Derivação de Cardiac células progenitoras de células estaminais embrionárias

Resumo

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Resumo

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

Introdução

A doença cardíaca continua a ser a principal causa no mundo de hoje e as taxas de mortalidade têm permanecido praticamente inalterado nas últimas duas décadas (American Heart Association). Há uma necessidade crítica para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para prevenir ou reverter a insuficiência cardíaca de forma eficaz. Uma estratégia promissora é a terapia à base de células após o rápido desenvolvimento da biologia das células estaminais ^1. A este respeito, PCC multipotentes poderia ser uma fonte excelente de células para a terapia devido à sua capacidade de proliferar, mas só comprometidas para diferenciação linhagem cardíaca. Portanto, o método eficiente e robusta para gerar e isolar CPCs é de grande importância para os estudos de terapia celular cardíaca.

Este protocolo incide sobre CPCs embrionárias identificadas durante a embriogênese e como a sua geração de CES. Vários CPCs foram isolados de corações embrionárias e adultas, mesmo a partir de medulas ósseas ^2. Durante o desenvolvimento embrionário, morphoge ósseaproteínas Netic (BMPs), do tipo sem asas membros da família local de integração MMTV (Wnts) e sinais nodais induzir o compromisso da Mesp1 ⁺ mesoderme multipotentes ^3. Células Mesp1 ⁺ então diferenciar em CPCs ⁴ embrionárias. Estes CPCs são tipicamente marcado por HCN4, NK2 homeobox 5 (NKX2-5), Isl LIM homeobox 1 (Isl1), T-box 5 (Tbx5) e miócitos fator potenciador 2C (MEF2C), formam campos primários do coração e segundo, e contribuir para as principais partes do coração durante cardiogenesis ^5-10. Ambos CPCs NKX2-5 ⁺ e Isl1 ⁺ / ⁺ MEF2C são capazes de se diferenciar em cardiomiócitos, células de músculo liso (SMCs), e células endoteliais ^5-8. Assim, estas CPCs vai dar origem a vasculatura cardíaca, bem como tecidos cardíacos e são uma fonte ideal de células para a terapia cardíaca com base em células. Consequentemente, gerando CPCs in vitro tem sido um grande foco de pesquisa em estudos cardiovasculares. Desde CES tem expansão ilimitada capacidade de umnd representam as células da MCI em estágio de blastocisto, a diferenciação dos CES em CPCs embrionárias após a embriogênese natural é considerada uma abordagem lógica e eficaz para obter CPCs.

Uma abordagem amplamente aplicada para obter CPCs da CES é agregar CES em EBs ^11. Para melhorar a eficiência da diferenciação, crescimento e factores químicos definidos com base no conhecimento de desenvolvimento cardíaco foram utilizados ^12-14. No entanto, não há marcadores CPC definitivos, particularmente não há marcadores de superfície celular, que são amplamente aceitos no campo. Para abordar esta questão, os CES são projetados para marcar CPCs Isl1 ⁺ ou MEF2C ⁺ e seus derivados com repórteres fluorescentes de Cre sistema / loxP. A recombinase cre é batido para dentro sob o controlo de Isl1 / MEF2C promotor / potenciador. Modificado RFP proteína fluorescente ou gene de YFP conduzido por um promotor constitutivo pode ser activado pela excisão de paragem flox codão com a recombinase cre(ISL1: cre; pCAG-Flox-STOP Flox-GFP ou RFP / Isl1-cre; Rosa26YFP / MEF2C-cre; Rosa26YFP) ^5,6. Uma vez que os CES são diferenciadas em CPCs segundo campo coração, Isl1 / MEF2C promotor / cre conduzido irá ativar os repórteres fluorescentes e CPCs podem ser enriquecidos por FACS-purificação. Resumidamente, o método de agregação EB é usado para iniciar a diferenciação ESC. Para aumentar a eficiência de diferenciação, as células diferenciadas são tratados com ácido ascórbico (AA) e factores de crescimento, tais como Bmp4, Activina A e VEGF ^13,15. Este protocolo permite robusto e eficiente diferenciação CPC usando mouse e do CES humanos.

