A utilização de orofaringe Intratraqueal Administração PAMP e Lavagem Broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro em camundongos

Resumo

A resposta imune do hospedeiro à infecção do agente patogénico é um processo fortemente regulado. Utilizando um modelo de exposição do pulmão lipopolissacarídeo em ratos, é possível realizar avaliações de alta resolução dos complexos mecanismos associados à patogênese da doença.

Resumo

A resposta imune do hospedeiro contra patógenos é um processo biológico complexo. A maioria dos estudos in vivo classicamente utilizada para caracterizar as interações patógeno-hospedeiro tirar proveito de injeções intraperitoneais de selecionar bactérias ou padrões moleculares de patógenos associados (PAMPs) em camundongos. Embora essas técnicas têm rendido dados tremendos associados pathobiology doença infecciosa, os modelos de injeção intraperitoneal nem sempre são adequados para estudos de interação patógeno-hospedeiro no pulmão. Utilizando um modelo de inflamação pulmonar aguda em ratos, é possível realizar uma análise de alta resolução do anfitrião resposta imune inata utilizando lipopolissacarídeo (LPS). Aqui, descrevemos os métodos para administrar LPS usando administração intratraqueal orofaríngea não cirúrgico, monitorar parâmetros clínicos associados com a patogênese da doença, e utilizar lavado broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro. As técnicas que estão descritassão amplamente aplicáveis ​​para o estudo da resposta imune do hospedeiro inata de uma gama diversificada de PAMPs e patógenos. Da mesma forma, com pequenas modificações, estas técnicas também podem ser aplicados em estudos que avaliam a inflamação alérgica das vias aéreas e em aplicações farmacológicas.

Introdução

As infecções pulmonares associadas com espécies de bactérias patogênicas são uma causa comum de morbidade e mortalidade global. Determinar os mecanismos que impulsionam a resposta imune do hospedeiro para estes patógenos vai promover o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e agentes terapêuticos que atenuam o impacto destas infecções. O objetivo geral do protocolo descrito aqui é fornecer ao usuário um método flexível para avaliar o anfitrião resposta imune inata à infecção do patógeno usando um associado padrão molecular de patógenos (PAMP) como um substituto para bactérias vivas. A maioria dos estudos anteriores que avaliaram a resposta imune do hospedeiro natural para as bactérias têm-se centrado em modelos peritoneal devido à relativa facilidade de execução. Embora estes modelos são muito úteis e têm resultado em avanços significativos no campo das interações patógeno-hospedeiro e inflamação sistêmica, os dados gerados a partir desses modelos nem sempre são adequadas para estudos involving do sistema respiratório. Aqui, um modelo pulmonar de inflamação pulmonar aguda é proposto como uma expansão prático e clinicamente relevante dos intraperitoneal (ip) de injeção de modelos clássicos. A técnica proposta permite a avaliação local da resposta imune inata em um sistema modelo específico do órgão.

Os métodos descritos aqui são projetados para fornecer uma técnica simples e robusta para permitir que os usuários para avaliar a resposta imune do hospedeiro ao LPS, que é um PAMP comum. Os métodos baseiam-se na via intratraqueal (it) instilação de LPS, que induz uma resposta imune inata robusta nos pulmões dos ratos e imita muitas das características fisiopatológicas observadas em pacientes humanos que sofrem de infecções respiratórias e lesão pulmonar aguda ^1. A principal vantagem desta técnica é que ela permite ao usuário avaliar a resposta imune do hospedeiro, sem os fatores de confusão e problemas de segurança associados à realização de estudos in vivoutilizando bactérias vivas. Do mesmo modo, a via de administração que orofaríngea de exposição descrito neste processo tem vantagens significativas sobre outras técnicas geralmente utilizadas, incluindo intranasal (em) a administração e que a administração cirúrgica. Por exemplo, ele permite que a dosagem de administração orofaríngea relativamente preciso e deposição nos pulmões em comparação com a administração, que normalmente sofre de um aumento da variabilidade da deposição nos pulmões, devido à perda de agentes na cavidade nasal e os seios ^2-4. A rota que contorna administração destas cavidades e permite acesso direto à traquéia e vias aéreas. Da mesma forma, a abordagem cirúrgica que é um método de administração significativamente mais mórbida e requer extenso treinamento para dominar. Os protocolos descritos aqui também incluir uma descrição das técnicas comuns e marcadores substitutos utilizados para avaliar a progressão da inflamação e termina com um protocolo descrevendo as técnicas apropriadas para a preparação da lungs para avaliações de histopatologia. Estes protocolos são focados em minimizar o número de ratinhos necessários para cada estudo, maximizando os dados gerados a partir de cada animal.

