Contraste melhorado Ecografia de Avaliação da Medula Espinhal fluxo de sangue em Experimental lesão medular

Resumo

Contrast Enhanced Ultrasound imaging is a reliable in-vivo tool for quantifying spinal cord blood flow in an experimental rat spinal cord injury model. This paper contains a comprehensive protocol for application of this technique in association with a contusion model of thoracic spinal cord injury.

Resumo

Redução do fluxo de sangue da medula espinal (FSME) (isto é, isquemia) desempenha um papel-chave na lesão traumática da medula espinal (SCI) patofisiologia e é, portanto, um importante alvo para terapias neuroprotectores. Embora vários técnicas tenham sido descritas para avaliar FSME, todos eles têm limitações significativas. Para superar este último, propomos o uso de tempo real de imagens de contraste melhorado ultra-som (CEU). Aqui nós descrevemos a aplicação desta técnica em um modelo de rato de contusão SCI. Um cateter jugular é implantada em primeiro lugar para a injecção repetida do agente de contraste, uma solução de cloreto de sódio de hexafluoreto de enxofre microbolhas encapsuladas. A coluna é então estabilizada com um 3D-frame feito por encomenda e da medula espinhal dura mater é exposto por uma laminectomia em ThIX-ThXII. A sonda de ultra-sons é, então, posicionado no aspecto posterior da dura-máter (revestidas com gel de ultra-som). Para avaliar FSME linha de base, uma única injecção intravenosa (400 ul) de contrapartidaagente é aplicado r para gravar a sua passagem intacta através da microvasculatura da medula espinal. Um dispositivo de peso-gota é subsequentemente utilizado para gerar um modelo experimental reproduzível contusão da SCI. Agente de contraste é reinjetado 15 min após a lesão para avaliar as mudanças pós-SCI SCBF. CEU permite em tempo real e in vivo avaliação de alterações SCBF após uma lesão medular. No animal ileso, ultra-sonografia mostrou fluxo sanguíneo irregular ao longo da medula espinhal intacta. Além disso, 15 minutos após a SCI, houve isquemia crítica no nível do epicentro enquanto FSME ficaram preservados nas áreas mais remotas intacta. Nas regiões adjacentes do epicentro (ambos rostral e caudal), FSME foi significativamente reduzida. Isto corresponde à "zona de penumbra de isquemia" anteriormente descrito. Esta ferramenta é de grande interesse para a avaliação dos efeitos das terapias destinadas a limitar a isquemia e necrose do tecido resultante após a SCI.

Introdução

Lesão medular traumática (SCI) é uma condição devastadora levando a prejuízo significativo no motor, sensorial e funções autônomas. Até à data, nenhum tratamento tem demonstrado a sua eficácia em pacientes. Por tal razão, é importante para identificar novas técnicas que irão melhorar a avaliação dos tratamentos potenciais e pode elucidar melhor lesão pathiophysiology ^1.

SCI é dividido em duas fases sequenciais, como a que se refere a lesões primárias e secundárias. A lesão primária corresponde ao insulto mecânica inicial. Considerando que os grupos de lesões secundárias uma cascata de vários eventos biológicos (como a inflamação, o estresse oxidativo e hipóxia), que contribuem ainda mais para a expansão progressiva da lesão inicial, dano tecidual e, portanto, neurológica ^2,3 déficit.

Na fase aguda da SCI, terapias neuroprotetoras visam reduzir a patologia lesão secundária e should melhorar a conformidade resultados neurológicos. Entre os muitos eventos de lesões secundárias, isquemia desempenha um papel ^4,5 crucial. Ao nível do epicentro SCI, os microvasos parênquima danificadas impedir o fluxo de sangue da medula espinhal eficaz (SCBF). Além disso, FSME também é significativamente reduzida na região em torno do epicentro lesão, uma área especificamente conhecido como a "zona de penumbra de isquemia". Se FSME não pode ser rapidamente restabelecida dentro destas regiões, a isquemia pode levar a necrose do parênquima complementar e danos no tecido nervoso adicional. Como até mesmo a preservação de tecido mais leve pode ter efeitos substanciais de função, é de grande interesse para desenvolver medicamentos e terapias que podem reduzir isquemia pós-SCI. Para realçar este fenómeno, o trabalho anterior mostrou que a preservação de apenas 10% dos axônios mielinizados foi suficiente para permitir a pé em gatos pós-SCI ^6.

