Identificação de novos genes associados com alginato de Produção em<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Usando Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagênese Mariner Transposon mediada

Resumo

Aqui nós descrevemos um protocolo com o marinheiro mutagênese mini-himar1 mediada por transposon para gerar uma biblioteca de mutantes de inserção de alta densidade para a tela, isolar e identificar novos reguladores de alginato no protótipo PAO1 cepa Pseudomonas aeruginosa.

Resumo

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa, do meio ambiente com as capacidades metabólicas versáteis. P aeruginosa é uma bactéria patogênica oportunista que estabelece infecções pulmonares crônicas em pacientes com fibrose cística (FC). O excesso de produção de um polissacarídeo capsular chamado alginato, também conhecido como mucoidy, promove a formação de biofilmes mucóides que são mais resistentes que as células planctônicas a quimioterapia antibiótico e as defesas do hospedeiro. Além disso, a conversão do nonmucoid para fenótipo mucóide é um marcador clínico para o início da infecção crónica em CF. Superprodução alginato por P. aeruginosa é um processo endergonic que tributa pesadamente energia celular. Portanto, a produção de alginato é altamente regulado em P. aeruginosa. Para compreender melhor regulação alginato, nós descrevemos um protocolo utilizando a mutagénese de transposões mini-himar1 para a identificação de novos regulador alginatos em um PAO1 cepa protótipo. O processo consiste em duas etapas principais. Em primeiro lugar, nós transferimos o transposon mini-himar1 (PFAC) do host E. coli SM10/λpir em destinatário P. aeruginosa PAO1 por conjugação entre parentes para criar uma biblioteca de mutantes de inserção de alta densidade, que foram seleccionados em placas de agar de isolamento Pseudomonas suplementado com gentamicina. Em segundo lugar, nós analisamos e isoladas as colónias mucóides para mapear o local de inserção por meio de PCR inversa utilizando iniciadores de ADN que apontam para fora a partir da cassete de gentamicina e sequenciação de ADN. Usando este protocolo, foram identificados dois reguladores novas alginato, Muce (PA4033) e kinB (PA5484), em PAO1 tensão com um tipo selvagem Muca que codifica o fator anti-sigma MUCA para o alginato regulador mestre Algu (ALGT, σ ²²⁾ . Este protocolo de mutagénese de alto rendimento podem ser modificados para a identificação de outros genes de virulência causando alterações no colomorfologia ny.

Introdução

A capacidade do oportunista, patógeno Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa a produzir alginato é um fator importante na sua capacidade de estabelecer um biofilme. A superprodução de alginato é um fenótipo muitas vezes referida como mucoidy. O isolamento das colônias mucóides de amostras de escarro de indivíduos que sofrem de fibrose cística (FC) é indicativo de uma infecção crônica, e está diretamente associado a um declínio geral na saúde do paciente ^1. Atualmente, entende-se que a regulamentação e produção de alginato em P. aeruginosa ocorre principalmente em dois operões. O primeiro é o operon biossintética alginato, que contém 12 genes (algD - alg8 - alg44 - algK - Alge - algG - algX - algL - ALGI - algJ - algF - alga) que são responsáveis ​​pela síntese e exportação do polímero alginato através periplasma para o Environme extracelularnt ^2-5. A segunda operon é um conjunto de genes que começa com o fator sigma alternativo Algu / T e continuando com Muca, mucB e mucD. Algu / T é um regulador positivo, enquanto mucAB-D são classificados como reguladores negativos da produção de alginato de ^6-8. Além disso, reguladores de transcrição, tais como ALGB, AlgQ, AlgR, e RPON, bem como pós-transcricional e modificação pós-tradução pela repressão catabólica de controlo, a actividade da cinase (KinB) e proteólise intramembrane, têm também sido mostrado para ser envolvido em alginato regulação ^9-14.

