Murino modelo de coração isolado de atordoamento do miocárdio Associated com parada cardioplégica

Resumo

The goal of this protocol to assess myocardial stunning following ischemic cardioplegic arrest in rodents.

Resumo

O protocolo a seguir é útil para avaliar a função cardíaca comprometida ou deslumbrante seguintes insultos isquêmicos moderados do miocárdio. A técnica é útil para a modelagem de lesão isquêmica associada com numerosos fenômeno clinicamente relevantes, incluindo cirurgia cardíaca com parada cardioplégica e circulação extracorpórea, revascularização do miocárdio sem CEC, transplante, angina, isquemia breve, etc. O protocolo apresenta um método geral para modelar hipotérmica parada cardioplégica hipercalêmica e reperfusão em corações de roedores com foco na medição da função contrátil do miocárdio. Em resumo, um coração do rato é perfundido no modo de Langendorff, instrumentada com um balão intraventricular, e parâmetros cardíacos funcionais de linha de base são registados. Após a estabilização, o coração é então sujeito a infusão breve de uma solução de cardioplegia hipotérmica cardioprotetor para iniciar a parada diastólica. Cardioplegia é entregue de forma intermitente ao longo de 2 h. O coração é então reperfundidos e warmed para temperaturas e recuperação da função do miocárdio normotérmicas é monitorada. O uso deste protocolo resulta em função contrátil cardíaca deprimida confiável livre de danos no tecido do miocárdio bruta em roedores.

Introdução

Atordoamento do miocárdio é definido como atividade contrátil reduzida reversíveis apesar da restauração do fluxo de sangue adequado após um breve período de isquemia ou períodos prolongados de insultos isquêmicos com cardioprotection ^1,2,3,4,5. O método apresentado é especificamente usado para modelar insultos isquémicos clinicamente relevantes que pode resultar em deficiências na função contráctil reversíveis (ou seja, insultos isquémicos associados com a cirurgia cardíaca utilizando paragem cardioplégica, breves períodos de isquemia, angina, etc). Em contraste com estudos isquemia grave (enfarte do miocárdio, necrose) este protocolo foi desenvolvido para avaliar a recuperação funcional do miocárdio e cardioprotection sem lesão do tecido, remodelação, e morte celular. A maior parte do trabalho discute um protocolo de parada cardioplégica padrão com elementos semelhantes a uma cirurgia cardíaca com hipotermia e entrega cardioplegia intermitente.

Prot miocárdioexão durante a maioria das cirurgias cardíacas depende de cardioplegia e circulação extracorpórea. Embora cardioplegia (CP) soluções e estratégias variam muito (sangue, cristalóide, frio, etc. quente) os elementos mais comuns são: 1) hipercalemia e / ou outras estratégias para prender o coração em diástole, limitando assim a utilização da energia resultante de contração do miocárdio, e 2) a hipotermia para desacelerar o metabolismo e ajudam a manter ATP e outras reservas de energia enquanto preso. Soluções de cardioplegia atuais fornecer proteção para o coração contra insultos isquêmicos que provariam de outra maneira fatal. No entanto, as estratégias de cardioprotetores durante insultos isquêmicos cirúrgicos não são perfeitos, e a lesão isquêmica leve resultante pode resultar em disfunção contrátil cardíaca reversível, apesar de o fluxo sanguíneo adequado (atordoamento do miocárdio), acidose, lesão dos cardiomiócitos, e efeitos vasculares, incluindo diminuição da perfusão coronariana e vasoespasmo.

Este protocolo diferea partir de modelos de isquemia do coração isolado padrão avaliando infarto do miocárdio e isquemia grave na medida em que avalia insultos isquêmicos mais leves que pode resultar em função cardíaca prejudicada seguinte breve isquemia ou insultos isquêmicos associada à parada cardioplégica. (Para revisão sobre técnicas de perfusão de Langendorff e I / R ver estudos ^6-8). Para orientações gerais e uma análise aprofundada dos parâmetros experimentais associados com rato corações perfundidos isolados ver Sutherland e t al., 2003 ⁹ A técnica apresentada aqui detalha o equipamento necessário, reagentes, etapas, estratégias e dicas para induzir de forma confiável impressionante em corações do rato. Pequenas modificações são necessárias para aplicar a técnica de ratos.

