Análise sistemática de<em&gt; In Vitro</em&gt; Célula de rolamento usando um sistema microfluídicos Multi-bem placa

Resumo

Este estudo utilizou um sistema de microfluídica multi-bem placa, aumentando significativamente o rendimento dos estudos rolantes célula sob fluxo de cisalhamento fisiologicamente relevante. Dada a importância da laminagem celular na célula de multi-passo homing cascata e a importância de homing celular após entrega sistémica de populações exógenas de células em pacientes, este sistema oferece a possibilidade de uma plataforma de pesquisa para melhorar a terapia de base celular.

Resumo

Um grande desafio para a terapia de base celular é a incapacidade para atingir sistemicamente uma grande quantidade de células viáveis ​​com eficiência elevada para os tecidos de interesse após a infusão intravenosa ou intra-arterial. Consequentemente, o aumento homing celular é atualmente estudada como uma estratégia para melhorar a terapia celular. Célula de rolamento sobre o endotélio vascular é um passo importante no processo de homing célula e podem ser sondados in vitro utilizando uma câmara de fluxo de placas paralelas (PPFC). No entanto, este é um ensaio de transferência extremamente fastidioso, de baixo, com as condições de fluxo mal controlada. Em vez disso, foi utilizado um sistema de microfluídica multi-bem placa que permite estudo das propriedades de rolamento celular em um maior rendimento sob precisamente controlado, fluxo de cisalhamento fisiologicamente relevante ^1,2. Neste artigo, vamos mostrar como as propriedades de rolamento do HL-60 (leucemia promielocítica humana) células em superfícies E-revestido-selectina P-e, assim como em superfícies revestidas de monocamada de células pode ser readily examinada. Para melhor simular as condições inflamatórias, a superfície do canal microfluídico foi revestida com células endoteliais (ECs), que foram, em seguida, activados com fator de necrose tumoral-α (TNF-α), aumentando significativamente as interacções com células HL-60 em condições dinâmicas. A taxa de transferência melhorada e multi-parâmetro plataforma de análise de software integrado, que permite a rápida análise de parâmetros como rolando velocidades e caminho de rolamento, são vantagens importantes para avaliar as propriedades da célula rolando in-vitro. Permitindo a análise rápida e precisa de abordagens de engenharia destinados a impactar rolamento celular e homing, esta plataforma pode ajudar a terapia baseada em células exógena antecedência.

Introdução

Um dos principais desafios na tradução clínica de sucesso da terapia baseada em células é a entrega ineficiente ou direcionamento de células sistemicamente infundidos aos locais desejados ^3,4. Consequentemente, há uma busca constante de abordagens para melhorar homing celular e, especificamente, celular rolando, como uma estratégia para melhorar a terapia celular. Celular rolando sobre os vasos sanguíneos é um passo fundamental na cascata homing célula, classicamente definidos para leucócitos que são recrutados para sítios da doença ^5. Este passo é governado por interacções específicas entre selectinas endoteliais, isto é, P-e E-selectina seus ligantes de contador na superfície de leucócitos ^5,6 (P-e E-sel), e. Para uma melhor compreensão e melhoria da eficiência de homing celular e, especificamente, a etapa de rolamento, são de grande importância na busca de novas plataformas para melhorar a terapia baseada em células. Até agora isso tem sido conseguido através de câmaras de fluxo de placas paralelas (PPFCs), compreendendo dois plataforma planaes com uma junta entre eles, com uma porta de entrada e saída localizada sobre a placa superior, através da qual uma suspensão de células é perfundido através da utilização de uma bomba de seringa, ^{7,8, 9.} A superfície da placa de fundo pode ser revestida com uma monocamada de células / substratos relevantes e a interacção entre as células e a superfície perfundidos sob fluxo de cisalhamento é então explorado ^7. No entanto, PPFC é uma baixa, reagente-consuming, e método bastante tedioso, com formação de bolhas, vazamento e refluxo mal controlada apresentando grandes inconvenientes.