Os protocolos descritos são altamente flexível e pode ser facilmente modificado para avaliar uma diversificada gama PAMPs e padrões moleculares danos associados (amortece). Além disso, com algumas modificações adicionais, estes protocolos podem também ser aplicadas a estudos de avaliação das vias aéreas alérgica progressão da doença ou interações patógeno-hospedeiro com bactérias vivas, vírus ou fungos ^5-10.

Protocolo

Todos os estudos foram realizados no âmbito da aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso (IACUC) para Virginia Tech e de acordo com o National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Intratraqueal (IT) A inoculação de LPS usando a administração orofaríngea

1. Certifique-se de que cada animal é identificado exclusivamente usando um soco ouvido, marca auricular, ou outro método aprovado institucionalmente.
2. Registe o peso do corpo de linha de base e da temperatura corporal de cada animal.
3. Prepare o estoque de trabalho de LPS. Cada ratinho recebe uma dose de 50 ul de 1 mg / kg de LPS em 1x tampão fosfato salino (PBS). Animais tratados Mock irá receber uma dose de 50 ul de PBS 1x.
4. Prepara-se uma câmara apropriada para a administração de isoflurano utilizando o seguinte método de gota. Diretrizes institucionais variar em relação ao uso de isoflurano e outros agentes anestésicos e antes deram inícioção a todos os estudos, as pessoas devem entrar em contato Departamento de Animal Care / Bem-estar da sua instituição para garantir as todas as diretrizes são adequadamente atendidas. Se o método queda isoflurano não é uma opção, outros agentes anestésicos são alternativas aceitáveis.
   1. Em um gabinete de segurança apropriado, aplicar cerca de 3 ml de isoflurano para uma toalha de papel absorvente dobrado e coloque no fundo de um copo de 500 ml.
   2. Coloque um pequeno pedaço de uma folha de alumínio na parte superior da toalha de papel e cobrir o recipiente com uma tampa transparente.
5. Preparar as ferramentas e os reagentes que serão utilizadas durante a ele inoculação. Coloque o elástico que irá garantir os animais cabeça no stand intubação. Este procedimento será necessário um par de fórceps em linha reta, um par de pinças angulares ou curvas, e uma pipeta p200 com dicas.
6. Carga 50 mL de LPS na ponta da pipeta e coloque em um local de fácil acesso, ao lado do stand intubação.
7. Anestesiar o mousea colocação do animal na câmara de isoflurano e cobrindo a câmara com uma tampa transparente. Observar os padrões de respiração do animal, que será rápida e superficial quando o primeiro colocado na câmara. O animal será suficientemente anestesiados quando as taxas de respiração aproximar 1 respiração / 2 seg, que normalmente é alcançado dentro de 30 segundos de colocar na câmara. O mouse deve ser anestesiado como indicado no protocolo aprovado animais utilizando o método de queda de isoflurano.
8. Retire o rato anestesiado da câmara e suspender o animal na intubação ficar por seus incisivos. Garantir que o animal está bem contido e da boca e língua são acessíveis.
9. Gentilmente garantir a língua com a pinça retas. Segure a língua com a pinça em ângulo e puxe-o para fora da boca até ligeira resistência é sentida. Esta ação é suficiente para bloquear a epiglote e ter acesso a traquéia.
10. Embora continuando a segurar a língua naposição prolongada, administrar a dose de 50 ul de LPS na parte de trás da garganta e cobrir imediatamente narinas do animal com um dedo de luva. O LPS será visível na parte de trás da garganta até que o mouse inala.
11. Continue a cobrir as narinas e segure a língua estendida para 5-10 respirações adicionais.
12. Retire o mouse do suporte intubação e coloque o animal de volta para uma nova gaiola até que ele se recupera da anestesia.
13. Monitorar marcadores substitutos associados à progressão da doença. O peso corporal ea temperatura do corpo devem ser monitorados a cada 4-8 horas para a duração do estudo. Da mesma forma, avaliar as características comportamentais e sintomas clínicos associados com o aumento da morbidade.
14. Para avaliar progressão da doença, os ratos de colheita no tempo pontos-específicos após a exposição LPS. Pontos de tempo típicos para a colheita, após exposição ao LPS incluem 0, 6, 12, 18, 24, e 48 horas. Para avaliar a recuperação e sobrevivência, avaliar os ratos para 7 days pós-inoculação.

