Ensaios olfativas para o Rato modelos de doenças neurodegenerativas

Resumo

Impairment in olfactory function is a common feature in many neurodegenerative disorders including Parkinson, Alzheimer, and Huntington diseases. In the present article, we describe a set of tests for assessing olfaction discrimination and detection in mice that can be used to measure olfactory abilities in mouse models of neurodegenerative diseases.

Resumo

In many neurodegenerative diseases and particularly in Parkinson’s disease, deficits in olfaction are reported to occur early in the disease process and may be a useful behavioral marker for early detection. Earlier detection in neurodegenerative disease is a major goal in the field because this is when neuroprotective therapies have the best potential to be effective. Therefore, in preclinical studies testing novel neuroprotective strategies in rodent models of neurodegenerative disease, olfactory assessment could be highly useful in determining therapeutic potential of compounds and translation to the clinic. In the present study we describe a battery of olfactory assays that are useful in measuring olfactory function in mice. The tests presented in this study were chosen because they measure olfaction abilities in mice related to food odors, social odors, and non-social odors. These tests have proven useful in characterizing novel genetic mouse models of Parkinson’s disease as well as in testing potential disease-modifying therapies.

Introdução

Disfunção olfativa é ligado a um número de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), doença de Alzheimer, e doença de Huntington ^1. Na DP, deficiências olfativas incluem déficits na identificação odor, detecção e discriminação e são encontrados em até 70-95% dos pacientes ^2-5. Estes déficits podem preceder os sintomas motores da DP cardeal por até 4 anos, indicando que a disfunção olfativa pode sinalizar os primeiros estágios de PD ^6-10. A ocorrência precoce de déficits olfativos na DP levou a um grande interesse em disfunção olfativa e os mecanismos subjacentes envolvidos. Em estudos pré-clínicos em roedores, disfunção olfactiva pode ser uma medida do resultado sensível para prever o potencial terapêutico de novas estratégias terapêuticas.

Muitos testes foram concebidos e amplamente utilizado para caracterizar deficiências sensório-motoras em modelos de roedores de PD e test o potencial terapêutico de novos tratamentos ^11-15. Embora déficits olfativos estão bem documentados na DP, a função olfativa não tem sido realizada rotineiramente em muitos modelos. Essa visão está mudando, embora com a descoberta de formas genéticas de PD ea noção mais aceita que a DP é uma doença sistêmica que afeta mais do que apenas a função sensório-motor. Atualmente, existem vários estudos em modelos genéticos do rato do PD e outras doenças neurodegenerativas, que agora incluem a análise do olfato na caracterização ^16-24. Dado o crescente interesse dos disfunção olfactiva em desordens neurodegenerativas, procurou-se montar uma bateria de testes olfactivos que podem ser utilizados para caracterizar novos modelos de neurodegeneração, assim como potenciais terapias modificadoras da doença de teste em estudos pré-clínicos. Os ensaios descritos no presente estudo tenham sido utilizados em ambas caracterização e os estudos pré-clínicos ^18,25.

Os testes highlighted neste estudo tenha sido mostrado para ser sensível para detectar disfunção olfactiva em um modelo de ratinho que sobre-expressam frequentemente utilizadas alfa-sinucleína de doença de Parkinson ^18. Eles incluem o teste de sedimento enterrado ^26,27, uma versão modificada do teste de bloco ^23,24,28,29, e o teste de habituação / dishabituation ^30. É importante notar que existem várias adaptações dos testes descritos neste estudo que são medidas sensíveis da função olfativa em camundongos, os destacados neste estudo são os testes de nosso laboratório tem mais experiência e utilizar rotineiramente.

Protocolo

Todos os passos do protocolo de seguir a cuidados com os animais e usar directrizes e regulamentos estabelecidos pelo IACUC da Universidade de Cincinnati.