Uma técnica alternativa para o PPFC tradicional é um sistema de microfluídica placa multi-bem, o que permite maior desempenho de transferência de ensaios celulares (até 10 vezes maior do que PPFCs) sob, o fluxo de cisalhamento controlado por computador precisa, com baixo consumo de reagente ^1,10. Experiências de rolamento celular são realizados no interior dos canais de microfluidos, que pode ser revestido com as monocamadas de células ou substratos modificados e usi fotografadang de um microscópio, com propriedades de rolamento facilmente analisados ​​utilizando um software adequado. Neste estudo, demonstramos a capacidade deste sistema de microfluídica placa multi-bem, estudando as propriedades de rolamento de leucemia promielocítica humana (HL-60) células em diferentes superfícies. HL-60 de rolamento em substratos como a P-e E-sel, bem como sobre monocamadas de células que expressam diferentes receptores de rolamento, foi analisado. Além disso, o anticorpo (Ab) bloqueio foi usado para demonstrar o envolvimento directo de selectinas específicas na mediação do movimento de rolamento de células HL-60 sobre essas superfícies. Experimentos rolamento foram realizados com maior produção, sob fluxo de cisalhamento estável, com o mínimo consumo de reagente / celular, permitindo a análise eficiente dos parâmetros-chave do rolamento tais como a velocidade de rolamento, o número de células de rolamento, e rolando propriedades do caminho.

Protocolo

1. Cultura de Células

1. Leucemia promielocítica humana (células HL-60)
   1. Culturas células HL-60 em 75 centímetros ² frascos com 15 ml de Iscove Modified Médio (IMDM) de Dulbecco, suplementado com 20% (v / v) de soro fetal bovino (FBS), 1% (v / v), L-glutamina e 1 % (v / v) de Penicilina-Estreptomicina.
   2. Mudança de mídia a cada 3 dias por aspiração metade do volume de suspensão celular e substituindo-o por meios IMDM completa.
   3. Para diacetato de carboxifluoresceína, coloração de éster de succinimidilo (CFSE), centrífuga de HL-60 de suspensão de células (400 x g, 5 min), ressuspender em uma solução de 1 ^ M de CFSE (preparado em PBS pré-aquecido) e incubar durante 15 min a 37 ° C. Em seguida, as células de centrífuga, sobrenadante aspirado e as células ressuspender em meio pré-aquecido fresco por 30 min. Lave as células em PBS e depois usar para experimentos de rolamento (ver Figura 1B imagem representativa de CFSE corados células HL-60 em P-revestido de superfície para sel).

Nota: coloração CFSE é opcional, e é apresentado aqui para demonstrar o fenômeno de rolamento no canal microfluídicos. Análise dos parâmetros de laminação apresentados neste manuscrito foi realizada em células não coradas usando imagens de campo claro padrão.

2. Células endoteliais microvasculares Pulmonares (LMVECs)
   1. O revestimento 100 milímetros pratos de Petri com solução de gelatina a 0,1% (v / v em PBS) e incuba-se a 37 ° C durante pelo menos 30 min.
   2. LMVECs cultura em placas de Petri de 100 milímetros revestido com gelatina em meio completo de crescimento endotelial (endotelial basal médio 2 (EBM-2)), suplementado com um kit de suplemento de crescimento específico, ver REAGENTES). Mudança de mídia a cada dois dias e as células sub-cultura ao atingir 80-90% de confluência.
   3. Para a sub-cultura, lavar as células com PBS e, em seguida, separar as células com 4 mL de 1x tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C e neutraliza em um volume igual de completos EBM-2 media. Transferência da suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifuge (400 xg, 5 min). Após a centrifugação, ressuspender o sedimento em 1 ml de meio completo endoteliais e contagem de células com um hemocitómetro. Não excesso de passagem das células, como isso afeta sua morfologia e função de usar apenas as células com menos de 7 passagem para todos os experimentos.