O vetor de transposon mini-himar1 conhecido como PFAC foi originalmente criado em laboratório Dr. Mekalanos 'na Harvard Medical School ^15. O plasmídeo PFAC consiste de um elemento transponível flanqueado por duas repetições invertidas de 27 pb e uma cassete de resistência à gentamicina no meio (aacC1: 534 pb), um gene que codifica para a hyperactive transposase marinheiro ^16, e um gene que codifica a β-lactamase (bla) (Figura 1). A informação da sequência para o elemento transponível de PFAC está disponível com o número de acesso do GenBank: DQ366300 ^13. Em PFAC, há um local de clonagem múltipla (MCS) atrás do gene aacC1 que é utilizado para a identificação do local de inserção cromossómico utilizando PCR inversa. Uma grande vantagem com o uso do transposon mini-himar1 há fatores do hospedeiro específicas são necessárias para a transposição (mutagênese). Além disso, existe uma grande abundância de sítios de inserção dinucleotidicos TA encontrados em todo o genoma de P. aeruginosa. Por exemplo, locais de inserção dinucleotide TA ocorre 94.404 e 100.229 vezes no PAO1 (6.264.404 bps, GenBank número de acesso NC_002516.2) e PA14 (6.537.648 bps; número de acesso GenBank NC_008463) genomas, respectivamente. Devido à abundância de TA dinucleotide no genoma, mini-himar1 Transposão pode causar a maior densidade e mutagénese aleatória, que é particularmente adequada para a análise de genes de virulência e os genes que são altamente regulados. Teoricamente, o transposão mini-himar1 pode inserir qualquer gene não essencial no genoma de P. aeruginosa. Isto fornece cerca de 18 locais de inserção TA por quadro de leitura aberta no genoma PAO1.

Aqui, nós descrevemos um protocolo usando a mutagênese mediada por transposon mini-himar1 para identificar novos reguladores de mucoidy em P. aeruginosa. Mais especificamente, o vector biparentally conjugado PFAC contendo um transposão mini-himar1 de E. coli SM10/λpir no PAO1 tensão prototrófico nonmucoid. Após o transposão está integrado no genoma, a estirpe receptora é cultivado em Pseudomonas isolamento de agar (AIP) contendo triclosan, que inibe o crescimento de E. coli. Assim, uma biblioteca de mutantes de P. aeruginosa podem ser seleccionados pelo crescimento na placa PIA suplementado com gentamicina e a presença do fenótipo mucóide. Note-se, um contra um mutante integração mediada por transposon verdadeiro terá um fenótipo resistente e sensível à carbenicilina gentamicina. Neste estudo, aproximadamente 80.000 mutantes de inserção de PAO1 foram isolados por meio de quatro conjugações separadas. Em seguida, rastreados para isolados mucóides, e determinado o local de inserção por digestão com enzimas de restrição, ligação e PCR inversa. Foram realizadas análises de Southern blot utilizando a cassete de resistência a gentamicina como uma sonda para ver o número de inserção por genoma. Determinou-se que mais de 90% de mutantes obtidos por conjugação utilizando este protocolo tinha uma única cópia do himar1 no genoma e exibido o fenótipo de resistência à carbenicilina e sensíveis à gentamicina. Foi identificado um total de 32 isolados mucóides, 22 deles foram mapeados para diferentes loci da P. aeruginosa PAO1cromossomo. Esta taxa de inserção fornece uma cobertura adequada para identificar vários novos reguladores de superprodução alginato.

