A atividade da telomerase nas diversas regiões de cérebro de camundongo: A telomerase não-radioativo Repetir Amplification Protocol (TRAP) Assay

Resumo

Telomerase is expressed in the neonatal brain and also in distinct regions of the adult brain. We present a non-toxic time saving TRAP assay for the analysis of telomerase activity in various regions of the mouse brain and detection of differences in telomerase activity between male and female mouse brains.

Resumo

A telomerase, uma ribonucleoprotein, é responsável por manter o comprimento dos telômeros e, portanto, promover a integridade genômica, proliferação e longevidade. Além disso, a telomerase protege a mitocôndria do estresse oxidativo e confere resistência à apoptose, sugerindo sua possível importância para a sobrevivência dos não-mitótico, células altamente ativos, tais como os neurônios. Nós já demonstraram a capacidade dos novos ativadores de telomerase para aumentar a atividade da telomerase e expressão nas diferentes regiões do cérebro do rato e para proteger as células neurônios motores do stress oxidativo. Estes resultados vêm reforçar a noção de que a telomerase está envolvida na protecção dos neurónios de várias lesões. Para sublinhar o papel da telomerase no cérebro, nós aqui comparar a atividade da telomerase em masculino e feminino cérebro do rato e sua dependência da idade. Ensaio TRAP é um método padrão para a detecção de actividade da telomerase em várias linhas celulares ou tecidos. Aqui demonstramos a Analysis da actividade da telomerase em três regiões do cérebro do rato por não-desnaturante CHAPS extracção de proteína utilizando um tampão de lise seguido por uma modificação do ensaio TRAP padrão.

Neste ensaio, em 2 passos, a telomerase endógeno alonga um substrato da telomerase específico (TS iniciador) adicionando TTAGGG 6 repetições bp (reacção da telomerase). Os produtos de reacção da telomerase são amplificados por meio de reacção de PCR a criação de uma escada de DNA de incrementos de 6 bp. A análise do segmento de ADN é feita por electroforese em gel de agarose de alta resolução de 4,5%, seguido por coloração com mancha de ácido nucleico altamente sensível.

Em comparação com o ensaio TRAP tradicionais que utilizam ³² marcado com P radioactivo de dCTP do para a detecção do ADN e de electroforese em gel de poliacrilamida para resolver a escada de DNA, este protocolo oferece um tempo de não-tóxico poupança ensaio TRAP para a avaliação da actividade de telomerase no cérebro do rato, o que demonstra a capacidade de detectar diferenças na telomerasatividade e nos diversos região do mouse cérebro feminino e masculino.

Introdução

A telomerase é uma ribonucleoproteína composto por transcriptase inversa da telomerase (TERT), a subunidade catalítica de telomerase e um componente de RNA (TERC). O papel canônica da telomerase é preservar o comprimento adequado dos telômeros pela adição de sequências repetitivas (TTAGGG) para as extremidades teloméricas, portanto, promover a integridade genômica e proliferação celular ^1. Papéis adicionais foram atribuídos a TERT em células, ou seja, que confere resistência à apoptose induzida por vários agentes prejudiciais ^2, protege as células estaminais mesenquimais humanas a partir de estresse oxidativo ^3, e desempenha um papel pró-sobrevivência em neurónios completamente diferenciados pela sua associação com o ARN positivo TIA1 grânulos ^4.

TERT é expresso e activo, principalmente em células somáticas de se dividir e, na maioria dos tipos de cancro, enquanto que os níveis de expressão e de actividade da enzima estão fortemente regulada em células que não se dividem ^5,6. Estudos têm demonstrado que, na rcérebro Odent, a atividade da telomerase torna-se indetectável por dia pós-natal 10, enquanto TERT mRNA é mantida em níveis mais baixos para a idade adulta ^7. Outros estudos demonstraram a actividade da telomerase na zona sub-ventricular adulto, o bolbo olfactivo, o hipocampo e no cerebelo e córtex adulto ^8. Recentemente, demonstrou que novos compostos que aumentam a expressão e a actividade de telomerase no cérebro e espinal cabos exerceu efeitos neuroprotectores em N-metil-D-aspartato (NMDA) - ratinhos injectados, atrasou o aparecimento e progressão da doença de esclerose lateral amiotrófica em SOD1 transgénico ratinhos e aumentou a sobrevivência de neurónios motores na espinal medula de ratinhos estas ^9. Para compreender totalmente a função pró-sobrevivência de telomerase em neurónios e no cérebro, o que é essencial para desenvolver um ensaio simples e relativamente sensível rápido para a detecção da actividade da telomerase em várias regiões do cérebro.