Embora vários técnicas tenham sido descritas para avaliar FSME, oy todos têm limitações significativas. Por exemplo, o uso de microesferas radioactivas ^7,8 e C14-iodopyrine autorradiografia ⁹ requer subsequente sacrifício dos animais e não pode ser repetido em pontos temporais posteriores. A técnica de depuração de hidrogénio ¹⁰ depende da inserção de eléctrodos intraspinal, que pode danificar ainda mais a medula espinhal. Enquanto Doppler a laser, fotopletismografia ^14,15 e in vivo microscopia ^de luz ¹⁶ tem uma profundidade muito limitada / área de medição ^11-13.

A nossa equipa foi anteriormente mostrado que o contraste de ultra-sons melhorada (CEU) de imagem pode ser usada para avaliar o tempo real e in vivo as alterações FSME no parênquima medula espinal de rato ^17. É importante notar que uma técnica semelhante foi aplicada por Huang et al., Em um modelo suíno de SCI ^18. CEU aplica um modo específico de imagens ultra-sónicas que permite associar tons de cinza im morfológicaidade (obtidos pelo modo B convencional) com a distribuição espacial do fluxo sanguíneo ^19. A imagem SCBF e quantificação baseia-se na injecção intravascular de agentes de eco-contraste. O agente de contraste é composta por microbolhas de hexafluoreto de enxofre (diâmetro de cerca de 2,5 significa um e 90% têm um diâmetro inferior a 6 mm) estabilizada por fosfolípidos. As microbolhas de reflectir o feixe de ultra-som emitido pela sonda aumentando assim a ecogenicidade sangue e aumentar o contraste dos tecidos de acordo com o seu fluxo sanguíneo. Por conseguinte, é possível avaliar a fluxo de sangue de uma dada região de interesse de acordo com a intensidade do sinal reflectido. As microbolhas são também seguras e que têm sido clinicamente aplicada em seres humanos. O hexafluoreto de enxofre é rapidamente apagada (tempo de semi-vida terminal é de 12 min) e mais do que 80% do hexafluoreto de enxofre administrada é recuperada no ar exalado dentro de 2 minutos após a injecção. Este protocolo fornece uma maneira simples de usar CEU imenvelhecimento para avaliar as mudanças SCBF em ratos.

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Protocolo

NOTA: Os métodos descritos neste manuscrito foram aprovados pelo comitê de bioética da Faculdade de Medicina Lariboisière, Paris, França (CEEALV / 2011-08-01).

1. Instrumento Preparação

1. Prepare e limpe os seguintes instrumentos para a inserção do cateter: micro-fórceps, tesouras, micro-micro-vascular braçadeira, grandes tesouras, linha cirúrgica (Black trançado de seda 4-0) e um cateter 14 G. Heparinizar o cateter com uma solução de heparina (5000 U / mL).
2. Prepare e limpe os seguintes instrumentos para a laminectomia: grandes tesoura, bisturi e um cortador de osso. Realizar laminectomia com um cortador de osso feito por encomenda concebida para reduzir o risco de prejudicar a medula espinhal durante a laminectomia (Figura 1).
3. Definir-se-a-quadro 3D utilizado para o posicionamento e estabilização do animal. A custom-made quadro é construído com os elementos de um fixador externo Hoffman 3 em associação com fórceps, which ter sido curvada, a fim de se ajustar à coluna lombar do animal.
4. Prepare o dispositivo de peso-drop (pêndulo) utilizado para lesão medular biomecânico.
   NOTA: O dispositivo impactação feito sob medida foi projetado com um software 3D e impresso em 3D.
5. Ligue a máquina de ultra-som.
6. Prepara-se o conjunto para a reconstituição de agente de contraste.
   NOTA: O kit inclui um frasco contendo 25 mg de pó liofilizado, uma seringa pré-cheia que contém 5 ml de cloreto de sódio e um sistema de transferência de mini-pico (Figura 2). Os passos para a reconstituição do agente de contraste estão detalhadas abaixo (na seção 5).