Resumidamente isolado do rato corações são de Langendorff perfundido durante aproximadamente 30 min, com tampão fisiológica de Krebs-Henseleit (KHB), seguido por paragem cardíaca protegido frio através da entrega de um hypotherm hipercalêmicosolução de cardioplegia ic. Após a detenção, a recuperação funcional cardíaca é monitorada durante o reaquecimento e reperfusão do coração com KHB. As alterações no grau de recuperação da função contráctil cardíaca pode ser avaliada para determinar agentes cardioprotectores e diferentes estratégias de cardioprotecção.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos foram aprovados pelo Cuidado e Uso de Animais Comitê Institucional da expectativa de vida e todos os animais e os procedimentos de acordo com o Guia de Conselho de Pesquisa Nacional para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório ^10.

1. Fabricação Balão e Pressão Ventricular Esquerda monitoramento do circuito

1. Construir balões LV de acordo com Miller et al. ^11, numa proveta com uma barra de agitação, misturar 9,5 ml de água destilada, 14,2 ml de xarope de milho leve e 33,8 g de sacarose, e de calor sobre uma placa quente, misturar até o açúcar se dissolver . Continuar solução de aquecimento até atingir cerca de 150 ºC.
   NOTA: Vários métodos existem para a construção de balões LV incluindo modificação de dicas de preservativos e agarram filme construção ^9,12. Nós encontramos o método acima para ser relativamente fácil de construir balões de vazamentos gratuitos, no entanto uma vantagem de balões película aderente inclui caracterização anterior para frequen apropriadocy relações ^resposta-9.
2. Quebre fios de espaguete seco em pedaços de cerca de 5 cm de comprimento e mergulhar um lado de cada peça de cerca de 1 cm de profundidade na solução de açúcar e lentamente remover.
3. Coloque a extremidade seca da tira de massa em um bloco de espuma de poliestireno e suspender para que o mix de açúcar escorre e forma um molde forma de lágrima. Deixar O / N em um exsicador de modo que o molde endurece.
4. No dia seguinte, mergulhe os moldes em gel de dispersão de silicone. Coloque tiras de massa de volta no bloco de espuma de poliestireno e coloque em aa 37 ºC forno por 2 horas ou até secar. Repita este passo mais uma vez assim duas camadas de silicone são aplicadas.
5. Depois de seco, em lugar de água durante várias horas, para ajudar na remoção do balão do molde. Loja balões em solução de azida de sódio a 0,02%.
6. Use uma coleta de sangue 23 G ajustado para produzir uma cânula balão personalizado cortando uma agulha para criar uma ponta romba e colocando entalhes na agulha.
7. Conecte o tubo a uma pressão transprodutor e lave com água corrente, mantendo tubo e cânula completamente submerso para evitar a entrada de ar no sistema. Coloque um balão que foi preenchido com água sobre a cânula e usar fio de seda 2-0 para empatar em cânula. Teste de balão pela capacidade de manter a pressão (~ 100 mmHg para pelo menos 1 hora)