Protocolo

1. Derivação of Mouse Embryonic CPCs de Mouse CES

1. Prepare rato fibroblastos embrionários (MEFs) camada alimentadora.
   1. MEF meio quente (10% de FBS em DMEM) a 37 ° C.
   2. Prepare placas revestidas com gelatina.
      1. Adicionar 1 ml de 0,1% de gelatina em água dentro de um poço de placa de 6 poços ou 5 ml para uma placa de 10 cm.
      2. Deixar as placas ou pratos a 37 ° C ou temperatura ambiente durante pelo menos 30 min. Aspirar a gelatina, antes da utilização.
   3. Descongelar irradiadas MEFs rapidamente num banho de água a 37 ° C, com agitação suave.
   4. Transferência das células suavemente para um 15 ml ou 50 ml tubo cônico. Adicionar 5 ml de meio de MEF pré-aquecido. Agitar as células lentamente e centrifugar a 200 xg durante 5 min.
   5. Ressuspender as células em meio MEF e contagem de células viáveis. Use os seguintes volumes de meio MEF: 2 ml de células por cavidade de uma placa de 6 poços e 10 ml de células a partir de uma placa de 10 cm.
   6. Células da placa em placas de 6 poços ou placas de 10 cm em 1-2x 10 ⁶ por placa / prato.
   7. Incubar as placas / MEF pratos a 37 ° C, 5% de CO _2, pelo menos, 24 horas antes da utilização.
      NOTA: Descarte MEF placas / pratos mais de uma semana.
2. Prepare CES rato
   1. Cultura do Isl1-cre; Rosa26YFP / MEF2C-cre; Rosa26YFP rato CES em MEFs até 90% confluentes. Utilização de células ES meio constituído por 410 ml de DMEM, FBS a 75 ml, 0,1 mM MEM NEAA, 2 mM de L-glutamina, piruvato 0,1 mM, 100 U de Pen / Strep, e 0,1 mM de β-mercaptoetanol.
   2. Prepare revestidos com gelatina placas de 6 poços, como descrito em 1.1.2.
   3. Aspirar o meio das placas e lavar as células com DPBS.
      1. Aspirar DPBS e adicionar 0,4 ml de Tripsina a 0,25% para um poço de placa de 6 poços. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 5 min. Adicionar 1 ml de meio ES pré-aquecido a reacção cessar tripsina.
   4. Células colheita e centrifugar células a 200 xg e aspirado médio. Ressuspender as células em 1 ml de meio ES celular e contar as células.
   5. CES placa em placas revestidas com gelatina com uma densidade de 3 x 10 ⁴ / cm ^2. Incubar a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante cerca de 2 dias quando os CES atingir cerca de 90% confluente. Mudar a forma cotidiana.
   6. Quando CES são 90% confluentes, repita os passos 1.2.2-1.2.5 para remover completamente os alimentadores MEF.
3. Induzir CPC diferenciação por formação de EB
   1. Prepare meio de diferenciação como se segue: 36 ml de IMDM, 12 ml de Ham F12, 2 mM de L-glutamina, 0,34 ml de BSA (7,5%), 0,25 mL de N2, 0,5 mL B27, 50 ug / ml de AA, e 0,45 mM de 1-tioglicerol.
   2. Aspirar médio a partir de células e enxágüe com DPBS. Aspirar DPBS e adicionar 0,4 ml de Tripsina a 0,25% para um poço de placa de 6 poços. Incubar a 37 ° C durante 5 min.