3. Ovário de hamster chinês-P-selectina (CHO-P) Células
   1. Células CHO-P, que são células CHO transfectadas estavelmente para expressar humano P-sel, foram fornecidos por colaboradores (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School) ^11,12.
   2. Células Cultura CHO-P no T175 cm ² frascos de 25 ml de F-12 mídia.
   3. Para passaging, lavar as células com 10 ml de PBS durante 4-5 segundos e depois trypsinize em 10 ml de 1x tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C, seguido de neutralização em meios completos.
   4. Centrifugar a suspensão de células (400 x g, 5 min), aspirar o sobrenadante cuidadosamente, ressuspender o sedimento de células em 1 ml de meio cheios e contagem das células comum hemocitômetro.

2. Operação do Sistema Integrado Microfluidic Multi-bem placa

1. Certifique-se que todo o equipamento está conectado corretamente e ligar os diferentes módulos: computador, controlador, microscópio invertido, e câmera CCD.
2. Abra o software de imagem, certifique-se o módulo de placa multi-bem eo módulo de imagem são devidamente apresentados na tela.
3. Conecte os tubos para a armadilha de vapor (ligado ao controlador) e também conectá-los para a interface de pressão.
4. Colocar a placa de multi-poços na placa de aquecimento / adaptador. Adicionar reagentes aos poços (a seguir descritos) e interface de prender em cima da placa. Coloque a placa para a imagem latente no palco automatizado.
5. A interface anexa à parte superior da placa e se aplica uma pressão pneumática a partir do controlador para o topo dos poços, a condução do fluido através dos canais de microfluidos para o caudal definido, facilmente controlados utilizando a placa de multi-poçostela do módulo no modo Manual.
6. Reagentes do canal de fluxo através de uma área de observação, localizado entre os poços. Dimensões do canal microfluídicos são 350 m de largura x 70 mM de altura. O comprimento do canal linear é de 1 mm e na parte inferior dos canais compreende uma lamela de vidro de 180 um, o que é compatível com o campo claro, de fase, de fluorescência e microscopia confocal.
7. Adquirir vídeos usando uma câmera CCD (aquisição de fluxo, 11 frames / seg) e analisar através de software compatível.

3. Revestimento de Canais Microfluidic com um substrato proteico ou uma monocamada de células

1. Revestimento de canais microfluídicos com fibronectina ou P-/E-selectin
   1. Preparar 1 mL de 20 ug / ml de solução de fibronectina em PBS. Alterar o volume com base no número de canais a serem revestidas (usar 25-50 ul de fibronectina por canal).
   2. Adicionar 25-50 mL de solução de fibronectina para cada entrada bem. Aplicar a força de cisalhamento de 2 dyn / cm ²durante 5 minutos para perfundir o canal. Por favor, note que a gota de líquido que aparece na saída do bem. Incubar durante 30-45 minutos à TA
   3. Aspirar a solução de poços (não aspirar diretamente do círculo do meio que alimenta o canal) ^1,13. Adicionar 200-500 ul de PBS a uma tomada bem e lavar com PBS canal por aplicação de fluxo de cisalhamento de 2 dines / cm ² durante 5 min. O canal é agora devidamente revestidos com fibronectina e pronto para ser utilizado.
   4. Para revestir com P-ou E-sel, preparar uma solução a 5 mg / ml de proteína recombinante humana desejada em PBS, e os canais de revestimento tal como descrito acima, com 1 h de incubação a 37 ° C para permitir que o revestimento de superfície.
2. Criação de CHO-P ou LMVEC monocamada dentro do canal microfluídicos
   1. Suavemente trypsinize células de placas de cultura durante 3 min, têmpera usando um volume de 2 vezes de meios completos e centrifugação (5 min a 400 x g). Suspenda as células com 10 ml de meio completo e centrifugar (5 min a 400 xg) again.
   2. Contar as células para determinar a concentração de células na suspensão. Para assegurar a formação de uma monocamada confluente LMVEC no interior do canal, trazer a concentração de células de 15-20 milhões de células / ml. Para confluente CHO-P monocamada de células, usar 50-60000000 células / ml. Número inicial de células utilizado para determinar a experiência em conformidade - Use 25-50 mL de suspensão de células para cada canal.
   3. Adicionar 25-50 mL de suspensão de células na concentração apropriada para a entrada do poço. Coloque a placa no palco microscópio e introduzir células no canal (2 dyn / cm ²⁾ até que as células são observadas na tela preenchendo os canais inteiros, e depois parar o fluxo.
   4. Preencha tanto saída e de entrada com 200 mL de tanto LMVEC cheio ou meio CHO. Deixe as células assentar e aderir durante 3 horas na incubadora (37 ° C, 5% CO _2).
   5. Após a incubação de 3 horas, lave o canal com total media (2 dyn / cm ^2, 10-15 min) para remover desapegadocélulas. As células devem agora aparecer completamente confluentes eo canal já está pronto para uso. Dependendo da densidade de sementeira inicial de células, 2-3 hr adicional de tempo de estabilização pode ser necessário para assegurar a cobertura completa da superfície com as células.