2. Preparação da perfusão isolada do Sistema Coração

1. Inicialmente, lavar e aquecer o sistema. Ligue um circulador banho de 37 ºC água morna que tem sido ligado ao aparelho de Langendorff, e encher reservatório tampão com água destilada. Conecte um novo filtro de fibra de vidro para tubulação fluindo em aparelhos e ligar a bomba para expulsar o sistema. Durante o tempo de preparação, monitorizar a temperatura da água expelida a partir do bloco de Langendorff usando uma sonda de temperatura, para assegurar que o banho de água é definida com precisão. Além disso, ligar um circulador refrigerado e definido para 20 ºC que será usado durante a parada cardioplégica do coração.
2. EUn entretanto preparar as seguintes soluções. Prepare 1 litro de solução cardioplégica (NaCl 110 mM, KCl 16 mM, 16 mM de MgCl _2, 1,5 mM de _CaCl2, 10 mM de _NaHCO3) e filtra-se. Além disso, preparar 2 L de KHB (NaCl 118 mM, KCl 4,8 mM, 1,2 mM _de KH ₂ PO _4, 1,7 mM _MgSO4, 2 mM de Na-piruvato, dextrose 6 mM, 24,9 mM de NaHCO ₃ (pré-arejada com CO ₂₎ , 1,4 mM de CaCl ₂ (adicionado em último lugar). Uma vez dissolvido, remover os precipitados por filtração para um frasco de vidro usando um funil de frita de 5 um. Colocar um pouco para um pequeno prato em gelo para ser usado durante a cirurgia e isolamento.
3. Oxigenar o perfusato (KHB) com 95% _{de O2} / 5% de CO ₂ durante pelo menos 30 min antes da utilização. Sistema de perfusão Langendorff com KHB para remover qualquer resto de água do sistema e tampão do reservatório. Para ratos, definir a velocidade inicial bomba para ~ 2,0 ml / min. Coloque 2-0 e 4-0 seda perto de perfusão cânula. Execute a bomba até que o tubo e aparelhos são preenchidas sagacidadeperfusato h e garantir a Strup bolha é preenchido com perfusado.
   NOTA: Para longos períodos de perfusão e função estável é altamente recomendável instalar um filtro de fibra de vidro em linha (~ 1 mm) no circuito de perfusão para recolher quaisquer precipitados que podem formar coágulos no coração

3. Rato Cirurgia

3.1) mouse Anestesia e Manuseio

1. Preparar seringa com uma dose de anestésico de 80 mg / kg de cetamina e 5 mg / ml de mistura de xilazina, e adicionar 0,9% de solução salina estéril para levar o volume para 0,2 ml. Injectar Heparina IP (50 ul de solução de 1.000 U / ml).
2. Coloque o mouse de volta para contentor de transporte (~ 10-20 min) e esperar por ele para perder a consciência como heparina produz efeitos. Periodicamente fazer uma pitada dedo do pé para monitorar reflexo dor.

3.2) Remova o coração

1. Uma vez que o mouse é totalmente inconsciente e não responde aos pés pitada, fixá-lo para uma mesa de operação apropriado utilizando pinos ou 25 g pontas de seringa através das extremidades. Executar uma toracotomia para expor o coração. Corte um pequeno buraco logo abaixo do esterno e estender o corte para os lados do ratinho evitando o diafragma.
2. Rapidamente cortar o diafragma e depois cortar rapidamente acima dos lados da caixa torácica. Virar para trás a caixa torácica como uma concha de molusco para expor a cavidade torácica. Segure cuidadosamente o coração, coloque uma tesoura por baixo e remover o coração.
   NOTA: É essencial para remover rapidamente o coração uma vez que é exposta na cavidade torácica e os pulmões não são funcionais.

3.3) Limpe o coração

1. Colocar o coração no prato contendo gelo KHB frio e retire todos os pedaços grandes de tecido pulmonar em anexo. Use uma pinça para pegar o coração e localize a aorta. Aperte delicadamente o coração e olhar para qualquer sangue que aparece, como esta deve ser a extremidade aberta da aorta. Use uma pinça de ponta fina para manter o coração aberto até o final da aorta.