2. Jugular Vein cateterismo (Figura 3)

1. Anestesiar os animais com 4% de isoflurano. Colocar o animal em decúbito dorsal. Confirme anestesia adequada, garantindo que o animal não responder quando as patas são comprimidos com uma pinça. Aplicar veterinário pomada nos olhos para evitar o ressecamento enquanto undanestesia er.
2. Raspar a garganta e limpar a pele. Realizar uma incisão na linha média do pescoço. Retrair o músculo sternocleidomastoidian a fim de encontrar a veia jugular interna. Aperte uma ligadura na parte rostral da veia.
3. Aplicar um grampo microvascular na veia, 1 cm abaixo da ligadura. Passe outra linha em torno da veia, logo abaixo da braçadeira com o nó pronto para ser apertar quando a braçadeira é libertado.
4. Abra a parede da veia (venotomia) entre o grampo ea ligadura rostral. Introduzir um cateter de 14 G no lúmen da veia e empurrá-lo para o coração.
5. Quando se trata-se contra o grampo, solte o último e empurrar o cateter ainda mais. Fixar o cateter na veia, por firmemente apertar o nó na veia com o cateter para dentro.
6. Avaliar a permeabilidade do cateter através da retirada de uma pequena quantidade de sangue venoso no cateter e, subsequentemente, em seguida, lavando-o com solução salina heparinizada. Isto impede a obstrução do catheter por um coágulo de sangue potencial.
7. Conecte tubagem flexível ao cateter para posterior injeção de agente de contraste (microbolhas). Mantenha-o fechado (selado) até que esteja pronto para uso.

3. Acesso a Espinha, laminectomia e Rat Posicionamento (no-frame 3D)

1. Colocar o animal numa posição horizontal plana propenso. Raspar e limpar a parte de trás (região torácica) do animal.
2. Identificar a última costela (o XIII no rato) por palpação (Figura 4). Isto permite estimar a localização da vértebra torácica XIII (ThXIII).
3. Faça uma incisão na pele 4 centímetros na linha média, centrado em ThXIII. Abra a incisão na pele, bem como a bursa subjacente. Observe a aponeurose dos músculos das costas, bem como as pontas dos processos da coluna vertebral.
4. Localizar cuidadosamente o processo de espinha de ThXIII pela palpação as costelas XIII.
   NOTA: A costela XIII está ligado a ThXIII e, portanto, representa um fácil de locate marco anatômico para a identificação de ThXIII. Este passo permite que a localização da ThXII para ThIX processo espinal, bem como L1 e L2 (primeira e segunda vértebras lombares).
5. Corte a aponeurose muscular e separar os músculos de cada lado para expor os processos espinhosos, as lâminas e as articulações de ThIX para L2. Expor os aspectos laterais dos L1 e L2, desprendendo músculos dos processos transversais.
6. Gancho dentes incisivos do animal sobre a armação-3D para fixar a posição (Figura 5). Aperte as vértebras L1 e L2 com a pinça modificados. Ligue o fórceps modificados para o quadro-3D, a fim de estabilizar o animal.
7. Puxe delicadamente caudal a pinça segurando a coluna lombar, a fim de apertar toda a coluna vertebral e para elevar o tórax do banco.
   NOTA: Com a disposição descrita o animal deve ser capaz de respirar. Além disso, apesar dos movimentos respiratórios da caixa torácica, a coluna vertebral e da medulacabo também deve permanecer imóvel.
8. Remover o processess espinhoso de ThIX para ThXII. Insira cuidadosamente a lâmina inferior do cortador de osso abaixo da lâmina esquerda de ThXII e feche o cortador de osso, a fim de cortar a lâmina (Figura 6).
9. Repita a mesma manobra para a lâmina direita e remova sucessivamente o arco posterior. Repetir os passos anteriores para o ThXI vértebra a ThIX, a fim de alcançar uma laminectomia de quatro níveis. Retire as duas articulações para cada vértebra.
   NOTA: Durante o procedimento, limpe o campo operatório de sangramento local. Para isso, use cotonetes e irrigação com soro fisiológico morno. Hemostasia ocorre sistematicamente em poucos minutos.

4. Posicionamento CEU Probe

1. Cubra a dura-máter com gel de ultra-som. Isto permite que a transmissão efectiva das ondas de ultra-som entre a sonda e a medula espinal (Figura 7).
2. Estabilizar a sonda de ultra-som sagacidadebraçadeira ha que podem ser posteriormente conectado à-frame 3D por um braço articulado. Posicionar manualmente a sonda. Certifique-se de que a sonda está orientada para obter uma fatia sagital longitudinal oblíqua. Numa posição correcta, a espinal medula é estritamente horizontal sobre a imagem e o canal central da medula espinal é visível ao longo do segmento completo da medula espinal.
   NOTA: Posicionamento deve ser guiado pela imagem em modo B em tempo real exibida na tela da máquina de ultra-sons. A distância focal da sonda de ultra-som deve ser alinhado com o canal central da medula espinhal. Neste momento, o aspecto posterior da medula espinal é acessível que acabará por permitir o posicionamento do pêndulo.
3. Quando ideal, bloquear o braço articulado para estabilizar a posição.