2. Soro e Líquido da Lavagem Broncoalveolar (LBA) Coleção

1. Sacrifique o mouse usando um método aprovado institucionalmente.
2. Colocar o animal em suas costas e prenda-o a uma placa de necropsia, idealmente 0,5 em (1,27 cm) de altura.
3. Molhe todo o rato com etanol 70%.
4. Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 27 G, realizar uma punção cardíaca antes de fazer qualquer incisões. Deve ser possível retirar 500-800 mL de sangue total a partir de um único rato.
5. Retirar a agulha da seringa e transferir todo o sangue para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml prelabeled. Para a recolha de soro, permitindo que todo o sangue de coagular durante, pelo menos, 30 minutos à temperatura ambiente. Em adição à recolha de soro, este procedimento também pode ser modificado por incorporação de um anti-coagulante, no tubo e na seringa, antes da recolha do sangue total, para o estudo de células imunitárias em circulação.
6. Faça uma incisão horizontalatravessar o comprimento da cavidade peritoneal e feita uma incisão vertical a partir da cavidade peritoneal, para o maxilar inferior do rato.
7. Utilizando uma pinça, segure ambos os lados da incisão e puxe a pele longe das cavidades peritoneais e torácicos subjacentes.
8. Fazer uma grande incisão ao longo do comprimento da cavidade peritoneal dos genitais para o esterno, tendo o cuidado de evitar o corte do diafragma. Suavemente deslocar os intestinos na cavidade peritoneal, para permitir o acesso a um dos rins.
9. Cortar a veia renal que conduz ao rim para servir como um ponto de drenagem para perfusão.
10. Nick o diafragma com uma tesoura, tendo o cuidado de evitar os pulmões e coração, para expor o lado esquerdo do coração.
11. Perfuse manualmente o coração usando uma seringa de 10 ml com uma agulha de 27 G e solução 1x PBS. Evitar a aplicação de força excessiva durante a perfusão para assegurar que a solução salina não é forçado para dentro dos pulmões. O restante sangue é drenada a partir da incisão da veia porta.
12. Corte cuidadosamente a caixa torácica ao longo do esterno com uma tesoura sem corte / sem corte, tendo o cuidado de evitar o corte do coração e pulmões. Acidentalmente cortar os pulmões durante este processo irá reduzir de forma significativa a quantidade de LBA recolhido e irá resultar numa incapacidade para inflar os pulmões adequadamente com fixador.
13. Gentilmente isolar o coração e os pulmões de distância da caixa torácica com fórceps. Corte cuidadosamente cada seção da caixa torácica com uma tesoura sem corte / sem corte o mais próximo à coluna vertebral quanto possível e totalmente remover ambas as seções.
14. Separe as glândulas salivares, usando uma pinça ou removê-los com uma tesoura, para expor a traquéia.
15. Retirar cuidadosamente os músculos que revestem a traquéia com uma tesoura. É essencial que a traqueia não ser cortado durante este processo.
16. Com uma tesoura, separe a clavícula que recobre a traquéia.
17. Gentilmente segure o timo com a pinça e retire o tecido para fora do coração. Retire o timo com uma tesoura, tendo o cuidado deevitar o corte do coração ou os pulmões.
18. Faça uma pequena incisão horizontal na traquéia 1-2 anéis abaixo da laringe com uma tesoura em ângulo (45-90 º ângulo, afiada / afiada). A incisão deve ser grande o suficiente para prender firmemente a cânula.
19. Inserir a cânula de modo a que a extremidade afunilada prolonga-se 2-3 anéis de traqueia abaixo da incisão, e fixar a cânula no lugar utilizando uma sutura de seda. Certifique-se que a sutura passa entre a traquéia eo esôfago e está bem apertada na cânula.
20. Encher uma seringa de 1 ml com 1 ml de solução salina tamponada de Hanks (HBSS) e inserir o luer suavemente para dentro da cânula.
21. Com um movimento lento, mas constante, injetar ~ 900 mL na traquéia, inflando os pulmões, e retirar imediatamente o HBSS. Coloque o LBA recuperado num tubo cónico de 15 ml.
22. Repita esta lavagem duas vezes adicionais para coletar cerca de 3 ml de LBA para análise futura. Armazenar o LBA em gelo ou a 4 º C até que esteja pronto para uso.