   3. Adicionar 1 ml de meio de diferenciação para que cesse a reacção e pipeta-se para baixo e para dispersar os agregados de células em células individuais.
   4. Centrífuga CES a 200 g durante 5 min e descartar o meio.
      1. Ressuspender 1 x 10 ^{6 <}/ Sup> CES em 1 ml de meio de diferenciação. Contar as células, e as células de cultura em placa de Petri de descolamento baixo, numa concentração de 1 x 10 ⁵ células / ml em meio de diferenciação a 37 ° C para a primeira agregação EB.
   5. Dois dias após a formação da EB, transferir CEs a partir de pratos de tubos de 50 ml. Gire a 200 xg por 1 min. Remova o meio e enxaguar EBs com 10 ml DPBS sem Ca ²⁺ e Mg ^2+.
   6. Aspirar DPBS e adicionar 1 ml de 0,25% de tripsina. Incubar a 37 ° C durante 5 min. Adicionar 4,5 ml de meio de diferenciação para parar a reacção. Pipet cima e para baixo para dissociar EBs em células individuais.
   7. Centrifuga-se as células a 200 xg durante 5 min. Aspirar células médio e ressuspender em 1 ml de meio de diferenciação.
   8. Contar as células, e dilui-se 2 x 10 ⁶ células para 1 x 10 ⁵ células / ml em meio de diferenciação. Adicionar VEGF, Bmp4 e a activina A para o meio a uma concentração final de 5 ng / ml, 0,8 ng / ml e 5 ng / ml, respectivamente. Culture as células em uma placa de Petri para a segunda formação EB a 37 ° C.
   9. 40 horas após a segunda formação EB, transferir EBS para tubos de 50 ml. Lavar uma vez com DPBS, dissociar EBs com 1 ml de tripsina a 0,25% a 37 ° C durante 5 min. Pipet cima e para baixo para dissociar EBs em células individuais.
   10. Ressuspender as células em meio STEMPRO-34 com 5 ng / ml de VEGF, 10 ng / ml de bFGF e 12,5 ng FGF10 / ml. Placa as células a 2 x 10 ⁵ / cm ² em placas revestidas com gelatina. Cultura em 37 ° C incubadora por cerca de 32 horas antes CPC isolamento.
4. Isolar mCPCs
   1. Aspirar médio e enxágüe com DPBS. Adicionar 0,5 ml de 0,25% de tripsina a placas de cultura a 37 ° C durante 5 min. Adicionar 4,5 ml de meio de diferenciação para parar a reacção. Pipet cima e para baixo para dissociar EBs em células individuais. Coletar as células por células de centrifugação e ressuspender em 2% FBS / PBS para FACS-purificação.
   2. Execute CES indiferenciadas em classificador como controle negativo. Mudança de tensão para ajustar o scat frenteter (FSC) e dispersão lateral (SSC) para selecionar população desejada. Use a frente dispersar contra dispersão lateral e altura de dispersão frontal versus largura de excluir detritos e gibão. No sub-população selecionada, de acordo com a distribuição dos controles do CES, desenhe um portão de YFP positivo no histograma para eliminar autofluorescência celular. Recolha YFP ⁺ CPCs de YFP ⁺ gating.
   3. Placa os CPCs purificados (células YFP ⁺⁾ em placas de 6 poços com meio de diferenciação (1.3.1). Cultura adicionais 3-5 dias a 37 ° C para a diferenciação de CPCs em cardiomiócitos e PMEs.