4. LMVEC Activation Pro-inflamatório e anticorpo bloqueador de P-/E-selectin

1. Prepara-se uma solução de TNF-α (10 ng / ml) em meio basal LMVEC.
2. Para induzir a activação inflamatória do LMVEC nos canais, adicionar 100 ul da solução de TNF-α para a entrada e assim introduzir a solução para dentro do canal por aplicação de fluxo de cisalhamento de 2 dines / cm ² durante 5 min. Para canais de controlo (células endoteliais não activado), adicionar 100 ul de LMVEC meio basal para a entrada e assim introduzir no interior do canal (2 dines / cm ² a 5 min). Canal está pronto para um ensaio de rolamento.
3. Para bloquear P-sel e E-sel em LMVECs e células CHO-P, introduzir neutralizar P-sel (clone AK4, 5 mg / ml em bameios de sal) ou E-sel (P2H3 clone, 5 ug / ml em meio basal) anticorpos para o canal e incubar durante 1 hora a 37 ° C. Em seguida, lava-canais com meio basal (2 dines / cm ² a 5 min). Canais estão prontos para um ensaio de rolamento.

5. HL-60 Rolando Ensaio sobre Substrato / Telemóveis Revestido-monocamada canais microfluídicos

1. Examinar cuidadosamente os canais ao microscópio para confirmar que os canais são adequadamente revestidas (no caso do revestimento com células, uma monocamada confluente de células plenamente devem ser observados).
2. Para preparar a HL-60 de suspensão de células para as experiências de rolamento, centrífuga HL-60 de suspensão de células (5 min a 400 xg) e lavar uma vez com meio basal. Contar as células e ressuspender em IMDM (meios basais, contendo Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +)} para criar uma suspensão de células HL-60 com 5 milhões de células / ml. Use 25-50 ul de suspensão celular para cada canal para realizar o ensaio de rolamento.
3. Adicionar 25-50 mL da suspe celularnsion para a saída bem, colocar a placa dentro placa titular o controlo de temperatura (37 ° C) e no palco microscópio. Em seguida, introduzir células no canal através da aplicação de força de cisalhamento de 2 dyn / cm ² (células devem ser observados dentro de 10-15 seg fluindo da tomada de entrada).
4. Para examinar a resposta de rolamento como uma função da tensão de cisalhamento, para reduzir o cisalhamento 0,25 dines / cm ² e 20-30 adquirem vídeos sec (utilizando a função "aquisição de fluxo") em cada corte desejado (cisalhamento aumentam gradualmente a partir de 0,25 até 5 dines / cm ^2. Também é possível a utilização de tesouras mais elevados).
5. Adquirir vídeos usando uma câmera CCD (aquisição de fluxo, 11 frames / seg) e analisar os caminhos de rolamento e rolamento velocidades através de um software compatível.