1. Considerações Gerais

1. Se possível, testar os ratos em sua fase ativa do ciclo escuro. Normalmente, realizar testes em condições de pouca luz e pelo menos 1 hora no ciclo escuro. No entanto, se os testes no ciclo escuro não é viável, executar todos os três testes durante o ciclo de luz. Tenha em mente que os tempos de sniffing pode diminuir quando os ratos são testados durante o seu ciclo de sono. Nota: Embora os testes podem ser realizados durante o ciclo de sono os ratinhos podem mostrar menos interesse no sedimento enterrado, blocos, ou cartucho perfumado.
2. A fim de reduzir o efeito de qualquer pistas olfactivas fora, usar um par de luvas de base em todos os tempos ao longo de cada teste e, em seguida, colocar um par de luvas limpa sobre o par de base para cada rato e em cada ensaio. Como regra geral, em caso de dúvida, colocar em um jogo limpo de luvas. Ter uma caixa de luvas de lerily disponível, uma vez que vai ser alterado com freqüência. NOTA: Nós usamos luvas de borracha nitrílica para toda a manipulação animal.
3. Limpeza materiais de teste e de gaiolas entre indivíduos com um desinfectante / agente de esterilização é também um passo importante nesta série de testes a fim de reduzir o potencial para a propagação da doença bem como remover pistas olfactivas indesejados.

2. Enterrado Teste Pellet

1. Pelo menos, dois dias antes do ensaio, registar o peso de cada rato e em seguida alimentar restringir a 90% do peso corporal. Antes do ensaio e durante a restrição alimentar, dão cada rato 1-2 pedaços dos peletes a ser utilizados durante o ensaio (por exemplo, um pedaço de cereal edulcorado). Não pule esta etapa porque os ratos são neofóbicas com alimentos e não podem procurar o sedimento durante o teste, caso não tenham comido as pelotas anteriormente.
2. Em todos os dias do teste, os ratos habituam durante 1 hora antes do teste, colocando a sua gaiola na sala de ensaio, sem a garrafa de água ou b alimentadorem. abrigá-los em sua gaiola com apenas uma tampa superior do filtro.
3. Durante habituação, preencher uma gaiola limpa rato ~ 3 centímetros de altura, com roupa de cama limpa assegurando a roupa de cama é distribuído uniformemente por toda a gaiola. Defina um temporizador para 5 min.
4. Após 1 hora de habituação, enterrar um adoçados pellet cereal 0,5 centímetros abaixo da cama de modo que não é visível.
5. Remover o rato de ensaio a partir da sua gaiola, colocá-lo no centro da gaiola de ensaio, colocar a tampa de topo do filtro sobre a gaiola e iniciar o temporizador.
6. Pare o cronômetro quando o mouse descobre a pelota e começa a comê-lo. Observe o tempo para descobrir o sedimento enterrado.
7. Se o mouse não encontrar a pelota dentro de 5 min, terminar o julgamento e observe uma pontuação de 300 segundos para que mouse. Mover o sedimento para o topo do leito de modo que o rato tem acesso a ele, e permitir que o rato para comer o sedimento.
8. Após o julgamento, o retorno do mouse para sua gaiola.
9. Esvazie a cama da gaiola de teste e limpar o cidade com uma solução de limpeza do quarto animal.
10. Repita os passos de 2,4-2,9 para cada rato, e trocar as luvas antes e depois de cada rato.
11. Depois de todos os ratos são testados, dar-lhes comida apenas o suficiente para mantê-los em 90% do peso corporal.
12. Realizar testes nos dias 2-5 da mesma forma que um dia de teste com uma exceção; enterrar o sedimento em um ponto diferente na gaiola para cada ensaio.
13. No teste de dia 6, realizar o julgamento de pellet superfície.
14. Para o ensaio da pelota da superfície, siga o mesmo procedimento para o dia do teste 1, mas em vez de enterrar a pelota sob o lugar da cama-lo em cima da cama. Anotar o tempo que o mouse para encontrar e começar a comer o sedimento.