5. Preparação de Agente de Contraste - Reconstituição de microbolhas

1. Usando o conteúdo de um kit comercial e reconstituição ligar a haste do êmbolo, apertando-o tightly para a seringa (no sentido horário). Abra a ampola do sistema de transferência e retire a tampa da seringa. Abra a tampa do sistema de transferência e introduza a seringa no sistema de transferência (apertar com força).
2. Remover o disco de protecção do frasco. Deslize o frasco na folha transparente do
3. sistema de transferência e pressione firmemente para assentar o frasco no lugar.
4. Esvaziar o conteúdo da seringa no frasco, empurrando a haste do êmbolo. Agita-se vigorosamente durante 20 segundos para misturar todos os conteúdos do frasco para se obter um líquido homogéneo branco leitoso.
5. Inverter o sistema e retirar cuidadosamente o agente de contraste para dentro da seringa. Retire a seringa do sistema de transferência. Após reconstituição (conforme indicado), 1 ml da dispersão resultante contém 8 ul hexafluoreto de enxofre nas microbolhas. Desenhar a suspensão de micro-vesículas com uma seringa de 100 ml. Inserir a seringa de 100 ml para a bomba elétrica. Fechar a tampa.
6. Iniciar agitação constante da remicrobolhas constituído. Obteve-se a agitação constante por rotação lenta da seringa, o que mantém a suspensão de microbolhas. Ligar a bomba para o cateter jugular através da tubagem flexível. Configure o aparelho de ultra-som para o "Modo Harmonic".
   NOTA: esta última corresponde ao modo no qual as microbolhas pode ser especificamente detectada e visualizado. Este modo tem um baixo índice mecânico, que não destrói as microbolhas, em oposição ao modo-B.
7. Purga-se o cateter através da infusão de uma primeira dose (400 ul) de agente de contraste. Durante esta primeira infusão, verifique se as microbolhas que aparecem na tela do ultra-som. Isto confirma que todo o circuito (a partir da seringa para a corrente sanguínea da ratazana) está intacto e aberta.
8. Configure o aparelho de ultra-som para "B-mode" para visualizar o parênquima da medula espinhal ea destruição dos poucos remanescentes microbolhas na corrente sanguínea. A alta freqüência da "B-Mode" tranalta energia smits às microbolhas, o que lhes permite avaria.
9. Deixe o animal ficou imóvel por aproximadamente 30 min. Este período permite a estabilização dos parâmetros hemodinâmicos.

6. Avaliação de SCBF na Medula Espinhal Intact

1. Configure o aparelho de ultra-som para o "Modo Harmonic". Iniciar em simultâneo (1) a infusão de agente de contraste (400 ul) e (2) o cronometro.
   Nota: Durante a infusão, a concentração de microbolhas na corrente sanguínea deve aumentar, permitindo que a imaginação contraste da medula espinhal (Figura 8). Uma vez que as microbolhas são rapidamente destruídas, a concentração sanguínea de microbolhas começa a diminuir uma vez que a injecção está terminada, que gera uma diminuição progressiva na visualização contraste da medula espinal.
2. Após 1 min, selecione (imprensa) o botão "Clip Store" na máquina de ultra-som. Isto irá permitir um para salvar 1 min de raw dados ultra-som eo vídeo de imagem de gravação (que foi anteriormente exibida na tela do ultra-som).
3. Configure o aparelho de ultra-som para "B-Mode". Isto irá eliminar as microbolhas restantes.

