Ativação e Mensuração de NLRP3 inflammasome Atividade Usando IL-1β em células dendríticas humanas Monocyte derivados

Resumo

As células dendríticas (CDs) segregam IL-1β em resposta ao reconhecimento de purina TLR8 sintético, R848, seguido por activação inflammasome NLRP3 com nigericina, por conseguinte, a IL-1β pode ser utilizado para medir a actividade inflammasome NLRP3. Coloração intracelular de citocinas, immunoblotting e ELISA são usados ​​para medir com precisão NLRP3 inflammasome priming e ativação via expressão de IL-1β.

Resumo

Processos inflamatórios resultantes da secreção de interleucina (IL) -1 citocinas família de células do sistema imunológico levar à inflamação local ou sistêmica, remodelação e reparação tecidual e controle virológico ^{1, 2.} Interleucina-1β é um elemento essencial da resposta imune inata e contribui para eliminar agentes patogénicos invasores, evitando a criação de uma infecção persistente ^1-5.

Inflammasomes são a plataforma de sinalização fundamental para a ativação da enzima conversora de interleucina 1 (ICE ou Caspase-1). O inflammasome NLRP3 requer, pelo menos, dois sinais em DCs para provocar a secreção de ^IL-6 1β. A expressão da proteína pro-IL-1β é limitado em células em repouso; Por conseguinte, um sinal de iniciação é necessária para a transcrição IL-1β e a expressão da proteína. Um segundo sinal detectado pelo Nlrp3 resultados na formação do NLRP3 inflammasome multi-proteína. A capacidade das células dendríticas que respond para os sinais requeridos para a secreção de IL-1β pode ser testado utilizando uma purina sintético, R848, que é detectada por TLR8 em monócitos humanos derivados de células dendríticas (moDCs) de células principais, seguido de activação da inflammasome NLRP3 com a toxina bacteriana e ionóforo de potássio, nigericina.

DCs derivadas de monócitos, são facilmente produzidas em cultura e fornecer um número significativamente maior do que as células purificadas DCs mielóides humanos. O método aqui apresentado difere de outros ensaios inflammasome em que ele usa em humanos in vitro, em vez de ratinho derivada, permitindo assim DCs para o estudo da inflammasome na doença humana e infecção.

Introdução

A ativação do sistema imune inato é necessário para orientar as respostas imunes adaptativas durante a infecção, doença e vacinação ^7. As células dendríticas são o antigénio mais potente que apresenta as células do sistema imune inato; eles são especializados para a absorção de antígenos, a migração para os gânglios linfáticos, e ativação de ingênuo CD4 ⁺ e as células T CD8 ⁺ citolítica ^8-10. Para permitir a detecção de patógenos rápida do sistema imune inato utiliza inúmeros receptores de reconhecimento padrão germinativas codificado (PRR) que reconhecem patógenos conservada motivos derivados ou host derivado marcadores de estresse celular e danos. Toll like receptors (TLRs) são receptores de reconhecimento padrão membrana ligada que reconhecem determinado patógeno fagocitada extracelular padrões associados moleculares (PAMPs) e padrões moleculares de perigo associado (amortece). Ao aceno contraste como receptores (NLRs) são citosólica e responder a uma gama diversificada de PAMPs e DAMPs. Nod like receptors reapresentar uma segunda linha de defesa contra patógenos que escapam da superfície celular e PRRs endocíticas. A interação do patógeno derivada, ou "perigo" associado, fatores com TLR e NLR ligantes leva a um estado de maturação DC resultando em aumento da interação DC com outras células do sistema imunológico e na promoção de células T e ativação das células natural killer ^11.

Interleucina-1β é um componente crucial da defesa do hospedeiro contra a infecção. Mediante o reconhecimento de um microrganismo, a citoquina altamente pró-inflamatória IL-1β, é segregada e funciona como um atractivo químico e activador de células imune inata e adaptativa. In vivo de IL-1β é em grande parte responsável pela resposta de fase aguda, incluindo febre e citocinas inflamatórias síntese ^12.