Protocolo

1. Preparação de Estirpes Bacterianas e biparentais Conjugação

1. Inocular E. coli SM10/λpir/pFAC em 5 ml de caldo de Luria (LB) suplementado com 15 ug / ml de gentamicina e colocar num incubador com agitação durante a noite a 37 ° C.
2. Inocular P. aeruginosa PAO1 tensão em 5 ml de LB, e coloque em uma incubadora de agitação durante a noite a 42 ° C.
3. Meça OD ₆₀₀ de culturas durante a noite e misture quantidades iguais de PAO1 e E. coli PFAC de tal modo que o volume final é entre 1-1,4 ml.
4. Centrifuga-se a mistura de 6000 g durante 5 min.
5. Por outro lado, secar as placas de LB para conjugação: deixar abertas as placas na incubadora a 37 ° C durante 10-15 min.
6. Remova todos, mas 50 ul de sobrenadante de mistura de células.
7. Ressuspender o sedimento de células nos restantes 50 ul de sobrenadante e pipeta para uma placa de LB seco em uma gotícula compacto.
8. Com cuidado, coloque a placa em um exaustor para secar (IMPONota RTANT: Não deixe que as células se espalham sobre a placa, isso vai diminuir significativamente a eficiência da conjugação).
9. Uma vez que a gotícula é seco, inverter a placa LB e incubar a 37 ° C durante 4-6 horas.
10. Enquanto a mistura de células é a incubação, preparar grandes placas PIA (150 x 15 mm OD) com 300 ug / ml de gentamicina. Antes da utilização, remover a humidade residual por colocar numa incubadora a 37 ° C durante 15-20 min.
11. Após a incubação da mistura de células está concluída, a colheita das células utilizando uma ansa de inoculação estéril e de um tubo de microcentrífuga contendo 1 ml de LB e vórtice, ou pipeta, para misturar completamente.
12. Espalhe as células uniformemente sobre as grandes placas PIA contém 300 mg / ml de gentamicina. (IMPORTANTE: Para este passo, é melhor adicionar volumes crescentes de a mistura de células para separar as placas (por exemplo, placa de 1: 10 ul, Placa 2: 50 ul, Placa 3: 100 ul, Placa 4: 500 ul, etc) .
13. Incubar durante a noite a 37° C.

2. Detecção e isolamento de colónias mucóides

1. Remover placas da incubadora e examinar para colônias mucóides.
2. Isolar uma única colônia de muco e estrias para isolamento em pequenas placas (100 OD x 10 mm) com PIA e 300 mg / ml de gentamicina.
3. Incubar durante a noite a 37 ° C.
4. Repetir a etapa 2.2 em cultura durante a noite anterior.
5. Repita os passos de 2,2-2,4, mais duas vezes, para determinar a estabilidade do isolado mucóide.
6. Após o passo final de isolamento, o inocular 4,5 ml de LB com uma única colónia mucóide e incubar no agitador durante a noite a 37 ° C.
7. No dia seguinte, etiqueta 3 microtubos para cada mutante mucóide.
8. Prepare dois 1,25 ml alíquotas de cultura durante a noite em dois tubos para extração de DNA genômico e identificação do local de inserção do transposon (ver protocolo 3).
9. Adicionalmente, arquivar cada mutante mucóide pipetando 1 ml da cultura durante a noite em um DOTAÇÕEScriotubo ely-marcado contendo um volume igual de 10% de leite desnatado. Guarde-o em -86 ° C.

3. gDNA Restrição Digestão e ligadura

1. Extrair ADNg do mutante mucóide usando qualquer método preferido (fenol-clorofórmio, a coluna de centrifugação, por exemplo., Etc.)
2. Determinar a concentração do ADNg, digerir com um total de 2 mg com 1 ul da endonuclease de restrição Sall, 0,5 ul de albumina de soro de bovino, 5 uL de tampão de enzima Sall (100 mM de NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM de _MgCl2 , ditiotreitol 1 mM (DTT), pH 7,9 à temperatura ambiente), e o volume adequado de _dH2O para obter um volume total de 50 ul.
3. Digerir o ADN durante a noite a 37 ° C. (IMPORTANTE:. Dependendo da eficiência do enzima de restrição, pode ser necessário adicionar um adicional de 1 ml para a digestão durante a noite e incubar a 37 ° C durante 1-2 hr Isto é em adição à digestão durante a noite.)
4. Purifica-se o DigeADN STED usando qualquer método preferido (por exemplo, purificação em gel de agarose, coluna de spin) e elui-se com 25 mL de tampão.
5. Ligar o DNA digerido, misturando 11 ul de ADN purificado com uma concentração preferida de ~ 10-20 ng / mL, 1,5 mL de ligadura Buffer (330 mM de Tris-acetato, pH 7,5, 660 mM acetato de potássio, 100 mM de acetato de magnésio, 5 mM DTT), 1,5 ul de ATP 100 mM e 1 uL de ligase de ADN.
6. Incubar a mistura durante 15 minutos à temperatura ambiente, e, em seguida, desactivar a enzima por incubação durante 15 min a 70 ° C. (Nota: A incubação da mistura à temperatura ambiente durante mais longa pode aumentar o sucesso da ligação).