3 Bloco de Teste

1. Individualmente abrigar ratos em gaiolas limpas e colocar 5 blocos na gaiola (rotulado AE), mudando as luvas antes de configurar cada gaiola.
2. Realizar o teste 24 horas mais tarde. Mover ratinhos de teste para a área de teste, retirar a garrafa de água e alimentador de compartimento, e colocar ail 5 quadras da gaiola, juntamente com um punhado de roupas de cama em um saco plástico etiquetados com a identificação do animal. Coloque o saco plástico selado no topo da gaiola do mouse.
3. Habituar os animais nas suas gaiolas de origem sem a garrafa de água, alimentador de compartimento, e blocos de 1 h antes do teste.
4. Mudar de luvas entre cada gaiola para que os aromas não são trocados entre animais / blocos.
5. Alinhe as gaiolas de rato ao lado do outro em uma tabela com pelo menos 10 cm entre cada gaiola. A posição de uma câmara de vídeo de modo que a parte da frente da gaiola (não do lado longo da gaiola) é claramente à vista.
6. Ajustar o cronômetro para 30 seg e rotular um cartão com os detalhes importantes da experiência (data, identificação do mouse, experimentação, etc). Videotape o rótulo de 2-3 segundos.
7. Remova os blocos AD do saco de plástico com a identificação desse rato e colocá-los no meio da gaiola de modo que eles são claramente visíveis na câmera de vídeo. Verifique se há ~ 1 centímetro of espaço entre cada um dos blocos. Coloque a parte superior do filtro de volta na gaiola. Inicie o cronômetro e fita de vídeo durante 30 segundos.
8. Depois de 30 segundos, parar a gravação e remover os blocos da gaiola e colocá-los de volta para o saco plástico.
9. Mudar de luvas e depois passar para o próximo rato, repetindo o mesmo procedimento utilizado para o primeiro ensaio. Faça isso por um total de 6 ensaios para cada rato certificando-se de que há um intervalo inter-julgamento de ~ 5 min.
10. ^No dia 7 de julgamento, siga o mesmo procedimento para os ensaios 1-6, exceto em vez de colocar bloco D da própria gaiola do rato adicionar bloco E da jaula de um outro rato para que o mouse é exposto aos blocos A, B, e C a partir de sua gaiola própria e bloco de E a partir de uma outra gaiola do rato. Observe no livro de laboratório cujo bloco E cada rato é exposto e alternativo onde bloco E é colocado na gaiola de cada mouse (por exemplo, ABCE ou AEBC). Tome bloco de E a partir de um rato do mesmo sexo, mas não a partir de um cagemate original. Videotape durante 30 seg.
11. Após as sete ensaios, os animais retornam para uma nova gaiola limpa com seus cagemates originais. Limpo blocos utilizados no ensaio com água e detergente neutro e deixar secar ao ar para uso em testes posteriores.

4. Habituação / Dishabituation

1. Realizar o teste de habituação / dishabituation de um modo semelhante ao teste de bloco, mas em vez de utilizar blocos que têm o odor de um rato, utilizar cartuchos de tecidos de algodão que prendem perfumado com diferentes pares de extractos.
2. Siga passos 3,1-3,4 usando um cartucho de tecido único, sem cheiro, em vez de blocos.
3. Habituar os ratos na sala de prova.
4. Prepare os cartuchos de tecido perfumado em uma sala separada. Coloque uma bola de algodão pequena em um cartucho limpo e, em seguida, adicionar 5 mL de extrato (por exemplo, extrato de amêndoa) no algodão. Encaixe a parte superior do cartucho sobre o algodão e coloque em uma caixa específica ou saco rotulado com aquele cheiro.
5. Faça o mesmo procedimento fou um segundo perfume (por exemplo, extracto de anis). Mudar de luvas entre a manipulação de diferentes aromas. Certifique-se que a bola de algodão é completamente envolto no cartucho de tecido. NOTA: Exposed fibras do algodão pode causar o animal ter interesse na bola de algodão para fins de assentamento, em vez de o próprio cheiro.
6. Em seguida, siga os passos 3,6-3,10 usando um cartucho de tecido perfumado para os primeiros seis ensaios, eo segundo cartucho tecido perfumado para o sétimo julgamento.