A maioria dos NLRs conter uma leucina do terminal C rico domínio de repetição que é pensado para funcionar na detecção do ligando, um domínio de ligação de nucleótido central (NACHT) que é important para NLRP3 oligomerização e um domínio efetor terminal de N (PYD em NLRP3) que medeia a transdução de sinal para alvos a jusante através de interações proteína proteína. A proteína NLRP3 define o complexo inflammasome mais intensamente estudado. Esta proteína é um membro da família NLR e tem a capacidade de formar um complexo de proteína molecular de vários compostos de NLRP3, o PYCARD proteína adaptadora (também conhecido como ASC), e ICE. Após a ativação inflammasome PYCARD liga a domínios terminais NLRP3 N e recruta ICE via ativação da caspase e domínio de recrutamento (cartão) domínios. A interleucina-1 da enzima de conversão é inicialmente gerado como um zimogénio que contém um motivo CARTÃO na sua extremidade N-terminal. Resultados de formação inflammasome em trazer duas moléculas ICE suficientemente perto para induzir sua ativação autocatalítica. O complexo inflammasome é necessário para activação de ICE, assim permitindo que a converter citoplasmática pró-IL-1β para amadurecer citocina.

Secreção de IL sucedida-1β em DCs requer detecção de dois sinais diferentes e independentes de perigo. Primeiro, TLR detecção de PAMPs, DAMPs, ou sinalização de citocinas (TNF ou IL-1β) provoca uma regulação positiva da expressão citoplasmática de proteínas pró-IL-1β. Uma segunda, muitas vezes diferentes, o sinal é necessário para a formação do complexo inflammasome a montante de maturação ICE. Alguns inflammasome estimulando sinais incluem poros da membrana bacteriana formando toxinas (como nigericina), lisossomais interromper cristais (tais como cristais de urato monossódico, MSU) e ATP extracelular. O mecanismo montante levando a ativação NLRP3 inflammasome por esses diversos ativadores não é clara. Estudos investigando sinalizando a montante da formação inflammasome propõe que os eventos intracelulares, tais como a indução da hipocalemia ou espécies reativas de oxigênio (ROS) indiretamente ativar o inflammasome ^13-28.

Entre os diferentes activadores virais do inflammasome NLRP3 é gripe, que fornece both o sinal primário e secundário necessário para a secreção de IL-1β ^{3, 29-33.} Usando modelos de mouse NLRP3 knockout verificou-se que a secreção de IL-1β em DCs é NLRP3 dependente ^32. Além disso, ratinhos knockout Nlrp3 atraído menor número de leucócitos para o local da infecção e experimentaram maior mortalidade ^{2, 5.} Dois artigos recentes sugerem um mecanismo para a ativação inflammasome NLRP3 durante a infecção pelo vírus Influenza; em primeiro lugar, por meio de priming reconhecimento de ARN viral por TLR7 TLR8 ou (dependendo expressão TLR da célula responder) ou através de detecção de bactérias comensais por outro TLR para induzir a expressão citoplasmática pró-IL-1β, seguido por um segundo sinal, a activação de NLRP3 formação inflammasome pela proteína de canal iônico viral M2 na rede de Golgi trans ^{33, 34.} No último passo, o desencadeamento de inflammasome NLRP3 é realizado por perturbação do intracelular iónico meio que conduz a produção de ROS, que é, simplesmente, detectada por NLPR3 como um sinal de modo a formar o inflammasome. No entanto, o mecanismo preciso de inflammasome montante activação de actividade da ICE durante a infecção da gripe ainda permanece incerto.

Este trabalho descreve uma técnica valiosa para o estudo da inflammasome NLRP3 em moDCs humanos que pode ser usado como uma base para uma investigação mais aprofundada da via subjacente DC baseado secreção de IL-1β em resposta a TLR8 ligadura com R848 seguido pela ativação do inflammasome por um bem activador conhecido de NLRP3, nigericina. Variações deste método pode ser usado com outros tipos de células, incluindo, mas não limitados a: monócitos, macrófagos, outros subconjuntos DC, e células epiteliais.

Protocolo

Declaração de Ética: Amostras de pesquisa são obtidos e armazenados para pesquisa com o consentimento dos doadores. Todas as amostras devem ser codificadas ou anónimos, antes da utilização. Este protocolo segue as diretrizes do nosso Conselho de Revisão Institucional.

