A utilização de uma alta taxa de transferência<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluidic Sistema de Desenvolvimento Oral Biofilms Multi-espécies

Resumo

O objectivo deste trabalho é métodos para descrever o uso de um sistema de microfluidos para o desenvolvimento de biofilmes multi-espécies que contêm espécies normalmente identificados na placa dental supragengival humano. Métodos para descrever arquitetura biofilme, a viabilidade de biofilme, e uma abordagem para a colheita de biofilme para análises dependentes de cultura ou independentes de cultivo são realçados.

Resumo

Há poucos de alto rendimento em sistemas in vitro que facilitam o desenvolvimento de biofilme multi-espécies que contêm numerosas espécies comumente detectados dentro in vivo biofilmes orais. Além disso, um sistema que utiliza a saliva humana natural como fonte de nutrientes, em vez de meios artificiais, é particularmente desejável de modo a suportar a expressão de propriedades celulares e específicos de biofilme que imitam as comunidades in vivo. Descreve-se um método para o desenvolvimento de multi-espécies biofilmes orais que são comparáveis, no que diz respeito à composição das espécies, a placa dental supragengival, sob condições semelhantes para a cavidade oral humana. Especificamente, este artigo descreve métodos como um sistema de microfluidos disponível comercialmente pode ser adaptada para facilitar o desenvolvimento de múltiplas espécies biofilmes orais derivadas e cultivadas dentro de saliva reunidas. Por outro lado, uma descrição de como o sistema pode ser utilizado em conjunto com um confocal microscópio de varredura a laser para gerar 3-D reconstruções biofilme para análises de arquitectura e de viabilidade será apresentado. Dada a grande diversidade de microrganismos que crescem dentro de biofilmes no sistema microfluídico (incluindo Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella e Porphyromonas), um protocolo também será apresentado descrevendo como a colheita das células do biofilme para posterior subcultura ou extração de DNA e análise. Os limites tanto do sistema de biofilme microfluídicos e as análises de dados state-of-the-art atuais serão abordados. Em última análise, é previsto que este artigo irá fornecer uma linha de base técnica que vai melhorar o estudo de biofilmes orais e auxiliar no desenvolvimento de tecnologias adicionais que podem ser integrados com a plataforma de microfluidos.

Introdução

Os biofilmes são arquitetonicamente complexas comunidades de bactérias que são agregados em superfícies ^1. Estas comunidades geralmente contêm numerosas espécies que interagem uns com os outros dentro do biofilme ^2. Biofilmes orais, o mais visualmente notável sendo a placa bacteriana, são um problema persistente em seres humanos e os seus resultados para o desenvolvimento incontrolado de geração de taxonomicamente diversas comunidades multi-espécies ^3. As bactérias que compõem essas diversas comunidades pode ser de até 1.000 vezes mais resistentes aos antimicrobianos do que os seus (planctônicas) vias de livre flutuação ^4-6. A falta de tratamento destas comunidades do biofilme dental, que podem causar cárie dentária e doença periodontal, resultou em um encargo significativo de saúde pública: mais de 500 milhões de visitas ao consultório de dentista por ano em os EUA, e uma cerca de 108.000 milhões dólares para tratar ou prevenir periodontal doença cárie dentária e ^7.

content ">" Enquanto muitos microbiologistas defender o estudo do comportamento microbiano em condições naturais, alguns deles fazê-lo. Isto porque a sua moral para superar as dificuldades é constantemente solapada pela facilidade atraente de trabalhar com culturas de laboratório. "-Smith ^8.