2. Determinação dos embrionárias humanas CPCs da CES Humanos

1. Prepare Feeders
   1. Prepare rato fibroblastos embrionários (MEFs) camada alimentadora, como descrito acima, a uma densidade de 2 x 10 ⁴ / cm ^2.
2. Manter CES humanos
   1. Manter ISL1 humano: cre; pCAG-Flox-STOP-Flox-GFP ou RFP CES rotineiramente em MEF utilizando meio de células estaminais embrionárias humanas regular (Knockout DMEM / F-12 de 385 ml, 100 ml Knockout SR, 2 mM de L-glutamina, NEAA 0,1 mM, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 10 ng / ml de FGF básico). Antes de diferenciação cardíaca, transferir CES humanos em estado livre alimentador por pelo menos 2 passagens.
3. Prepare CES humanos na condição livre alimentador
   1. Prepare placas revestidas para CTEs humanas cultura.
      1. Descongelar matrigel a 4 ° C durante a noite. Coloque um tubo de 50 ml em gelo e adicionar 30 ml de meio DMEM / F12 frio para dentro do tubo.
      2. Adicionar 1 ml de matrigel no meio frio e misturar bem. Adicionar 1 ml de matrigel frio-DMEM / 12 em forma de um poço de placa de 6 poços ou 5 ml para uma placa de 10 cm.
      3. Deixar as placas / pratos a 4 ° C durante a noite ou a temperatura ambiente durante 2 horas. Aspirar o meio antes da utilização.
   2. Dividir CES humanos nas placas: Aspirar media de placa MEF e enxaguar CES humanos com DPBS. Em seguida, adicionar 1 ml de dispase (1 mg / ml) para um poço de placa de 6 poços. Incubar as células em 37 ° Cincubadora até que as bordas de colónias começar a separar.
   3. Remova a solução dispase. Enxágüe com DPBS duas vezes, em seguida, adicionar 2,5 ml / per médio bem mTeSR ou médio MEF-condicionado para a chapa.
   4. Raspe as células usando um raspador de células e cuidadosamente pipeta cima e para baixo para quebrar colônias ESC humanos em pequenos aglomerados.
   5. Transfira os aglomerados ESC e diluir 1: 3 em placas revestidas.
   6. Adicione 2 ml / médio bem mTeSR ou médio MEF-condicionado e mudar médio diário.
   7. CES humanos em cultura, ou em meio mTeSR MEF-condicionado em placas revestidas durante pelo menos 2 passagens.
4. Induzir CPC diferenciação do CES humanos
   1. Quando as células são ~ 90% confluentes, aspirar a médio e enxágüe com DPBS. Em seguida, incubar as hESCs em 0,5 mg / ml em Dispase 37 ° C durante 20 min.
   2. Lavar o hESCs com DPBS duas vezes, remover as células a partir das placas com um tirante de células, em seguida, voltar a suspender as braçadeiras de células em meio de diferenciação (DMEM / F12 contendo 18% de FBS, NEAA 0,1 mM, 2 mML-glutamina, 0,1 mM de β-mercaptoetanol e 50 ug / ml de ácido ascórbico).
   3. Transferência de células em placas de 6 poços ultra-baixas de fixação para a formação de EB.
   4. Alterar meio de diferenciação dia seguinte.
   5. Substituir meio a cada 3 dias e manter CEs em cultura em suspensão.
5. Isolar HCPCS
   1. Recolha EBs mais tardar dia 9 de diferenciação para o isolamento CPC humano.
   2. Aspirar médio e enxaguar EBs com DPBS duas vezes. Adicionar 0,5 ml de 0,25% de tripsina a cada poço de placas de cultura de 6 poços a 37 ° C durante 5 min.
   3. Adicionar um volume igual de meio de diferenciação para parar a reacção. Pipet cima e para baixo para dissociar EBs em células individuais. Recolher as células por centrifugação a 200 xg durante 5 min e ressuspender as células em 2% de FBS / DPBS. Células do filtro com 40 um filtro de células e FACS-purificado a RFP ⁺ células CPC, conforme descrito no 1.4.3.
   4. Placa HCPCS classificados em placas revestidas com geltin. HCPCS cultura em meio de diferenciação para 7-9 Dias para se diferenciarem em células de músculo liso e de cardiomiócitos. 7 dias após o plaqueamento, cultura células com 5% Knockout SR em meio DMEM / F12 diferenciada.

Resultados

O protocolo mostra derivação de CPCs de várias linhas de células ES. CES são agregados para formar EBs de se diferenciar em CPCs. CES são rotineiramente mantidas em alimentadores MEF (Figura 1A, F) e os alimentadores são removidos antes de diferenciação. Após a agregação dos CES em CEs em meio de diferenciação (Figura 1B, G), o segundo EBs formados são tratadas com Activina A Bmp4 e para melhorar a diferenciação mesoderme em linhas celulares de ratinho (Figura 1...

Discussão

This protocol combines a method using growth factors to guide mESCs differentiation and spontaneous differentiation of human ESCs into CPCs. CPC lineage marked with fluorescent reporter is used to efficiently identify and isolate CPCs by FACS. The FACS-purified CPCs retain the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle, and endothelial cells and have a comparable expression profile to the in vivo cells. Thus, these CPCs can serve as a great resource for cell based heart therapy because of their ability ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
FBS	Thermo scentific	SH30070.03E
Knockout SR	Life technology	10828028
Knockout DMEM	Life technology	10829018
DMEM	Life technology	11965118
NEAA	Life technology	11140050
GlutaMAX	Life technology	35050061
N2	Life technology	17502048
B27	Life technology	12587010
Ham’s F12	Life technology	11765062
IMDM	Life technology	12440061
Pen/Strep	Life technology	15140122
Pyruvate	Life technology	11360070
Dispase	Life technology	17105041
Stempro-34	Life technology	10639011
DMEM/F12	Life technology	11330032
BSA	Life technology	15260037
Trypsin	Life technology	25200056
Ascobic Acid	Sigma	A5960
1-Thioglycerol	Sigma	M1753
2-Mercaptoethanol	Sigma	M3148
VEGF	R&D	293-VE
Bmp4	R&D	314-BP
ActivinA	R&D	338-AC
bFgf	R&D	233-FB
Fgf10	R&D	345-FG
mTeSR	Stemcell technologies	5850
Matrigel	BD Biosciences	354277