1. Diferenciação de monócitos do sangue periférico em células dendríticas derivadas de monócitos.

Nota: cremes leucocitários humanos servir como fonte de células do sangue periférico humano (PBMC) e foram obtidos a partir do Centro de Sangue de Nova Iorque (New York, NY). Doadores de sangue são voluntários saudáveis. O procedimento de cinco dias começa com o revestimento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) em cultura de tecidos frascos ^35,36. Diferenças notáveis ​​dos protocolos publicados são os seguintes:

1. Utilizar 225 centímetros ² não pirogénicas frascos de cultura de tecido poliestireno com uma tampa de filtro de aderir um total de 2x10 ⁸ PBMC por frasco de 10 cm em vez de poliestireno placa de cultura de tecidoss (58 cm ²⁾ (passo 1).
2. Prepare meios com 5% de soro humano reunido (PHS; 30 ml) em 500 ml de RPMI-1640 + L-glutamina, tampão de 5 ml de HEPES 1 M, e 1,4 mL de 50 mg / ml de gentamicina (5% mídia PHS), seguido por filtração através um filtro de 20 | iM. Adicionar um total de garrafa de cultura de 50 ml de 5% mídia PHS por 225 centímetros ² tecidos.
3. Lave células aderidas três vezes com 25 ml fresco RPMI-1640. Agite vigorosamente durante 5 segundos durante cada lavagem e aspirar as células aderentes não (passo 4).
4. Adicionar 190 ul de 400 UI / ul IL-4 e 380 ul de 100 UI / mL de GM-CSF por balão (passo 3) no dia 0, 2, e 4. Dia 0 é definido como o dia PBMC são semeadas no Passo 1 (Passo 8).
5. Dia de colheita 5 moDCs a uma concentração de 1x10 ⁶ células / mL (etapa 15).
6. Use moDCs imediatamente em seu estado de repouso. Passos 17-22 nunca são executadas. Nota: As amostras devem ser processados ​​o mais rápido possível após a coleta para obter melhores resultados.
7. MoDCs alíquotas de cada concentraçãoção de 2x10 ⁵ células / poço (200 ul / poço de ⁶ a 1x10 células / ml) em uma placa de 96 poços de fundo redondo (western blot, ELISA, FACS), ou para um chamberslide poli-L-lisina tratada (microscopia) para experimentação . Nota: Há pelo menos quatro condições: Completamente não estimulado (controle negativo), priming, Só ativação e condicionamento seguido de ativação. As condições podem ser expandidas para incluir controlos de diluente para R848 e nigericina se desejado. Se o ensaio a jusante é ICS, duplicatas são necessárias para controles isotipo.

. 2 Priming o inflammasome - Sinal 1

1. Reconstituir R848 liofilizado em DMSO de acordo com as instruções do fabricante. Diluir estoque trabalhando em RT com RPMI-1640.
2. Adicionar R848 a uma concentração final de 10 uM para poços de 18 horas apropriadas. Colocar as células em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO _2.

3 Ativando o NLRP3 inflammasome -. Signal2

1. Reconstituir nigericina liofilizado em etanol de acordo com as instruções do fabricante. Diluir estoque de trabalho, à TA, com meio RPMI-1640 antes da adição às condições adequadas.
2. Adicionar nigericina a uma concentração final de 20 uM e retornar para o incubador a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 6 horas. Não há etapas de lavagem ocorrer entre priming e durante a ativação. Nota: A secreção de IL-1β é aumentada pela presença de ionóforo de cálcio, brefeldina A, monensina, dinitrofenol, ou cianeto de carbonilo clorofenilhidrazona ^{37, 38.} Portanto, a adição destes inibidores de secreção não são recomendadas na análise de iniciação ou actividade inflammasome uma vez que irá alterar a secreção de IL-1β.

4. Coleta de Amostras IL-1ß

1. Centrifugar a placa com as células e os sobrenadantes a 974 xg durante 3 min.
2. Sem perturbar o sedimento celular, aspirar o sobrenadante e transferir para aeparate de fundo redondo de chapa, a fim de medir a secreção de citocinas a partir dos sobrenadantes. Nota: Os sobrenadantes podem ser temporariamente armazenados a -20 ° C ou -80 ° C para armazenamento a longo prazo.
3. Lavar os sedimentos celulares por três vezes com 200 ul de 1x PBS a 974 x g durante 3 minutos para remover qualquer extracelular de IL-1β das amostras celulares. Nota: Ao lavar pellets de células de uma placa de 96 poços, retire a lavagem por inversão placa rápida em uma caixa de coleta, de modo a não perturbar a amostra.