Actualmente, a investigação biofilme bucal é realizada usando uma variedade de in vivo e in vitro abordagens, cada uma com suas próprias vantagens e desvantagens ^9,10. In vitro abordagens costumam usar sistemas de biofilme modelo que são relativamente fáceis de configurar, mas podem faltar clínico / relevância no mundo real ^10,11. In vivo abordagens normalmente dependem de sistemas de modelos animais que podem reproduzir certos aspectos do ambiente oral humana, mas novamente sofrem de limitações devido a diferenças na anatomia, fisiologia, microbiologia e imunologia entre animais e humanos ^{12, 13.} Deve notar-se que os biofilmes oraistambém podem ser desenvolvidos em superfícies de esmalte, realizada em um stent dentro da boca dos voluntários humanos, mas esta abordagem é actualmente relativamente caro e ^14,15 de trabalho intensivo. Em última análise, novos agentes e tecnologias para melhorar a saúde bucal são testados em seres humanos em condições de ensaios clínicos controlados ^11. No momento, um modus operandi muito usada para identificar e avaliar novos agentes de saúde bucal é a primeira a realizar estudos de laboratório para discernir eficácia potencial, e, em seguida, realizar estudos com animais e os "testes de campo" que empregam os clínicos para avaliar o sucesso da tecnologia ^{9, 16,17.} Infelizmente, os estudos de laboratório tendem a confiar em sistemas modelo que ocupam uma grande pegada, são tecnologicamente difícil de usar, e muitas vezes contêm comunidades de um ou, no máximo, algumas espécies simplificado para derivar potencial do mundo real que significa ^10,18. Dado que o biofilme da placa dental conter várias espécies e em forma de quex fluir meio salivar, o desenvolvimento de biofilmes que contêm uma ou algumas espécies em é pouco provável para gerar comunidades que se comportam de um modo semelhante às de um cenário real ^10,19 meios artificiais. Para lidar com o tempo, custo, requisitos de formação, bem como a natureza representativa pobre de sistemas de biofilme modelo de laboratório em comparação com o ambiente do mundo real, que recentemente desenvolveu uma alta taxa de transferência e sistema de biofilme ambientalmente germane ²⁰ (Figura 1). Os benefícios do sistema a partir da utilização de livre de células saliva humana em pool (CFS) como meio e não tratada reunidas saliva contendo célula bacteriana humana (CCS) como inóculo. Excepcionalmente, o sistema também combina a tecnologia microfluídica, um microscópio confocal de varrimento laser e tecnologia de análise de diversidade bacteriana independente de cultura. Assim, o sistema de modelo é ambientalmente pertinente (usando saliva como um inoculo para crescer biofilmes multi-espécies a 37 ° C em esterilizada por filtração de fluxosaliva) e os biofilmes orais contêm espécies (incluindo Streptococcus, Neisseria, Veillonella, e espécies de Porphyromonas) em abundâncias representativos dos encontrados no início de placa supragengival ^20.

Ao considerar que este trabalho descreve o uso do sistema de modelo recém-desenvolvido, deve ser dada especial atenção à fusão de um microfluidics microscopia confocal a laser (CLSM) e tecnologias de análise de diversidade independentes de cultivo. A união destas tecnologias por nosso grupo de pesquisa foi intencional e não só acrescenta uma capacidade de alto rendimento para o sistema modelo recém-desenvolvido, mas também permite perguntas a serem feitas que não poderia ser facilmente tratadas antes com outros sistemas. Em primeiro lugar, CLSM tem vantagens distintas em relação microscopia tradicional, uma vez que permite a análise tridimensional de biofilmes. Muitas vezes desvalorizado, isso é extremamente importante como biofilmes são sagacidade heterogêneoh relação à composição de espécies e posição espacial, bem como as condições fisiológicas sendo impostas em diferentes localizações espaciais dentro do biofilme ^6,21. Em conjunto com software tridimensional de renderização e software de análise de imagem, a arquitetura do biofilme, as relações espaciais entre as espécies que o compõem, e extensão da morte antimicrobiana pode ser analisado ^22-24. Tais habilidades não são possíveis com o padrão de luz transmitida ou microscopia de epifluorescência. Em seguida, a microfluídica já recebeu atenção especial no campo da microbiologia, pois permite o estudo de biofilmes sob condições cuidadosamente controladas (vazão, temperatura, pH, etc.) e requer apenas pequenos volumes de líquido ^25-27. Como ponto de comparação, crescimento de um biofilme oral na saliva humana dentro de um sistema modelo de célula de fluxo (um sistema que é considerado sem dúvida o modelo de esteio para muitos estudos do biofilme dental) por 20 horas a uma velocidade de fluxo semelhante e ao cisalhamento, em que alcançouem um sistema de microfluidos requer pelo menos 200 ml, em oposição aos 800 ul no dispositivo de microfluidos ^28-31. Assim, um modelo de sistema de microfluidos biofilme permite o estudo de materiais limitam-lote sob condições definidas. Finalmente, a tecnologia pyrosequencing foi otimizado na última década para exigir que apenas pequenas quantidades de material para realizar uma análise da comunidade e é suficientemente versátil para controlar a profundidade de sequenciamento para obter a identidade das espécies biofilme ainda raras. O uso desta tecnologia, tais como bactérias codificado-tag FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP), permitiu perguntas pertinentes sobre a ecologia de biofilmes de ser abordada ^32,33. Tais questões imbuído dificuldades no passado, quando pyrosequencing não estava disponível por causa do tempo e os custos necessários para criar bibliotecas de plasmídeos e as etapas tecnológicas e analíticas complexas necessárias para obter dados ^33,34. É claro que uma grande vantagem com ap independente de culturaabordagens, tais como pyrosequencing, é que as espécies bacterianas que não podem ser cultivadas em isolamento dentro de meios convencionais de laboratório (espécies ou seja viáveis ​​mas não cultiváveis) podem ser cultivadas e identificado no sistema de modelo e a sua abundância relativa na comunidade quantificada ^{35, 36} . Para adicionar perspectiva, já em 1963, o atraso Sigmund Socransky estimou que aproximadamente 50% das bactérias no material isolado a partir do sulco gengival oral humana não poderia ser cultivadas utilizando condies de crescimento laboratoriais ^37.

