.
   2. Exatamente desterminé a densidade da solução de CsCl preparado por pesagem de um aliquota de 1,0 ml em um equilíbrio de três dígitos por triplicado. Esta, geralmente, varia entre 1,88 e 1,89 g / ml à temperatura ambiente.
   3. Preparar o tampão de gradiente (Tris 100 mM, KCl 100 mM e EDTA 1 mM) por combinação de 50 mL de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0), 1 ml de 0,5 M de EDTA (pH 8) e 3,75 g de KCl numa final volume de 500 ml, utilizando DDQ ₂ O. Filtro (0,22 mM) e esterilizar em autoclave esta solução.
2. Separação DNA
   1. Tendo determinado a concentração de DNA individual dos insectos tratados, medida como no ponto 4.3, reunir os insetos correspondentes a um conjunto de replicação e normalizar a concentração de ADN para assegurar que cada um, contribui igualmente para a amostra combinada. A concentração final de 500-5.000 ng de ADN (medir novamente a concentração final), é adequado para o processo de ultracentrifugação ^21.
   2. Para configurar o meio de gradiente, combinar o DNA quantificado, um buffer de gradiented 4,8 mL de solução 7,163 M de CsCl em conjunto a um volume de mistura de 6,0 ml para um tubo estéril de 15 ml com tampa de rosca (geração de uma mistura de ADN-meio de gradiente).
   3. Cuidadosamente coloque o gradiente de mistura de ADN-meio preparado para um tubo de ultracentrífuga 5,1 ml (preencher até a base do gargalo do tubo) utilizando uma seringa e agulha. Evitar bombeamento ou formar quaisquer bolhas de ar. Inclua pelo menos um gradiente em branco (usando DDH ₂ O em vez de DNA) em cada centrífuga prazo, como um gradiente de referência.
   4. Pares de tubos de equilíbrio para dentro de 10 mg de peso após cada meio de gradiente necessário é preenchida para o respectivo tubo de ultracentrífuga. Selar o tubo com um "Topper Tube" e garantir que o selo é livre de vazamentos invertendo o tubo e aplicando uma pressão moderada com a mão.
   5. Use um rotor quase vertical com oito poços para a realização de 5,1 ml tubos de ultracentrifugação para a ultracentrifugação. Selar cuidadosamente os poços do rotor e carregar o rotor para a ultracentrífuga de acordo com a mainstruções do nufacturer. Definir as condições de ultracentrifugação: rotação em 50.000 rpm (cerca de 177.000 xg), a temperatura a 20 ° C, e ultracentrifugação tempo de funcionamento por 40 horas, com vácuo. Selecione a aceleração máxima e desaceleração sem freio.
   6. Uma vez terminado, remova cuidadosamente os tubos do rotor de centrífuga com a pinça. Colocá-los em um rack, sem perturbar os gradientes formados dentro dos tubos. Processe as amostras de fraccionamento de gradiente, logo que possível, para minimizar qualquer difusão.
3. Recuperação de DNA a partir de gradientes isopícnica separados por fracionamento
   1. Usar um sistema de bomba de HPLC com uma precisão de realizar o fraccionamento de gradiente, o qual separa os gradientes igualmente formados a partir do tubo de ultracentrífuga método de deslocamento superior. Ligue a bomba de HPLC (100% gradiente de fluxo) para a garrafa cheia de 1 L de deslocamento DDH ₂ O e firmemente anexar a tubulação da bomba aberta com um 23 G 1 em agulha de seringa. Adicionar suficiente bromophenol corante azul para o DDH ₂ O para dar-lhe uma cor azul escuro. Isto facilita a visualização de interface entre o meio de gradiente e o deslocamento de ddH ₂ O.
   2. Definir a bomba a uma taxa de fluxo de 850 mL / min e equilibrar o sistema até que uma gota da cor azul _ddH2O emerge para fora da agulha de uma seringa.
   3. Cuidadosamente fixar o tubo de ultracentrífuga para uma posição de fixação e perfurar o fundo do tubo com uma seringa de 23 G 1 em agulha longa. Ligar a bomba para o tubo de ultracentrífuga, inserindo a agulha ligada ao tubo da bomba para a parte superior do tubo, e recolher gotas a partir do fundo directamente em tubos estéreis de microcentrífuga de 1,5 ml. Coletar uma fração a cada 30 seg, no valor de cerca de 425 mL por fração e um total de 12 frações por gradiente. Note que a última fracção (fracção 12) contém geralmente o deslocamento _ddH2O e deve ser descartado.
   4. Após o fracionamento, measure a densidade de todas as fracções separadas, utilizando uma balança analítica, como mencionado na etapa 5.1.2.
   5. Precipitar o DNA a partir de cada fracção (em 425 uL) adicionando primeiro uma glicogénio ul (20 ug / ul em _ddH2O, autoclavado) como um transportador para a precipitação de uma baixa quantidade de ADN. Misture bem por inversão.
   6. Adicionar dois volumes (850 uL) de uma solução de (PEG) (dissolver 150 g de polietileno glicol 6000 e 46,8 g de NaCl em _ddH2O para um volume total de 500 ml de polietileno-glicol. Filtro, esterilizar e autoclave. A solução de PEG é 30 % PEG 6000 e 1,6 M de NaCl), e misturar novamente invertendo dez vezes.
   7. Deixar os tubos a temperatura ambiente durante pelo menos duas horas (se for necessário, durante a noite) para precipitar o ADN.
   8. Centrifugar os precipitados a 13.000 xg durante 30 min à temperatura ambiente. A pelota visível devem formar.
   9. Cuidadosamente remove-se o sobrenadante com uma pipeta e lava-se o sedimento com 500 ul de etanol a 70%. Centrifugar sob o mesmocondições para 10 minutos novamente.
   10. Descartar o sobrenadante cuidadosamente e ar secar o sedimento à TA durante 15 min.
   11. Redissolver o sedimento de DNA seco em 30 uL de _ddH2O e misturar bem batendo ligeiramente no tubo. Quantificar o DNA em cada fração gradiente como no passo 4.3 loja as amostras a -20 ou -80 ° C, se o armazenamento de longo prazo é necessária.