3. Histopatologia Preparação

1. Insira uma seringa de 10 ml no suporte inflação de pulmão. Montar o tubo para o luer, o luer da torneira, e a torneira de passagem para a seringa. Assegurar a torneira estiver na posição fechada. A seringa de 10 ml irá servir como um reservatório de escoamento por gravidade. O reservatório deve ser ligada ao suporte de inflação 4,75 em cima do animal e da parte superior do reservatório deve estender em 10,5 acima do animal.
2. Encha a seringa com solução neutra de formalina tamponada. Certifique-se de que a seringa está completamente cheio com o fixador.
3. Coloque uma toalha absorvente sob a extremidade aberta do tubo e abrir a torneira para permitir que o fixador para encher o tubo. Uma vez que o fixador começa a fluir a partir da tubulação, imediatamente fechar a torneira e encher a seringa até o topo com fixador. É importante que a seringa estar completamente cheio de fornecer a quantidade apropriada da pressão da inflação do pulmão.
4. Passar suavemente um segundo pedaço de fio de sutura sob a traqueia, aproximadamente 1-2 anéis de traqueia abaixo da extremidade da cânula.
5. Amarre um único nó frouxo na sutura; no entanto, não puxe o apertado nó.
6. Insira o tubo da inflação do mouse ficar na cânula.
7. Abra a torneira e permitir que os pulmões para encher pela inflação gravidade.
8. Uma vez que os pulmões atingem o seu nível máximo inflação, puxe a sutura apertado e dê um segundo nó.
9. Fechar a torneira e remover o tubo a partir da cânula.
10. Remova cuidadosamente a cânula da traqueia, segurando a sutura com um par de fórceps e segurando a cânula com os dedos. Puxe firmemente a sutura para baixo em direção a cavidade torácica ea cânula de volta para o nariz do mouse.
11. Suavemente compreender a traqueia ou as suturas com uma pinça e levantar a traqueia de distância da cavidade do gargalo.
12. Sever do caudal traquéia para a sutura amarrado com uma tesoura sem corte.
13. Uma vez que o tracheum está livre dos tecidos subjacentes, começam a puxar a traqueia longe do rato. Levante cuidadosamente os pulmões para fora da cavidade torácica.
14. Corte cuidadosamente o tecido conjuntivo que prende os pulmões na cavidade torácica. Continue puxando a traquéia longe do corpo do mouse e aplicar a força ascendente constante ao cortar as conexões subjacentes. Tome cuidado para evitar o corte dos pulmões. Note-se que o coração deve ser deixado ligado para os pulmões usando esse método.
15. Uma vez que os pulmões foram retirados, colocá-los em 10 ml de formalina tamponada.
16. Remover uma seção da cauda do rato para genotipagem.
17. Descarte a carcaça do mouse seguindo as diretrizes institucionais adequados.