O objetivo deste artigo é descrever métodos de abordagem para desenvolver biofilmes multi-espécies orais em um sistema microfluídico comercialmente disponível (BioFlux) em: (i) condições representante da cavidade oral humana e (ii) com uma composição e abundância das espécies que é comparável à placa supragengival. Além disso, usando tanto software freeware e comercial, destacamos biofilme como basemedidas de arquitetura pode ser derivada a partir de dados MCVL, com foco em abordagens para quantificar a biomassa do biofilme, aspereza, e viabilidade (com base em coloração Live / Morto). Finalmente, os passos necessários para a colheita de material para análise da diversidade de biofilme por bTEFAP são descritos.

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Protocolo

O protocolo de coleta de saliva aqui descrito foi revisado pela Universidade de Michigan Institutional Review Board for Subject Pesquisa com Seres Humanos.
NOTA: No que diz respeito a avaliações institucionais de trabalho sujeito humano deste tipo, acordos prévios e permissões devem ser obtida a partir da instituição de acolhimento. Em particular, dependendo da instituição, IRB ou aprovação ética pode ter de ser procurado e aprovado antes da coleta de saliva de voluntários humanos pode prosseguir. Como auxílio para a elaboração de um aplicativo, um algoritmo útil NIH / gráfico pode ser encontrada aqui: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf

1. Preparação de Saliva em pool para uso como meio de crescimento ambientalmente Germano

1. Recrutar> 5 pessoas para a doação de saliva. Não tome qualquer informação de identificação, garantir que não haja individuals vai doar saliva se eles estão doentes, ou tiver tomado antibióticos orais nos últimos 3 meses, ou ter alimentos ou líquidos consumidos, com exceção da água, no 2 horas antes da doação anterior.
2. Recolha saliva em tubos de 50 ml de plástico. A piscina do saliva coletada em um copo de plástico, mantendo-o no gelo. Não utilizar vidro como polímeros da saliva vai aderir às superfícies internas de vidro.
3. Adicionar ditiotreitol (DTT) até uma concentração final de 2,5 mM a partir de um estoque de 100x. (Stock é congelado em uso único alíquotas a -20 ° C). Agita-se durante 10 min num copo de plástico em gelo.
4. A fim de remover as partículas, a centrifugação da saliva reunidas durante 30 min a 17.500 x g.
5. Dilui-se a saliva com 3 volumes de dH ₂ O para dar um quarto saliva concentrada.
6. Filtro-esterilizar saliva usando 0,22 polietersulfona (PES), filtro de baixa ligação protéica. Use filtro com grande área de superfície, ou usar vários filtros pequena área. Manter a saliva em umrecipiente de plástico sobre gelo e filtra.
7. Congelar a saliva reunidas a -80   ° C em tubos de plástico de 50 ml até ser necessário para crescer bactérias. Cada tubo de plástico é apenas para uma utilização e não deve conter mais de 35 ml, em cada poço de microfluidos pode conter um máximo de 1,2 ml (1,2 ml x 24 poços = 28,8 ml) e de espaço é necessário em cada tubo como saliva expande durante o congelamento.
8. Para utilização, descongelar a saliva reunidas à temperatura ambiente. Uma vez descongelado, filtro de esterilizar mais uma vez (0,22 poliétersulfona, filtro de baixa ligação protéica para remover quaisquer precipitados).