O telomérica rprotocolo de amplificação epita (TRAP) é um ensaio de sensibilidade conhecida a combinação de actividade de telomerase e canónico a reacção em cadeia da polimerase (PCR). Neste ensaio, a telomerase adiciona TTAGGG repete a um substrato de telomerase (TS iniciador) oligonucleótido, seguido de amplificação de PCR, que gera 6 pares de bases (pb) escada de DNA usando o TS inversa iniciador -. ACX ³² P dCTP marcado, são utilizados para detectar a pequena quantidade de produtos de PCR. A escada de ADN foi resolvido por electroforese em gel de sequenciação de poliacrilamida (PAGE). Tanto a intensidade das bandas de DNA e o comprimento da escada de ADN reflectem a quantidade de moléculas de enzimas activas e sua processabilidade, respectivamente, ^10.

Este ensaio tradicional detém algumas das maiores dificuldades: O perigo de exposição a substâncias radioactivas, grandes e difíceis de lidar com o seqüenciamento eo consumo de tempo do gel de corrida e exposição do filme do produto radioativo (durante a noite, em ambos os casos).

Este protocolo apresenta um ensaio de agarose não radioactivo melhorada mini-gel à base. O DNA 6 bp ladder é resolvido usando 4,5% de alta resolução em gel de agarose ea detecção é realizada com mancha de ácidos nucleicos altamente sensível. A combinação de alta resolução utilizando mini-gel de agarose e coloração de ácido nucleico sensível oferece fácil de manusear ensaio, elimina o risco de exposição à radioactividade e encurtar significativamente a duração total do ensaio de 3 dias a várias horas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

As experiências com animais foram aprovados pelo comitê de ética em experimentação animal no Universidade Ben-Gurion (IL-39-08-2010).

1. rato Cérebro extração de proteínas

1. Preparar 3 tubos de 15 ml cada, contendo 5 ml de solução e colocar tubos de Ringer no gelo.
2. Sacrifique o mouse usando anestesia isoflurano (ATENÇÃO - usar capuz química) por 10-20 segundos, seguido por deslocamento cervical e decapitação imediata.
3. Remover o cérebro do crânio e enxaguar durante alguns segundos com uma solução gelada de Ringer para evitar danos no tecido cerebral.
4. Usando uma lâmina cirúrgica, separar o cerebelo (CR) e tronco cerebral (BS), a partir do córtex frontal. Em seguida, separar o cerebelo a partir do tronco cerebral e cortar o lobo frontal (FL) a partir do córtex frontal; remover o bolbo olfactivo do lobo frontal. Coloque as três regiões do cérebro nas designadas tubos de 15 ml.
5. Homogeneizar o tecido em cada tubo. Adicionar fresh solução gelo frio de Ringer assim cada tubo contenha o mesmo volume e centrifuga-se durante 7 min a 800 x g.
6. Remover o sobrenadante e adicionar 100 mL de tampão de lise de CHAPS a cada tubo. Misture bem, fazendo passar a solução várias vezes (~ 10) através de uma seringa de 1 ml com uma agulha G 21, e incubar em gelo durante 30 min.
7. Transferir o conteúdo de cada tubo para um novo tubo de micro-centrífuga e centrifuga-se durante 30 min a 13.000 x g. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de micro-centrífuga e determinar a concentração de proteína utilizando um método previamente estabelecido. Guardar os extractos de proteína em alíquotas de 10 ul a -80 ° C.

2. TRAP Ensaio Preparação de Instrumentos, Soluções de reacção, e cálculos de diluição de proteína

1. Prepare o número apropriado de tubos etiquetados de micro-centrifugação de diluições de extracto de proteína e tampão de reacção da telomerase. Execute todas pipetagem no protocolo usando pontas com filtro para evitar a contaminação.
2. Descongele as seguintes soluções no gelo: TRAP mistura de reação 10x, TS primer, dNTP, extratos UPW e proteínas (ver tabela de materiais de reagentes e reagentes concentrações).
3. Dilui-se a solução de extracto de proteína para uma concentração final de 1 ug / mL utilizando água ultra-pura (PFS).

3. telomerase Reaction

1. Prepare mistura de reação telomerase, adicionando o seguinte para um tubo de micro-centrífuga: mix 2 l TRAP (10x), 1 ml TS primário (0,1 g), uma dNTPs ul (10 mm) e 15 mL UPW. Por várias amostras, multiplique volumes acima referidos pelo número de amostras, mais 1.
2. Adicionar 19 ul da mistura de reacção para cada tubo de reacção e adicionar 1 ul do extracto de proteína diluída (1 ug de proteínas) a cada tubo para um volume final de 20 ul.
3. Colocar os tubos de ensaio num banho de água pré-aquecida a 30 ° C durante 45 min.