7. Experimental SCI

1. Usando o micromanipulador ligado ao quadro-3D, posicionar o dispositivo de compactação de peso-gota, de modo que a ponta do pêndulo entra em contacto com a dura-máter (na linha mediana da medula espinal), na junção entre ThX e ThXI (Figura 9) .
   NOTA: Este nível deve corresponder ao meio do segmento de medula espinal observada com o dispositivo de ultra-som. O atacante eo corpo do pêndulo são de 8 mm de diâmetro. A ponta do pêndulo, o que irá gerar o prejuízo, é de 3 mm de diâmetro.
2. Inserir o percutor do dispositivo de compactação em uma posição de 10 cm de altura. Induzir a SCI experimental, liberando o atacante do dispositivo impactação. O atacante cai e libera the pêndulo, ferindo a medula espinhal. A impacção feito à medida proporciona um impacto equivalente a um peso de 10 g deixado cair de uma altura de 10 cm.

8. Avaliação dos SCBF 5 min pós-SCI

1. Repita os passos descritos no capítulo 6 (Avaliação da SCBF). As microbolhas não será capaz de passar através da microvasculatura danificado e o epicentro lesão permanecerá escuro (Figura 10).

9. Sacrifício de Animais

1. Eutanásia dos animais com a injecção letal intra-peritoneal de pentobarbital (100 mg).

10. Quantificação de SCBF pela análise off-line

1. Comece o Software Ultra-Estender utilizado para a quantificação (na máquina de ultra-som). Selecione "Arquivo" e selecione os dados brutos salvas anteriormente e abrir os arquivos associados. Ativar o "modo de quantificação", premindo o botão "Chi Q" (selecção). Select "Set ROI" (botão) e escolher a forma circular.
2. Selecione "Desenhar ROI" (botão) e desenhe sete regiões circulares adjacentes de interesse (ROI) sobre a medula espinhal (Figura 11). Abra o menu "Ajuste" e escolha a função "valor da curva". Observar o software visualizadas várias curvas, cada um correspondendo a mudanças de concentração de microbolhas dentro de uma ROI.
   NOTA: Cada curva tem um perfil "perfusão-deperfusion". A primeira fase da curva é plana e corresponda ao período anterior à chegada de microbolhas. Na segunda fase, a concentração de microbolhas aumenta rapidamente, como resultado da infusão. Na terceira fase, a qual começa quando a infusão está completa, a concentração de microbolhas diminui progressivamente à medida que disintegratse na corrente sanguínea.
3. Coloque a primeira linha vertical no início da segunda fase da curve e selecione "SET". Isso informa ao software onde começar a análise.
4. Coloque a segunda linha vertical no final da gravação e mais uma vez seleccionar "set". Isso informa ao software onde parar análise.
5. Olhe para o menu "Cv" e gravar o valor "AUC", que corresponde à "Área Sob a Curva", analisou. Este valor é proporcional à FSME dentro da ROI correspondente.

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Resultados

Com o protocolo descrito acima, é possível mapear o FSME ao longo de um segmento de coluna vertebral sagital longitudinal.

Na medula espinal intacta, parece haver irregularidades FSME dentro do parênquima (Figura 12). Isto pode ser explicado pela distribuição variável de artérias radiculo-medular (RMA) a partir de um animal para outro. RMA refere-se a segmentar artérias que atingem a artéria espinal anterior (ASA) e, portanto, fornecer o fornecimento de sangue para ...

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Discussão

Embora tenhamos descrito como usar CEU em um modelo de contusão SCI rato, este protocolo pode ser modificado para atender outros objetivos experimentais ou modelos SCI. Optamos por medir SCBF em apenas dois momentos (antes da lesão e 15 min pós-SCI), no entanto o número de pontos de tempo eo atraso entre as medidas SCBF pode ser adaptado para atender as necessidades de outros estudos. Por exemplo, no nosso trabalho anterior ^17, que mediram FSME em cinco pontos de tempo sucessivos durante a primeira hora d...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
External Fixator Hoffman 3	Stryker, Kalamazoo, USA		Modular system used to build the custom made 3D frame and the jointed arm holding the ultrasound probe
Toshiba Applio	Toshiba, Tokyo, Japan		Ultrasound machine
Sonovue	Bracco, Milan, Italy		Contrast agent : microbubbles
Vueject pump	Bracco, Milan, Italy		Electric pump for infusion of microbubbles bolus
Aquasonic Ultrasound Gel	Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA		Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves
Isovet	Piramal Healthcare, Mumbai, India		Isoflurane used for anesthesia
Ultra Extend	Toshiba, Tokyo, Japan		Software used for quantification of spinal cord blood flow
Mastercraft Five-piece Mini-pliers Set, Product #58-4788-6	Canadian Tire, Toronto, Canada		Set of pliers for Do-it-yourself job