5 Análise de vídeos

1. Para o bloco e os testes de habituação / dishabituation, tem um cego avaliador a condição experimental medir o tempo gasto farejando cada bloco, com sniffing definida como contato nasal com esse bloco. Se desejado, medir a outros comportamentos, tais como o tempo para se aproximar do novo bloco (P) durante o Ensaio 7 e a actividade total (o número de movimentos realizados ao longo do comprimento e largura da gaiola) durante cada ensaio. Marque o tempo gasto farejando umatempo d se aproximar do vídeo usando um cronômetro.
2. Do mesmo modo, para o teste de habituação / dishabituation, tem um avaliador cego para a condição experimental medir o tempo gasto cheirar o cartucho, o tempo para se aproximar do cartucho, e a actividade locomotora.

6. Estatísticas

1. Analisar o teste de pellet enterrado usando estatísticas não paramétricas, porque a latência para encontrar a pelota pontuações tendem a mostrar a heterogeneidade de variância. Média, a latência para localizar o pellet através 3-5 dias e, em seguida, comparar entre os grupos de ratos usando um U-Mann-Whitney. Do mesmo modo, para a parte da superfície do sedimento o teste, analisar a latência para encontrar a pastilha utilizando um teste-U de Mann-Whitney para comparar os genótipos.
2. Para o teste bloco, analisar os dados do estudo 7 (introdução do bloco cheiro de romance). Normalmente, empregam análises não paramétricas para explicar a heterogeneidade de variância. Para analisar as diferenças de tempo gasto farejando ªe novo bloco, assim como o tempo para se aproximar dos blocos para diferentes grupos experimentais, utilizar o teste-U de Mann-Whitney. Use o teste dos postos sinalizados de Wilcoxon para comparar o tempo gasto farejando o romance bloco de tempo gasto farejando os blocos familiares.
3. Para o teste de habituação / dishabituation, analisa conduta paramétrico em Trials 1, 6 e 7, semelhante a estudos anteriores ^20. Se os ratos apresentam pouca ou nenhuma sniffing, use análises não paramétricas.

Resultados

A pelota, bloco, e testes de habituação / dishabituation enterrados são todas as avaliações altamente vantajosas de olfato em camundongos. Usando estes testes, encontramos alterações significativas no olfato em vários modelos de mouse genética da doença de Parkinson, incluindo a superexpressão de alfa-sinucleína (Thy1-ASYN) ¹⁸ e camundongos knockout Atp13a2. Ambos Thy1-ASYN e Atp13a2 camundongos knockout levar mais tempo para encontrar o pellet enterrado do que os controles ^18. Figuras 1-3 mostram os dados coletados a partir de tipo selvagem e Atp13a2 camundongos knockout. No teste de sedimento enterrado, ratinhos knockout Atp13a2 mostram um aumento de latência para encontrar a pastilha enterrado em comparação com ratinhos de controlo do tipo selvagem (Figura 1). No teste bloco, tanto do tipo selvagem e camundongos knockout Atp13a2 farejar o romance quadra da gaiola de um outro rato em comparação com os blocos de sua própria gaiola (Figura 2). Nos camundongos teste de habituação / dishabituation tipo selvagem mostrar habituação a um odor e em seguida, aumentou quando cheirar um romance odor é introduzida (figura 3).

Figura 1 enterrada sedimento teste. Latência para encontrar o sedimento em tipo selvagem (n = 10) e Atp13a2 KO (n = 14) a 20-27 m de idade. * P <0,05, Mann-Whitney U.

Figura 2 teste Bloco Tempo farejando o novo bloco (E) no teste de bloco em wildtype (n = 10) e Atp13a2 KO (n = 12) ratos do sexo feminino em 20 -. 27m de idade. ΔΔ representa p <0,01 em comparação com os blocos A, B, e C do mesmo genótipo. Mann-Whitney U.

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Figura 3 teste de habituação / dishabituation. Tempo farejando um cartucho perfumado em camundongos de tipo selvagem média (9 m idade, n = 7) por 6 ensaios e da introdução de um cartucho com um novo perfume em julgamento 7.