e "> 4. Montagem do coração, A partir de Perfusão, e colocando o balão

4.1) Montagem e canulação do coração

1. Antes de transportar o coração para o aparelho de Langendorff, ligar a bomba de garantir que a pressão de perfusão é baixa (~ 20 mmHg). Segure o coração pela aorta logo abaixo da cânula. Usando um outro conjunto de pinças de ponta fina, abra cuidadosamente a aorta e coração deslize para cima da cânula. Segure-o no lugar com um conjunto de pinças e, em seguida, usar um clipe macio gumes para prendê-lo temporariamente para cânula.
   NOTA: montagem rapidamente o coração para a cânula de perfusão é fundamental para uma boa preparação. Com a experiência, os procedimentos de abertura da cavidade torácica de montagem até que o coração deve ter entre 1 e 2 minutos.
2. Amarre e iniciar a perfusão da seguinte maneira, usando sutura de seda 4-0 aorta segura para a cânula diretamente abaixo do clipe. Garantir o empate também é em torno da cânula metálica aórtica, de modo a aorta não fica amarrado ao apertaro nó. Uma vez que um laço é colocado firmemente, remover o clipe.
3. Use fio de seda adicionais para prender a aorta de forma segura para a cânula certificando-se de amarrar abaixo quaisquer ramos dos vasos que podem ser saindo da aorta. Estes muitas vezes pode ser manchado por vazamento perfusato ou atirando para fora da aorta.
   NOTA: Durante as fases iniciais da perfusão do sangue deve ser lavar a partir do coração e de todo o coração deve aparecer uma cor rosa suave. Descolorações escuras que não lavam a indicar as áreas isquêmicas provavelmente devido a embolia de ar ou coágulos eo coração não deve ser utilizado.

4.2) O estabelecimento de Medição de Perfusão e LVP

1. Lentamente, aumente a pressão de perfusão e aumentar a velocidade da bomba até que a pressão de perfusão atinge 70 mmHg.
   NOTA: as pressões de perfusão padrão para rato perfusão pode ser 70-90 mmHg, mas deve ser mantida constante de animal para animal dentro de um experimento.
2. Limpar o restante tecido (pulmão, tiróide, etc.) Que ainda podem estar ligados ao coração. Use a tesoura para cortar os átrios esquerdos, a fim de criar uma abertura para o ventrículo esquerdo.
3. Coloque o balão para o titular e desinflar. Posicionar a cânula balão perto da cânula aórtica, directamente sobre a abertura para o ventrículo esquerdo. Insira com cuidado o balão para baixo para o ventrículo esquerdo, mantendo o coração no lugar de modo a aorta não rasgue.
4. Uma vez que é no lugar, lentamente começar a inflar o balão até que o LVEDP atinge ~ 8 mmHg. Colocar a sonda de temperatura contra o fundo do coração, de modo que mede a temperatura do efluente.

4.3) Medição basal

1. Selar o coração em uma câmara de perfusão com camisa de água. Durante este tempo perfundir continuamente o coração com KHB, e assegurar que a temperatura continua a subir. Monitorar a temperatura e ajustar a água do banho nesse sentido até atingir cerca de ~ 37 ºC.
   NOTA: Monitoramento temperature nas fases iniciais da perfusão é fundamental como fluxos coronarianos e, posteriormente, a temperatura pode variar de coração para coração. Temperatura do perfusato efluente é monitorizado para a temperatura desejada do miocárdio através de uma sonda de temperatura colocada no vértice do coração. Além disso, em comparação com outros protocolos de perfusão de Langendorff, o coração não está submersa em CP ou KHB durante a perfusão ou de captura, isto é feito principalmente para ajustar rapidamente a temperatura, bem como proporcionar a entrega eficiente CP sem difusão.
2. Comece a gravar continuamente medida funcional utilizando um sistema de aquisição de dados ligados aos sensores apropriados, incluindo a pressão de perfusão, a pressão ventricular esquerda (transdutor de pressão ligado ao balão de LVP), temperatura e parâmetros electrofisiológicos (ECG, MAPA se assim equipado) (anexo será de acordo com os fabricantes e específica para os sensores individuais e sistema de aquisição de dados). Uma vez que o KHB efluente atinge ~ 37 ºC durante, pelo menos 15 min e parâmetros funcionais cardíacas são estáveis, observe o tempo para as medições da linha de base.
   NOTA: Os critérios de inclusão / exclusão são aplicados a cada coração. Um LVDP de <60 mm Hg na linha de base indica um coração que deve ser removido a partir da análise. Além disso, o fluxo coronariano> 4,5 ml / min, ou incapacidade de manter a pressão de perfusão no início do estudo provavelmente indica um vazamento ou aorta rasgada. Além disso, quaisquer corações que têm áreas claras isquémicos os quais podem ser confirmadas visualmente (isto é, coágulos) ou exibem reduções associada a isquemia na função cardíaca (isto é, aumentar a PDFVE, extremamente arrítmico) são removidas a partir da análise.
3. Medir o fluxo coronário através de recolha do efluente coronário em um cilindro graduado de 1 min. Feche a câmara e permitir que a temperatura ea função para retornar aos valores basais. Alternativamente medir o fluxo coronário continuamente na linha de perfusão através de uma sonda de fluxo colocado depois do circuito de alívio de pressão.