6. DNA Caracterização por Pyrosequencing

1. Assegure-se que o ADN nativo não marcado ⁽¹² C) ocupa o intervalo de densidade de 1,705 g / ml a 1,720 g / ml, enquanto que o ADN de ^C-13 marcado tem uma densidade de cerca de 1,720-1,735 g / ml. Note-se que tanto o nativo e ^13-C marcado de DNA extraído a partir de amostras ambientais pode abranger várias fracções do gradiente. Esperar que o ADN de luz para ser associada com as fracções 9-11 e o ADN pesado para ser associada com as fracções 4-6.
2. Combine frações chave para criar um único "compilado" ac fracção representativacordões para a atribuição de pico específico do ADN resolvido densidade. Alternativamente, outros meios para examinar as fracções separadas usando a espectrometria de massa isotópica razão isotópica (IRMS) ²² ou um método de impressão digital, como eletroforese desnaturante (DGGE) ^23, pode ajudar a escolher frações apropriadas antes do seqüenciamento.
3. Realize pyrosequencing dos genes 16S rRNA amplificados por PCR a partir das frações pesadas, médias e leves compilados de cada gradiente individual. Usando este método, a identificação da linhagem e abundância relativa de espécies de bactérias metabolicamente activas no SIP amostras incubadas é possível. Realizar pyrosequencing como se segue:
   1. Realizar amplicão pyrosequencing usando um instrumento FLX Roche 454 com reagentes de titânio.
   2. Prepare amplicons com código de barras para multiplexação usando o primer fusão definir Gray28F (5 - GAGTTTGATCNTGGCTCAG -3) e Gray519r (5 - GTNTTACNGCGGCKGCTG -3) ^24,25 estendido com the respectiva cartilha adaptador A / B e identificadores multiplex-específica da amostra (média).
   3. Aplicar uma PCR de um passo com 30 ciclos, utilizando uma polimerase Hot Start Taq, para gerar a biblioteca de sequenciação.
   4. Sequenciar o amplicons com base no protocolo de fornecedor, e estender a lê a frente (Gray28F) como descrito no http://www.researchandtesting.com/ .