Discussão

Cada um dos ensaios descritos no presente estudo medir diferentes aspectos da função olfactiva em ratinhos. O teste de pellet enterrado mede o aspecto do olfato motivação comida, testando a capacidade de fome (restrição alimentar, não alimentar privado) ratos para detectar um pedaço saboroso de cereal adoçado enterrado sob cama. O teste bloco mede mais do aspecto social da função olfativa, testando a capacidade dos ratos de discriminar entre o seu próprio perfume e que de uma mesma espécie. O teste de habituação / dishabituation avalia a capacidade do rato de discriminar entre cheiros inofensivos familiares e novos,. O uso de vários testes é importante na caracterização de um novo modelo porque anomalias na motivação comida ou medo podem contribuir para diferenças observadas nos ratos mutantes em comparação aos controles. Por exemplo, se apenas o bloco de teste é realizado, e diminuiu a cheirar do bloco que se observa o odor de outro rato, não é claro se existe uma olfactdéficit ory ou uma resposta de medo aprimorado para a mesma espécie que pode levar a evitar esse bloco. Quando vários testes são realizados e os déficits são observados em todos os testes, é fortemente favorável a uma interpretação de deficiência olfativa. No entanto, se as diferenças são observadas em apenas um teste, mas não os outros, então pode haver uma deficiência olfativa mais sutil, mas será essencial para descartar outras explicações (ou seja, maior o medo ou a redução da motivação dos alimentos). Outros fatores importantes para manter em mente ao testar camundongos função olfativa incluem a tensão de fundo e sexo dos camundongos. Diferentes estirpes de fundo genético (isto é, C57BL / 6, DBA, etc) podem ter efeitos profundos sobre o comportamento do rato, por conseguinte, recomenda-se a adaptar-se a cada protocolo em ratinhos de tipo selvagem com o mesmo plano antes de executar todo o experimento. Recomenda-se também que homens e camundongos fêmeas ser testados separadamente um do outro porque o sistema olfativo masculino é altaly sensível às fêmeas na detecção de estro e olfativa de uma fêmea em estro poderia interferir no desempenho de todos os três testes.

Alguns passos são absolutamente críticos para seguir ao testar o olfato em camundongos. É importante estar ciente dos odores o experimentador está introduzindo aos animais. O uso de luvas para os procedimentos de mudança é essencial e freqüente de luvas entre os animais é necessária. É sempre uma boa prática para o experimentador não usar colônia ou perfume em dias de teste olfato. Enquanto algumas partes do procedimento são inflexíveis, existem outras partes que podem ser modificados e adaptados, sem reduzir a validade ou a sensibilidade do ensaio. Por exemplo, o número de tentativas de habituação pode ser aumentada ou diminuída, dependendo da estirpe de murganhos sendo testada e a rapidez com que se habituam ao estímulo. A principal limitação desses testes é que todos eles são conduzidos por alguma forma de motivação, seja comida ou social, fazendodifícil excluir completamente anomalias na motivação como uma explicação quando uma resposta alterada observado. Isto pode ser minimizado através da análise de parâmetros adicionais, tais como a actividade e o tempo durante o teste, para aproximar os estímulos.

Uma vez dominado, os testes podem ser facilmente utilizados para examinar o fenótipo de novos modelos de rato de doença neurodegenerativa. Além disso, os testes que tem a maior potência, podem ser incluídos em estudos pré-clínicos testando potenciais agentes terapêuticos (para um exemplo, ver ref. 25).

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cap'n Crunch	Quaker Oats	30000065310
Wooden Blocks	Lara's Crafts	10144
Almond Flavor Extract	Kroger	011110664716
Anise Flavor Extract	Kroger	011110615619
Banana Flavor Extract	Kroger	011110669919
Coconut Flavor Extract	Kroger	011110669889
Lemon Flavor Extract	Kroger	011110669957
Orange Flavor Extract	Kroger	0011110669964
Tissue Cartridges	Sigma-Aldrich	Z672122-500EA	Manufactured by Simport no: M490-2
Cotton Balls	Kroger	11110793119
Mouse Cages	Ancare		19 x 29 x 12.7 cm
Camcorder	Sony	HDR-HC9
MiniDV Tapes	Sony DVC premium	27242523432	60 minute long play