4. Avaliação de citocinas

1. Centrifugar o sangue total, coletados na etapa 2.5, a 12.000 xg por 5 min para isolar o soro. Transferir o soro para um tubo de 1,5 ml prelabeled microcentrífuga e armazenar a -80 ° C.
2. Avaliar o seruníveis de citocinas por ELISA m ou outro ensaio semelhante. Diluir o soro de 1:05 - 1:20 em tampão de diluição adequado, dependendo do ensaio, seguindo as instruções do fabricante. Estas diluições devem ser determinados empiricamente antes de executar a maior parte das amostras.
3. Devido ao baixo volume de soro recolhido, reduzir o volume da amostra carregada na placa de ELISA para metade. Por exemplo, a maioria dos testes ELISA comerciais utilizam volumes de 100 ul dos padrões e amostras. Para conservar as amostras, carga 50 ul de normas e soro diluído por poço.
4. Centrifugar o LBA numa centrífuga de mesa refrigerada a 200 xg durante 5 min. Transferir o sobrenadante isento de células para dois tubos de 1,5 ml prelabeled e armazenamento de microcentrífuga a -80 ° C.
5. Avaliar citocinas LBA por ELISA ou outro ensaio semelhante, sem diluir.
6. Loja soro não utilizada e LBA a -80 ° C.

5. Coloração Diferencial e celularidade do LBA Avaliação

1. Após centrifugação e remoção do LBA HBSS completa, a lise das células vermelhas do sangue peletizadas usando solução salina hipotónica. Ressuspender as células em 900 ul de água destilada. Imediatamente adicionar 100 ul de PBS 10x.
2. Individualmente lisar cada amostra. Se as amostras contêm uma quantidade excessiva de células vermelhas do sangue, as células podem ser sedimentadas no topo da mesa de centrifugação a 400 xg durante 5 minutos e o sangue protocolo de lise dos glóbulos vermelhos pode ser repetido.
3. Determinar a celularidade total de LBA na suspensão de 1 ml utilizando um hemacitómetro sob 10X ou ampliação de 20 X com coloração de Azul de Tripano. Avaliar e apresentar esses dados como células / ml.
4. Preparar materiais para a cytospin e coloração diferencial. Rotular lâminas de microscópio padrão usando um lápis ou uma caneta resistente a solventes. Fixe os slides em um suporte cytospin e funil. Fixe o conjunto de slides no rotor cytospin.
5. Cytospin 150 uL de BALF a 100 xg durante 5 min. Se a densidade de células é demasiado grande para efectivamenteavaliar a morfologia celular, reduzir o volume centrifugadas nas lâminas. Permitir que as lâminas para o ar durante a noite seca.
6. Diferencial manchar os slides seguindo os protocolos fabrica. Permitir que as lâminas para o ar durante a noite seca. Lamela os slides usando Permount e avaliar os slides usando um microscópio equipado com um objetivo 20X e 40X.
7. Colher as células restantes para análise posterior, como FACS, microscopia eletrônica, microscopia confocal, extração de RNA para avaliação da expressão gênica e / ou extração de proteínas por western blot.