"> 5. Iniciando Cardioplégicas Arrest

1. Coloque 100 ml de tampão de cardioplegia fria para outro reservatório e. transferir o reservatório cânula KHB para o reservatório de cardioplegia.
2. Retire a água com camisa de habitação e do circuito de aquecimento da perfusão do banho de água quente e conectar-se ao circulador refrigerado usando tubulação engates rápidos. Use circuladores de aquecimento e resfriamento separadas para permitir mudanças rápidas de temperatura do coração e perfusado.
3. Seguir a bolha de ar que se introduz na tubagem durante o interruptor, e uma vez que atinge perto do coração isolado iniciar a cronometragem de cardioplegia. Entregar cardioplegia por 2 min. Após a dose inicial parar a bomba. Certifique-se de parar o coração na diástole e estar perto da temperatura CP desejado.
   NOTA: Um borbulhador suficiente é necessária para evitar a embolia de ar no coração. Alternativamente, um sistema de libertação para ambos os reservatórios comutadas por uma torneira de passagem pode ser facilmente construído, no entanto, encontrar sigaing a pequena bolha de ar que é introduzido quando trocar a cânula entre os reservatórios, um método fácil de entrega CP tempo dado potencialmente diferentes velocidades de bomba entre experimentos (isto é, devido ao mouse / rato, pressão de perfusão, a resistência do filtro, etc.)
4. Manter o coração em cardioplegia durante 2 horas a ~ 20 ºC. A cada meia hora durante CP ligar a bomba de volta por 1 min para que outra dose é administrada.
   NOTA: doses intermitentes de CP a cada 30 minutos resulta em comprometimento funcional do coração sem necrose do tecido. Períodos mais longos entre as doses de CP (isto é,> 45 min) pode resultar em necrose e contratura isquêmica e seria mais apropriado para um modelo de lesão necrótica associada com isquemia desprotegido.

6. A reperfusão

1. No final da CP, transferir a cânula de volta para o reservatório KHB oxigenado. Ligue os circuitos de controle de temperatura para o circulador de aquecimento e ligar a bombapara iniciar a reperfusão. Neste ponto, a cardioplegia lava fora, observar o aumento de temperatura e o coração começa a bater de novo, após 2-4 minutos de reperfusão. Quando o coração começa a batida do coração é lento e muitas vezes arrítmico.
   NOTA: Não há geralmente não é um grande aumento na LVP diastólica (ou seja, aumento ≤10 mmHg), que é muitas vezes característica em modelos de isquemia puros. As arritmias podem persistir até a reperfusão e, ocasionalmente, o coração terão de ser desfibrilado. Isto pode ser conseguido com o uso de um conjunto estimulador para tensões mais elevadas (~ 10-50 V) e os eléctrodos colocados na base e do vértice do coração.
2. Permitir que o coração para reperfundir durante 30 minutos, e durante este período de tempo fazer medições do fluxo coronário, conforme necessário. Medir o fluxo coronário por recolher o efluente com um cilindro graduado para 30-60 seg.