4. PCR Inverso (IPCR) e Análise de Sequência

1. Realizar IPCR no produto de ligação com a seguinte iniciadores directos e inversos e termociclagem condições:
   -Forward Primer (Gm3OUT): GGGCATACGGGAAGAAGTGA
   -Reverse Primer (Gm5OUT): GACTGCCCTGCTGCGTAACA
   Termociclador Condições:
   1. 94 ° C durante 1 min.
   2. 94 ° C durante 1 min.
   3. 58 ° C durante 2 min.
   4. 72 ° C durante 2 min.
   5. 72 ° C durante 8 min.
   6. 10 ° C preensão.
   Repita os passos 2-4 para 34 ciclos.
   (NOTA: Os produtos amplificados IPCR pode ser armazenado a 4 ° C.)
2. Realizar a electroforese em gel de agarose para confirmar a amplificação de IPCR bem sucedida.
3. Realizar a sequenciação do produto de IPCR utilizando os iniciadores Gm3OUT e Gm5OUT. O local de inserção e orientação de himar1 são mapeados.

Resultados

Tal como ilustrado na Figura 1, o vector de mariner transposão mini-himar1, PFAC, contém duas repetições invertidas com 27 pb que flanqueia os locais de inserção de TA a cassete de resistência à gentamicina aacC1, com o seu promotor σ ^{70-dependente,} e um local de clonagem múltipla (MCS). Além disso, o vector contém os genes que codificam PFAC transposase altamente activa himar1, β-lactamase (bla), e o operão transferência tra. Os loc...

Discussão

É importante notar que este método pode ser utilizado em outras espécies de Pseudomonas com essas alterações: incubar P. e P. fluorescens putida a 30 ° C, e P. stutzeri a 42 ° C; p stuzeri devem ser cultivadas em placas de LB suplementadas com 150 ug / ml de gentamicina; no passo 1.11, P. células stutzeri deve ser transferido para 500 mL de LB em vez de 1 ml. Para além disso, existem dois passos críticos para este protocolo. Em primeiro lugar, a es...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luria Broth	Difco	240230	via Fisher Scientific
Pseudomonas isolation agar	Difco	292710	via Fisher Scientific
Small Plates (100 O.D. x 10 mm)	Fisher Scientific	08-757-13
Large Plates (150 O.D. x 15 mm)	Fisher Scientific	08-757-14
Glycerol	Fisher Scientific	BP229-4
Benchtop Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	Innova 4080	shake at 200 rpm
Cabinet Incubator	VWR	1540
Benchtop Microcentrifuge	Sorvall	75-003-287	via Fisher Scientific
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525	or preferred method/vendor
Diposable Inoculation Loops	Fisher Scientific	22-363-597
1.5 ml Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific
15 ml Tubes	Fisher Scientific	05-539-12
Skim Milk	Difco	DF0032-17-3	via Fisher Scientific
DNeasy Blood and Tissue (250)	Qiagen	69506	or preferred method/vendor
QIAquick PCR Purification Kit (250)	Qiagen	28106	or preferred method/vendor
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	Qiagen	27106	or preferred method/vendor
FastLink II DNA Ligation Kit	Epicentre Technologies	LK6201H	via Fisher Scientific
Accu block Digital Dry Bath	Labnet	NC0205808	via Fisher Scientific
Sal1, restriction endonuclease	New England BioLabs	R0138L
EasyStart Micro 50	Molecular BioProducts	6020	via Fisher Scientific
Taq DNA Polymerase	New England BioLabs	M0267L
iCycler, Thermocycler	Bio-Rad	170-8740
LE agarose	Genemate	3120-500	via Fisher Scientific
Gentamycin Sulfate	Fisher Scientific	BP918-1
2.0 ml Cryogenic Vials	Corning	430659	via Fisher Scientific