7. Análise de Dados pyrosequencing

1. Analisar a seqüência cru lê gerado pelo 454 pyrosequencing com os "insights quantitativos em ecologia microbiana", software QIIME oleoduto ^26. Executar o processamento da seguinte forma:
   1. Inicialmente, converter o arquivo sff 454-máquina gerado para FASTA, QUAL e arquivos Flowgram com o script process_sff.py.
   2. Validar o arquivo de mapeamento (baseado em check_id_map.py) e atribuir multiplexado lê para sam biológicacípios com o script split_libraries.py. Apare a baixa qualidade termina com um tamanho de janela de correr de 50 e um parâmetro de qualidade média de corte de 25, eliminar também as sequências ambíguas curtas (o comprimento <200 pb) do conjunto de dados.
   3. DeNoise dos dados 454 utilizando o denoise_wrapper.py.
   4. Em seguida, agrupar a alta qualidade lê em unidades taxonômicas operacionais (Otus) usando o método de múltipla OTU escolher (pick_otus.py com 97% de similaridade de seqüência cut-offs).
   5. Escolha uma seqüência representante de cada OTU usando pick_rep_set.py.
   6. Atribuir taxonomia para o conjunto representativo seqüência com base em assign_taxonomy.py. Use o classificador Ribosomal Database Project (RDP) com uma confiança mínima para atribuição recorde de 0,80.
   7. Alinhe a seqüência de representação instituído contra os prealigned principais seqüências 16S GreenGenes usando o algoritmo PyNast (align_seqs.pycom o mínimo seqüência identidade por cento conjunto de 75).
   8. Além disso, esgotar quimeras de uma análise mais aprofundada, executando identify_chimeric_seqs.py.
   9. Remova todas as posições de gap (não úteis para inferência filogenética) com o modelo lanemask (filter_alignment.py) antes da construção de uma árvore filogenética (make_phylogeny.py).
   10. Finalmente, gerar tabelas OTU com make_otu_table.py, descrevendo a ocorrência de filotipos bacterianos dentro de cada amostra. Use a tabela de OTU para construir o mapa de calor para comparar a abundância ea atividade bacteriana.
   11. Se necessário, calcular o alfa e beta diversidade dentro e entre as amostras, respectivamente. Da mesma forma, curvas de rarefação (gráficos de diversidade em função da profundidade de seqüenciamento) e Análise de Coordenadas Principais (PCoA) parcelas representando as relações entre comunidades microbianas pode também estar preparado.

Resultados

Para alcançar rotulagem suficiente das bactérias metabolicamente activas presentes no intestino do insecto, o insecto pode ser exposto ao ¹³ substrato rico em C, durante um período previamente optimizado suficiente para permitir a separação da fracção mais pesada marcado facilmente do não marcado mais leve. No nosso caso, ¹³ C-glucose foi suplementado na dieta artificial a uma concentração final de 10 mM durante 1 dia (Figura 1A). A mesma quantidade de glicose normal

Discussão

O intestino da maioria dos insetos abriga uma comunidade microbiana rica e complexa, normalmente 10 ⁷ -10 ⁹ células procariotas apresentar lá, superando as próprias células do hospedeiro, na maioria dos casos. Assim, o inseto intestino é um "hot spot" para diversas atividades microbianas, representando vários aspectos das relações microbianas, de patogênese para obrigar mutualismo ^27. Embora muitos estudos têm descrito uma incrível variedade de comunidades microbiana...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 Mirror Finish Forceps	Fine Science Tools	11251-23
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00
Speed Vacuum Concentrator 5301	Eppendorf Germany	5305 000.304
Plastic pestle	Carl Roth GmbH Co. Germany	P986.1
NanoVue spectrophotometer	GE HealthCare, UK	28-9569-58
Mastercycler pro/thermocycler	Eppendorf Germany	6321 000.515
Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber	Biometra	Discontinued
Ultracentrifuge (Optima L-90K)	Beckman	A20684
Ultracentrifuge rotor (NVT 90)	Beckman	362752
HPLC pump	Agilent	1100
Quick-Seal, Polyallomer tube	Beckman	342412
Transilluminator UVstar 15	Biometra