2. Preparação de Saliva em pool para uso como inoculo

1. Recrutar> 5 pessoas para a doação de saliva. Não tome qualquer informação de identificação, garantir que não haja indivíduos vai doar saliva se eles estão doentes, tomaram antibióticos orais nos últimos 3 meses, ou ter alimentos ou líquidos consumidos, com exceção da água, no 2 horas antes da doação anterior. Recolha samples mais de 30 min.
2. Recolha de saliva em tubos de plástico de 50 ml à temperatura ambiente e partilhar a saliva recolhida num copo de plástico à temperatura ambiente.
3. Diluir saliva em pool com glicerol grau reagente geral autoclavada para produzir um estoque com uma relação final de 25% de glicerol, 75% contendo células saliva [CCS].
4. Congelar a saliva a -80 ° C em 3 ml de partes alíquotas de uso único até que seja necessário.
5. Quando necessário para inocular o sistema de microfluidos, aliquotas são descongeladas à temperatura ambiente e agitada suavemente num agitador durante 5 segundos antes de ser pipetado para o sistema de microfluidos, tal como descrito no passo 3 do protocolo, abaixo.

3. O crescimento de biofilmes orais Multi-espécies

1. Pré-tratamento de SFC
   1. Primeiro revestimento dos canais de microfluidos BioFlux com CFS. Adicione 100 ml de CFS para cada ponto de venda bem. Usando o software de controle BioFlux, selecione o fluxo de "manual" e definir a partir de canais tha "B1-B24"t são para ser usados.
   2. Em seguida, ajustado a 1,0 cisalhamento dine / cm e iniciar o fluxo durante 2 min à temperatura ambiente para assegurar uma distribuição homogénea dos CFS ao longo do canal. Verifique se há fluido em cada canal de entrada para verificar se CFS fluiu através de todos os canais de maneira uniforme.
   3. Incubar a placa à temperatura ambiente durante 20 min.
   4. Remover a solução / pré-tratamento CFS que permanece nas cavidades de saída e transferidos para os poços de entrada de ar. Este volume total de 100 uL irá servir para contrabalançar a pressão a ser aplicada para o inoculo da tomada bem.
2. Inoculação
   1. Para cada ponto de venda bem, adicione 100 ml de CCS inóculo. Colocar a placa de microfluidos na placa de calor (a temperatura para 37 ° C), seleccione o manual dentro do software de controlo, e definir o fluxo de saída a partir de poços para os poços de entrada (isto é, inverter) a 1,0 dine / cm² durante exactamente 6 seg.
   2. Incubar a placa de microfluidos a 37 ° C durante 40 min para permitirpara a adesão inicial e crescimento das bactérias no inoculo.
3. Crescimento Overnight
   1. Para os canais inoculadas a ser utilizado, aspirar o inoculo a partir de resíduos de cada um dos poços de saída. Adicionar-se para 1 ml de volume total de SFC em cada um dos poços de entrada de ar (pode ser feito em cima de CFS existente).
   2. Incubar a placa de microfluídica a 37 ° C, selecione manual e definir o programa a ser executado em 0,2 dine / cm² durante 20 horas.
4. Stain pré-lavagem
   1. Aspirar todo o fluido a partir dos poços de entrada e de saída e adicionar 100 ul de PBS (pH 7,4) a cada um dos poços de entrada de ar. Fluxo durante 20 minutos a 0,2 dine / cm².
5. Além mistura Stain
   1. Para a coloração viabilidade celular fazer 100 ml de mistura mancha para cada canal a ser manchada. Especificamente, adicionar 3 mL de SYTO 9 e 3 mL de iodeto de propídio por ml de PBS usando kit de coloração viabilidade celular comercial, como o Live / Dead. Isto gerauma mistura corante contendo 10 uM SYTO 9 e 60 de iodeto de propídio uM.
   2. Aspirar o PBS remanescente dos poços de entrada de ar e, em seguida, adicionar 100 uL da mistura de mancha de viabilidade celular para cada entrada bem. Definir a fluir a 0,2 dine / cm ² e executar a solução de entrada para a saída, durante 45 minutos à temperatura ambiente.
6. Lavagem pós-coloração
   1. Aspirar a mancha remanescente em cada um dos poços de entrada e adicionar 100 ul de PBS a cada poço de entrada. Definir a fluir a 0,2 dyne / cm e executar a solução de PBS de entrada para a saída, durante 20 min à temperatura ambiente para remover qualquer excesso de corante.