5. Medição de IL-1b a partir de amostras celulares e sobrenadantes

1. Coloração de citocinas intracelulares (ICS): O protocolo ICS está descrito abaixo ^{39, 40.} Nota: não suspender as células se o ensaio a jusante é a microscopia. Todas as lavagens e aspirações deve ser feito sem perturbar a camada de células / pelete (dependendo do ensaio a jusante).
   1. Adicionar 100 ul de 5% de meio PHS em poços apropriados. Adicionarvolume apropriado (cerca de 1 ⁵ μl/2x10 células, ou 1 mL / poço) de marcado por fluorescência α-CD11c e α-CD14 (marcadores fenotípicos, clone B-ly6 e MφP9, respectivamente), ou controlo de isotipo para as células durante 10 min a RT no escuro.
   2. Lavar três vezes com 1x PBS a 974 x g durante 3 min.
   3. Fixar as células por adição de 100 mL de 4% de PFA durante 20 min à RT, no escuro.
   4. Pausa Point: Lavar com 100 l 1x PBS a 974 xg por 3 min e armazenar a 4 ° CO / N em 1x PBS.
   5. Adicionar 100 ul de tampão de permeabilização de células durante 30 min. Nota: tampão de permeabilização é composto de 1x PBS com 0,3% de Triton X-100, e 1% de albumina de soro bovino (BSA) para a permeabilização. Não perturbe células aderentes ao ensaio a jusante é a microscopia.
   6. Adicionar o volume apropriado (cerca de 62 ng antibody/2x10 ⁵ células, ou cerca de 2,5 uL / poço) de α-IL-1β-FITC (clone 8516) ou controlo de isotipo para2 horas numa incubadora a 37 ° C.
   7. Lave as células três vezes com 200 ul de tampão de permeabilização em 974 xg durante 3 minutos no escuro.
   8. Opcional: Coloração com DAPI, adicionar montagem, e colocar lamelas delicadamente no topo de uma lâmina de vidro. Permitir montagem para curar O / N antes de capturar imagens de microscopia.
   9. Adquirir os dados por FACS ou microscopia. Nota: Compare o isotipo para cada condição para a coloração adequada na análise por FACS ou microscopia.
      1. CAA: Adquirir uma amostra de cada vez. Defina o FSC / SSC portão nas células vivas, seguido de gating em CD11c ⁺ CD14 ^- células antes de analisar a população MODC pró-IL-1β coloração.
      2. Microscopia: Defina o tempo de exposição, usando a amostra coloração positiva - R848 tratada. Use DAPI ⁺ pró-IL-1β ⁺ e DAPI ⁺ pró-IL-1β ^- para determinar a percentagem de pró-IL-1β + expressam moDCs.
2. SDS-Página: Immunoblotting é realizado para detectar pró-IL-1β. Nota: A técnica descrita a seguir combina técnica padrão imunotransferência, gradiente de 4-20% de gel de poliacrilamida, e a detecção fluorescente ou quimioluminescente, ^{41, 42.}
   1. Lisar as células directamente em 10 uL de tampão de lise desnaturante (5 ul β-mercaptoethanol/950 tampão de amostra Laemmli ul seguido por diluição a 1:1 com tampão de lise celular). Transferir o lisado para tubos de 1,5 ml de Eppendorf.
   2. Lisado de calor em uma placa seca durante 10 minutos a 100 ° C.
   3. Girar a 20.800 xg lisado num minicentrifuge durante 1 min para concentrar o volume de líquido. Pause ponto: as amostras podem ser congeladas a -20 ° C para armazenagem de curta duração.
   4. Carregar o volume total sobre o gel de poliacrilamida. Executar 140 V através da caixa de gel para cerca de 1 hora, ou até a frente do corante sai da parte inferior do gel.
   5. Transferir a proteína a partir do gel de poliacrilamida para uma membrana Immobilon-PVDF Membr FLane durante 90 min a 100 V. Bloquear a membrana com 5% de BSA em tampão salino Tris / 0,1% de Tween-20 (TBS-T) durante 1 hora. Nota: PVDF Immobilon-FL é melhor para uso com detecção fluorescente. Uma membrana com uma composição diferente é recomendado para outras técnicas de detecção para aumentar o sinal para relação de fundo.
   6. Dilui-se anticorpos primários e secundários, em 10 ml de 5% de BSA / TBS-T. Realizar as incubações de anticorpos primários a 4 ° CO / N, agitando e anticorpo secundário à temperatura ambiente durante 1 hora, agitando.
   7. Lava-se a membrana três vezes com TBS-T, durante 5 minutos, agitando entre as incubações do anticorpo primário e secundário e de novo entre as incubações secundárias e de imagiologia. Nota: As bandas podem ser detectados utilizando fluorescente ou de detecção quimioluminescente. Siga as instruções do fabricante para a detecção.
3. ELISA: As amostras que são congelados para armazenamento necessita equilibrar à temperatura ambiente antes da análise. Gire para baixo as amostras em uma centrífuga para consolidar CONDENS sobrenadanteção. Siga as instruções do fabricante para a medição de IL-1β. Nota: Neste protocolo IL-1β é especificamente medido; No entanto, a medição simultânea de TNFa, IL-6, e o imunomodulador citocina IL-10 assegurar as condições apropriadas foram sensibilizados.