6. Avaliação Histopatologia

1. Prepare os pulmões para avaliação histopatológica. Após 24-48 horas de fixação em formalina, ventrally orientar todo os pulmões inflados e embebidos em parafina. Cortar os blocos resultantes para expor o condutor principal da via aérea.
2. Para melhorar a precisão de pontuação, posicione os pulmões na mesma posição e aparar cada bloco para produzir a visualização máxima longitudinal de tele intrapulmonar principal via aérea axial. A partir deste ponto, corte de 5 mícrons cortes seriados e mancha com hematoxilina e eosina (H & E). Secções adicionais podem ser cortadas e preparadas para hibridação in situ, utilizando protocolos padrão.
3. Avaliar histopatologia usando um sistema de pontuação semi-quantitativo com base nos seguintes parâmetros inflamatórios, que são marcados entre 0 (ausente) e 3 (grave): mononucleares e polimorfonucleares infiltração de células; vias aéreas hiperplasia das células epiteliais e lesões; extravasamento; perivascular e cuffing peribroncheolar; e a percentagem do pulmão envolvido com a inflamação. Histopatologia do pulmão devem ser avaliadas por um patologista experiente.
4. Média de todas as notas de parâmetros para gerar uma pontuação total histopatologia ou utilizar os resultados individuais de quantificar aspectos específicos da progressão da doença. Exercer as pontuação de forma duplo-cego, com revisores cegos para ambos genótipo e tratamento. Este sistema de pontuação foi previously descrito ^6,7,10.

Resultados

As paredes celulares de bactérias gram-negativas são compostos de LPS, o que é muito abundante no ambiente. A inalação de LPS em populações humanas sensíveis exacerba a reactividade das vias aéreas e que é capaz de desencadear uma response11 imune robusta. LPS é também um PAMP comum utilizado em modelos de ratinho para induzir uma resposta imune inata robusta. No protocolo aqui descrito, os ratos receberam uma dose que de LPS isolado a partir de E. coli (sorotipo 0111: B4) usando-administração oro...

Discussão

Os passos mais críticos para avaliar com sucesso a resposta imune do hospedeiro no pulmão do rato é a seguinte: 1) escolher a tensão do mouse apropriado e sexo para o modelo que está sendo avaliado; 2) otimizar a entrega PAMP para os pulmões; 3) coletar e processar corretamente o LBA; e 4) devidamente corrigir e preparar os pulmões para avaliações histopatológicas.

A escolha do rato tensão é um fator importante na avaliação da resposta imune do hospedeiro. C57BL / 6 são tipica...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J	The Jackson Laboratory	Stock 000664
Compact Scale	Ohaus Scale Corporation	71142845
Small Animal Rectal Thermometer	Braintree Scientific	TH 5
Rectal Probe for Rodents	Braintree Scientific	RET 3
Ear Punch	Braintree Scientific	EP-S 901
Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4	InvivoGen	LPS-EB
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023
Isoflurane	Baxter	40032609
Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand	ICAP Manufacturing	n/a
Rodent Intubation Stand	Braintree Scientific	RIS 100
Scissors (blunt/sharp)	Fisher Scientific	13-806-2
forceps (straight)	Fisher Scientific	22-327-379
forceps (45º, curved)	Fisher Scientific	10-275
Scissors (blunt/blunt)	Fisher Scientific	08-940
Pipette (200 µl Capacity)	Gilson	F123601
Ethanol	Sigma	459844
1 ml Syringe	BD Medical	301025
10 ml Syringe	BD Medical	301604
27 G x 0.5 in Needle	BD Medical	305109
Refrigerated Microcentrifuge	Fisher Scientific	13-100-676
1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter	Harvard Apparatus	732836
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-076
4-0 Silk Braided Surgical Suture	Ethicon	A183
Luer to Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	721406
Luer Stopcock Kit	Harvard Apparatus	721664
Tygon formula E-3603 Laboratory Tubing	Sigma	R-3603
Formalin Solution, neutral buffered, 10%	Sigma	HT501128-4L
Mouse IL-1β OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	559603
Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	550950
Mouse TNF-α OptEIA ELISA Kit	BD Biosciences	560478
Hemocytometer	Hausser Scientific	3520
Hemocytometer Cover Glasses	Thermo Scientific	22-021-801
Trypan Blue	Thermo Scientific	SV3008401
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357
Cytology Funnels	Fisher Scientific	10-354
Filter Cards	Fisher Scientific	22-030-410
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-1
Cover Glasses	Fisher Scientific	12-540A
Cytospin Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003
Diff Quick Staining Kit	Fisher Scientific	47733150
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific	SP15-500