4. PCR Reação

1. Quinze min antes do final da reação telomerase, descongelar as seguintes soluções: primers ACX, Titanium Taq buffer, UPW.
2. Prepare mistura da PCR, adicionando o seguinte para um tubo de micro-centrífuga: 2.5 l Titanium Taq Buffer (10x) 1 ml ACX primário (0,1 g), 2 l UPW (1 ml quando IC é usado) e 0,5 mL Titanium Taq Polimerase (50x). Por várias amostras, multiplique volumes acima referidos pelo número de amostras mais 2.
3. Adicionar 6 ul de mistura de PCR, cada tubo de PCR e adicionar todo o volume da reacção da telomerase (20 ul) a cada tubo para um volume final de 26 ul.
4. Inserir os tubos de PCR para um termociclador PCR e executar o seguinte programa:
   - 90 ° C - 2 min.
   - 94 ° C -. 30 seg *
   - 60 ° C - 30. Seg *
   - 72 ° C - 45. Sec *
   - 72 ° C - 2 min.
   O armazenamento de produtos de PCR a -20 ° C.
   * = 34 ciclos

5. Agarose Mini-gel Preparação, Amostras Correr, e Gel Coloração

1. Adicionar 25 ml de tampão de electroforese refrigerados (TBE) e uma barra de agitação para um copo que é 2-4 vezes o volume de solução tampão e, lentamente, por aspersão, em 1,125 g da alta resolução (HR) de agarose em pó, enquanto a solução é rapidamente agitada . Remova a barra de agitação, cobrir o copo com um filme plástico e furar em um pequeno buraco para ventilação. Aqueça a taça no microondas em potência "Low" por 3 min e depois mudar para poder "High" e aquecer a solução em pulsos curtos, com cuidado para não causar derramamento. Note-se que quando a espuma criada pelo aquecimento torna-se grandes bolhas e desaparece após alguns segundos, a agarose é preparado.
2. Lançar o gel a um aparelho de mini-gel horizontal, depois de o gel solidifica à temperatura ambiente para permitir que o gel relaxar durante 20 min a 4 ° C antes da utilização.
3. Coloque cada pista com 25 mL de amostra de TRAP (20 l TRAP produtos de PCR e 5 de corante gel-loading ul 6x) e executado em 110 V durante 3 horas numa câmara fria a 4 ° C.
4. Prepare 3x mancha de ácido nucleico solução de trabalho adicionando 15 ul 10.000x mancha de ácido nucleico-, solução de estoque a 50 ml de água duplamente destilada (ADD), com 0,1 M de NaCl (0,29 g). Corar o gel durante 20 minutos com agitação suave.
5. Use fonte UV com 302 nm de comprimento de onda para ver as bandas de DNA escada TRAP.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Extratos de proteínas de células inteiras foram preparados a partir do lobo frontal (FL), tronco cerebral (BS) e cerebelo (CR), obtido a partir de 3 CD-1 do sexo feminino e 3 CD-1 camundongos machos com as idades de 1 e 3 meses de idade para a ensaio TRAP modificado e 3 ratinhos CD-1 do sexo masculino com a idade de 2 meses de idade para o ensaio TRAP radioactivos. A actividade da telomerase foi detectada em 1 mg de extracto de proteínas usando o ensaio TRAP modificado e extrair 2 ug de proteínas para o ensaio TRAP ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Análise de actividade da telomerase no cérebro do rato através do ensaio TRAP é constituído por quatro etapas principais: 1) extracção de proteínas a partir de regiões específicas do tecido cerebral 2) TS alongamento do iniciador pela telomerase - reacção da telomerase 3) amplificação dos produtos de reacção da telomerase por RCP 4 ) separação dos produtos de PCR em gel de agarose, utilizando alta resolução.

Este ensaio TRAP modificado aborda duas grandes dificuldades que...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRAP Mix (10x)			Made manually, mix the following in UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0.5% TWEEN (purchased from Sigma). Aliquots are frozen at -20 °C.
Ringer's solution			Made manually, mix the following in DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4·H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g/L D-(+)-glucose anhydrous.
Isoflurane	Minrad INC.	NDC 60307-110-10	Handle with care in a chemical hood
dNTPs (10 mM)	Sigma	D7295
TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')	Sigma		DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration
ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3')	Sigma		DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration
Titanium Taq Polymerase/Buffer	Clontech	S1792/S1793
High Resolution agarose	Sigma	A4718	Any high quality high-resolution agarose may be sutible
Mini-gel apparatus	Bio-Rad	170-4466
Nucleic Acid Stain (GEL-RED)	Biotium	41003
IC primer (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3')	Sigma		DNA oligos orderd in DRY format and UPW added according to requierd concentration
CHAPS lysis buffer	Cell Signaling Technology	9852S	Add PMSF (protease inhibitor) to a final concentration of 1 mM
Ultra Pure Water (UPW)	Biological Industries	01-866-1B
CD-1 mice	HARLAN Laboratories INC.