4. coleção de imagens, renderização 3D e Análise de Imagem

1. Use um microscópio confocal de varredura a laser invertido (CLSM) para coletar dados de imagem biofilme do sistema microfluídico. Certifique-se de que o CLSM é capaz de suportar o peso da placa BioFlux, que pode atingir 150 g.
   NOTA: Dada a dimensions dos canais microfluídicos, a necessidade de sensibilidade para discernir estrutura biofilme, e os requisitos para detectar o sinal de fluorescência de intensidade variável, encaixe a CLSM com uma NA lente objetiva ou um com qualidade similar óptico, ampliação e abertura numérica 40X 1,25.
2. Padronizar as portas de captura de emissões com ganho e compensados ​​medições sendo mantida constante. Certifique-se que a potência do laser não exceda 25%, pois isso pode resultar em foto-branqueamento.
3. Converta arquivos MCVL do L EICA I mago F tipo ile (LIF) para OME (O pen M icroscopy E nvironment) tipo de arquivo. Isto permite uma maior facilidade de acesso e a compatibilidade entre os programas de software. Use software disponível comercialmente, tais como, IMARIS para converter arquivos para este tipo.

Rendering 3D para Imagens / Figuras

4. Uma vez convertido para o formato OME, use um software disponível comercialmente como IMARIS para renderizar as imagensem 3D. Realize esta usando uma combinação de "Easy3D" e opções "Surpass".
   NOTA: Atenção ao sinal de fundo e de limiar deve ser feita. A função de histograma em IMARIS pode ser usado para obter o intervalo de recolha e este deve ser mantido constante entre as imagens a ser analisado.
5. Salve as imagens usando a função "snapshot" e fazer uma análise cuidadosa para resolução de imagem antes de salvar tipos de arquivos.
6. Montar imagens em figuras usando software de edição de imagem como o CorelDraw ou Adobe Illustrator.