7. Coleta de Tecidos

1. Desinflar o balão e retire-o do ventrículo esquerdo. Leve o coração fora docânula e pesá-lo. Em experiências iniciais, pelo menos uma fatia transversal do coração devem ser tomados e TTC coradas para avaliar a necrose para assegurar que o coração está livre de qualquer lesão necrótica.
2. Coletar fatias coração para estudos de microscopia, pesos de wet / dry, etc. O restante, ou todo o coração deve ser rapidamente congelado, colocando em nitrogênio líquido. Loja corações congelados num congelador -80 ºC.
   NOTA: Para a medição dos compostos fosfatados de alta energia (ou seja, ATP, fosfato de creatina), os corações devem ser congelados imediatamente.

Resultados

A Figura 1 apresenta os resultados típicos de um experimento mouse. LVP (linha vermelha), dP / dt (linha verde) e temperatura (linha roxa) foram continusouly gravou mais de ~ 3 horas. Letras indicar uma - medida de referência, b, c, d, e - entrega de solução cardioplégica, f - início da reperfusão, g, h, i, j - medição do fluxo cornary durante a reperfusão. Note, LVDP deprimido e dP / dt sobre reperfusão em relação à linha de base. Figura 1B inclui os dados de um gravou ma...

Discussão

Os detalhes do protocolo anteriores métodos para avaliar o atordoamento do miocárdio secundário a isquemia global associada à parada cardioplégica. Em nossas mãos este protocolo produz uma redução aproximada de ~ 40% na função cardíaca (LVDP, +/- dP / dt), com alterações mínimas na frequência cardíaca no 30 min pós-reperfusão ponto de tempo. À medida que o coração reperfundido é reaquecido e todos os parâmetros da função cardíaca são reduzidas em pontos de tempo iniciais com um ritmo cardíaco...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cardioplegia Solution (St Thomas II)			Symbol / Concentrations (mM)
Sodium Chloride			NaCl; 110
Potassium chloride			KCl; 16
Calcium Chloride			CaCL2; 1.5
Magnesium Chloride			MgCL2; 16
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 10
Krebs-Heinslet Buffer
Sodium Chloride			NaCl; 118
Potassium Chloride			KCl; 4.8
Magnesium Sulfate			MgSO4; 1.7
Sodium Bicarbonate			NaHCO3; 24.9
Potassium Phosphate (monobasic)			KH2PO4; 1.2
Calcium Chloride			CaCL2; 1.4
Sodium Pyruvate			Na pyruvate; 2
Glucose			C6H12O6; 6
Balloon reagents
Corn Syrup
Spaghetti
Silicon Dispersion Gel
styrofoam block
lab oven/incubator ( 50C)
Langendorff Perfusion equipment
Isolated perfused heart sytem (IH-SR (Hugo-Sachs) or equivalent)
Data acquisition system (DSI, ADinstruments or equivalent)
Heated water circulator
Cooling water circulator
Perfusion pump capable of 2-30 ml/min
Inline perfusion filters - 1 um glass fiber
Pressure sensors and amplifiers for LVP and perfusion pressure
Small graduated cylinder (~10 mL)
Small temperature probe and thermometer (Werner or equivalent)
perfusion resevoir (1L)
cardioplegia resevoir (~200 mL)
gas bubbler
95/5 O2/CO2 mix
Surgical tools and reagents
Metzenbaum and Potz surgical scissors
two Dumont size 5 forceps
ketamine
xylazine
heparin
small clamp with soft sides to hold aorta (i.e. terminal clamp with taped ends)
Silk 2-0 and 4-0 sutures