Resultados

Estas técnicas medir TLR8 priming com R848. Coloração citocina intracelular para pró-IL-1β permite a microscopia e FACS leituras de CD14 ^- CD11c ⁺ moDCs. Ambas as técnicas podem ser quantificados em relação a um não carregadas, ou de descanso, controlo de células, bem como um controlo do isotipo (Figuras 1 e 2). Percentagem de células pró-IL-1β ⁺ coloração é multiplicado pela média geométrica da população para fornecer a intensidade de fluorescência ...

Discussão

As citocinas inflamatórias são essenciais na condução da resposta imune inata e adaptativa para combater a infecção viral. Secretado IL-1β tem sido demonstrado que o aumento durante a infecção da gripe ^{3, 43, 44.} Os mecanismos exactos pelos quais essas citocinas são processados, em resposta ao reconhecimento viral em células dendríticas humanas não são completamente compreendidos. Mielóides kits de isolamento DC são caros e demorados. Kits de isolamento e FAC classificação pode involuntariam...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
IL-4	R&D
GM-CSF	Genzyme	NDC 58468-0180-2	We acquire this item through our local pharmacy with a prescription
RPMI 1640 with L-glutamine	Cellgro	10-040-CV
Peripheral blood mononuclear cells	New York Blood Center		PBMCs were isolated from the blood of healthy donors
12 well tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3516
96 well round bottom tissue culture plates	Sigma-Aldrich	3799
α-IL-1β-FITC	R&D	IC201F
FITC isotype control	Miltenyi Biotec	130-092-213
α-β-Tubulin	Santa Cruz	SC-9014
α-IL-1β	R&D	mab201
PVDF Immobilon-FL membrane	Millipore	IPFL00010
gradient 4-12% polycrylamide gel	Bio Rad	161-1159
Laemmli sample buffer	Bio Rad	161-0737
BSA	Equitech Bio Inc		30% solution sterile/filtered
PFA	Electron Microscopy Sciences	15710	16% solution
Human inflammatory cytokine bead array kit	BD	551811
Nigericin	Invivogen	tlrl-nig
R848	3M Corp.
α-CD14	BD	340436
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
TBS			On site stock room
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225 cm2, Filter Cap, 70 ml working volume, 30/Cs	Thermo Scientific	159933
20 μM Sterile Disposable Filter Units	Thermo Scientific	569-0020
HEPES	Invitrogen	15630080
Goat α-mouse IRDye 800CW	Licor	926-32210
Donkey α-rabbit IRDye 680RD	Licor	926-68073
Spectra multicolor broad range protein ladder	Thermo Scientific	26634
Tris Glycine SDS 10x	Bio Rad	1610732
Tris Glycine 10x	Bio Rad	161-0734
Methanol - 4 L	Fisher Scientific	A433P-4
8 chamber polystyrene vessel tissue culture treated glass slide	BD Falcon	354108
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707