Análise de Imagem 3D para Gráficos e Tabelas

7. Use livremente disponível ImageJ ²³ e COMSTAT / COMSTAT2 ³⁸ para análise de imagem. Faça o download dos pacotes a partir de http://rsb.info.nih.gov/ij/ e http://comstat.dk/, respectivamente. Já a mais recente atualização do Java instalado.
   NOTA: O JAVA plataforma de software terá de ser instalado prior para a utilização de software de análise de imagem.
   1. Use o software ImageJ com COMSTAT2 plugin para importar os arquivos de OME cada imagem biofilme no modo "hyperstack" e vista para com "canais de divisão".
   2. Individualmente analisar os dois canais (vermelho / propidium-iodeto / dead ser o canal 0, / ao vivo a ser canal verde / SYTO-9 1) utilizando a função "histograma" de ImageJ. Esta função lista o número total de pixels de arquivos de OME de 8 bits (indicados como "contagem") em cada intensidade de cor de 0 a 255 (mostrado como "valor"), sendo 0 pixels sem sinal (ao fundo) e estar 255 pixels com saturação de sinal completo.
   3. Exportar os dados para um programa de planilha e padronizar todos os valores de sinal pesando cada pixel pela intensidade do sinal correspondente. Isto é realizado através da multiplicação da contagem total para uma determinada intensidade de sinal do valor de 8 bits numérica (0-255) de que a intensidade do sinal.
   4. Some todos os valores ponderados, 0-255, para ambos os canais de cada imagem capturada para biofilme. Tirar a soma dos valores ponderados para ambos os canais para determinar o sinal total por cento a partir de qualquer canal. Faça isso para determinar a relação familiar ou por cento vermelho e cento sinal verde (ou seja, a percentagem de "morto" e por cento "ao vivo" para cada tratamento).
   5. Realizar análises estatísticas, por exemplo, utilizando de duas caudas T-Student modificado para variância desigual. Valores de p <0,05 são considerados significativos e os valores de p <0,01 são considerados altamente significativo.

5. As células colheita biofilme para Análise de Cultura-independente

1. Remover tudo saliva gasto e não utilizado de entrada e saída de poços. Lavar os poços com 1 ml de água destilada estéril, três vezes.
2. Adicionar 100 uL de água destilada esterilizada para os poços de entrada de ar e, utilizando a interface de controlo de software, a passarágua destilada estéril para a frente através dos canais em> 8,0 dine / ^cm2 (caudal> 745 mL / h, de cisalhamento de 800 ^seg-1) durante pelo menos 5 min. Repita no sentido inverso por pelo menos 5 minutos e, em seguida, repita o processo para a frente e para trás etapa de lavagem.
3. Verificar por luz ou por microscopia de epifluorescência (se as células foram coradas / marcado) para a remoção dos biofilmes profunda (Figura 2). Recolha a célula-suspensão de 100 ul e armazenar a -80 ° C para análise independente de cultura. A análise de custo-benefício da composição da comunidade pode ser alcançado através da utilização de bactérias codificado-tag FLX pyrosequencing amplicon (bTEFAP) utilizando a abordagem descrita em Nance et al ^20.

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Resultados

Rendering 3D de biofilmes

Os resultados representativos são apresentados na Figura 3. Uma ferramenta útil em software IMARIS é a opção de examinar cada fatia da pilha de biofilme recolhido e combiná-los para criar reconstruções tridimensionais. Além disso, os efeitos de sombras artificiais podem ser adicionados para ajudar visualmente interpretar as estruturas tridimensionais. Os biofilmes prestados pode ser orientado em qualquer direção ...

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Discussão

Este papel métodos destaca as etapas básicas necessárias para configurar e executar um sistema microfluídico de forma a permitir o desenvolvimento de biofilmes multi-espécies orais derivados da saliva humana reunidas e cultivadas em esterilizada por filtração de 25% reunidas saliva humana. Abordagens para a caracterização do biofilme são dadas, mas deve-se lembrar que essas abordagens descritas são modificáveis ​​e tecnologias adicionais, como, por exemplo, manchas ou rótulos podem ser introduzidas. Por...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible)	Thermoscientific	Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor	Thermoscientific	28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water	Thermo  Scientific Inc	23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile.	VWR	73520-986
Glycerol	Thermo Fisher Scientific Inc	NC0542269
BioFlux microfluidic system	Fluxion	Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate	Fluxion	910-0004
PBS (Gibco)	Thermo Fisher Scientific Inc	10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)	Invitrogen	L7012
Confocal Laser Scanning Microscope	Lecia	SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope	Multiple choices	Multiple choices
Pyrosequencing facilities	Multiple choices	Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution	Fisher Scientific	04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80 °C	Multiple choices	Multiple choices
Tips (20, 200, and 1,000 μl)	Multiple choices	Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 μl)	Multiple choices	Multiple choices
Software
Bioflux dedicated software	Bioflux
Imaris	Bitplane
Leica SPE	Leica
ImageJ	Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2	Freeware (http://www.comstat.dk/)