6. Citometria de fluxo para detectar a expressão de moléculas de superfície

1. Após tripsinização, preparar uma suspensão de células (com 1-2 x 10 ⁵ células / amostra) de tipo de célula desejada (HL-60, CHO-P ou LMVECs) em PBS (- / -), suplementado com 2% de FBS. Lave as células duas vezes e trazer o volume da amostra de 50 ul (utilizando o mesmo tampão).
2. Incubar cada amostra com o fluoróforo conjugado desejado Ab (ver tabela em anexo para obter informações detalhadas) a 4 ° C por 20 min (cubra com papel alumínio).
3. Lave as células duas vezes (mesmo tampão) e trazer o volume final da suspensão de células coradas com 200 ul. Analisar amostras usando um citómetro de fluxo para detectar a expressão de moléculas de superfície.

Resultados

Células HL-60 rolam em superfícies P-e E-selectin, mas não sobre f ibronectina

Células HL-60 são considerados "rolos" padrão de ouro em que expressam uma variedade de ligandos homing, incluindo os ligantes de rolamento P-glicoproteína ligando sel-1 (PSGL-1) e sialil-Lewis X (sLex) ^5,14 (Figura 1A ). A proteína de superfície PSGL-1 age como um andaime para o tetra-sacarídeos Slex, mediando a interação específica com P-e E-sel, que são sobre-reg...

Discussão

Um dos grandes desafios na tradução bem sucedida de terapia baseada em células exógena é a incapacidade de produzir com eficiência células para locais de lesão e inflamação com alta eficiência de enxerto ^3. Laminagem celular representa um passo crítico no processo de homing célula, facilitando a desaceleração de células nas paredes de vasos sanguíneos, o que levou à sua adesão firme e transmigração através do endotélio para os tecidos ^5. Para uma melhor compreensão do proces...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Lung Microvascular Endothelial Cells	Lonza	CC-2527
P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P)	Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12
HL-60 Cells	ATCC	CCL-240
Cell Culture Reagents
Endothelial Basal Medium	Lonza	CC-3156
EBM-2 Media	Lonza	CC-3156
Endothelial Basal Medium Supplements	Lonza	CC-4147
EGM-2 MV SingleQuots	Lonza	CC-4147
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x	Gibco	12440
F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham)	Gibco	11765-054
Penicillin Streptomycin (P/S)	Gibco	15140
L-Glutamine (L/G) 200 mM	Gibco	25030
Fetal Bovine Serum (FBS)	Atlanta Biologicals	Sa550
Petri Dishes	BD Falcon	BD-353003
100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene
Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes)	MedSupply Partners	TC1500
T75 Flasks	BD Falcon	353136
Gelatin Solution (2%)	Sigma	G1393
dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride)	Sigma	D8537
Trypsin-EDTA Solution (10x)	Sigma	T4174
Antibodies
Anti-hE-Selectin/CD62E	R&D Systems	BBA21
FITC Conjugated Mouse IgG1	R&D Systems	BBA21
Anti-hP-Selectin	R&D Systems	BBA34
FITC Conjugated Mouse IgG1	R&D Systems	BBA34
FITC Mouse IgG­1 κ Isotype Control	BD Bioscience	555748
Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18	Santa Cruz	SC70545
FITC Conjugated	Santa Cruz	SC70545
Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control	Santa Cruz	SC2859
PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1	BD Pharmingen	556055
PE Mouse IgG1 k Isotype Control	BD Pharmingen	550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4)	Santa Cruz	SC19996
Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3	Millipore	MAB2150
Mouse IgG1 Isotype Control	Santa Cruz	SC3877
Other Reagents
Recombinant Human TNF-alpha	PeproTech	300-01A
Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry	Invitrogen	C34554
Human P-selectin-FC recombinant protein	R&D Systems	137-PS-050
Human E-selectin-FC recombinant protein	R&D Systems	724-ES-100
Fibronectin Human, Plasma	Invitrogen	33016-015
Equipment
Bioflux 1000	Fluxion Biosciences	Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data
BioFlux 48-well plates	Fluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD Bioscience	CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data
Nikon Eclipse Ti-S	Nikon
CoolSnap HQ2 CCD camera	Photometrics