Produção Robotic da Cancer Cell Spheroids com um sistema aquoso bifásico para Drug Testing

Resumo

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Resumo

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

Introdução

Ensaios baseados em células fornecer uma ferramenta importante para o desenvolvimento e descoberta de novos fármacos anti-cancro. ^1,2 Historicamente, culturas em monocamada de células de cancro têm sido utilizados para investigar a eficácia dos compostos candidatos em relação a determinados tipos de células cancerosas. A facilidade de manutenção das culturas em monocamada em placas de cultura padrão, o grau de compatibilidade de placas padrão com ferramentas comerciais robóticos para a adição de reagentes, e com equipamentos de controlo para análise de respostas celulares a jusante para os compostos químicos são os principais benefícios que tornam culturas 2D uma ferramenta atraente para testes de drogas ^3. Infelizmente, os ensaios em monocamada de células muitas vezes não conseguem prever a eficácia de compostos in vivo, tornando o desenvolvimento de drogas e descoberta de um processo extremamente caro. ^4,5 Apesar de investimento e esforço significativo por empresas farmacêuticas e unidades acadêmicas, apenas cerca de 1% de anti-câncer drogas em ensaios clínicos foram aprovadospelo FDA nos últimos duas décadas. ⁶ Disparidade entre as culturas em 2D e 3D ambiente complexo de células cancerosas in vivo é uma grande falha dos sistemas de cultura em monocamada. ⁷ Portanto, a triagem de compostos candidatos contra células tumorais em um cenário que mais se assemelha o ambiente tumor 3D pode acelerar o desenvolvimento de novas drogas de quimioterapia. ⁸

Esferóides de células de cancro apresentar um modelo de tumor in vitro 3D relevante. ^9,10 esferóides compactos são aglomerados que se formam através da montagem espontânea ou induzida de células cancerosas em superfícies não-aderentes ou em suspensão, utilizando técnicas tais como balão giratório, sobreposição de líquido, microbiologia microfabricado . bem arrays, microfluídica, e gotas de suspensão ^11-16 Spheroids imitar características-chave de tumores sólidos, incluindo geometria e limitado de transporte de oxigênio, nutrientes e compostos de drogas na zona central; Assim, eles se regenerar mais de perto respon drogase de tumores sólidos, em comparação com as culturas de monocamada ^17-19 Apesar deste benefício marcado., esferóides não são rotineiramente utilizados para o rastreio de compostos químicos contra as células cancerosas. Dificuldade de produzir esferóides tamanho uniforme em um cenário de alta taxa de transferência padrão que é compatível com a robótica comercialmente disponíveis e ferramentas de triagem / imagem impede a incorporação da cultura esferóide em pipeline de desenvolvimento de medicamentos. Embora os materiais e placas personalizadas tornaram-se recentemente disponível no mercado para atender a essa necessidade, considerações de custo dissuadir a sua utilização generalizada.

Duas importantes técnicas com a capacidade de produzir esferóides porte consistentes em alto rendimento utilizar uma nova plataforma de gota suspensa e micro-poços microfabricados ^13,16,20. No entanto, ambas as abordagens requerem placas e dispositivos que são caros para fabricar e inconveniente para os usuários de endpoint especiais em centros de pesquisa do núcleo e indústrias farmacêuticas, onde o mais importante de effortes para a descoberta de novas drogas anti-cancerosas são feitos. Apesar de algumas melhorias na estabilidade de gotas contendo células com um projeto recente de pendurar placas de queda, apenas um ou outro buraco da placa ainda é usado durante a cultura para evitar a propagação / fusão de gotas. ¹⁶ Isto diminui significativamente o rendimento experimental. Adição da droga e de renovação é difícil com o manual ou pipetagem robotizada esferóides e precisam de ser transferidos para uma placa padrão para a análise bioquímica porque esta configuração placa não é facilmente compatível com o equipamento de rastreio convencionais, tais como leitores de placas. ²¹ As micro-poços fabricados utilizando litografia macia também permitir tamanho controlado produção esferóide. ^13,20 No entanto, a incompatibilidade desta plataforma com ferramentas de pipetagem padrão impede o tratamento de esferóides individuais com diferentes compostos de drogas / concentrações, expondo todos os esferóides a uma condição de tratamento individual. Assim, este método não é apropriado para elevadorastreio de compostos caudal que requer o teste simultâneo de vários compostos / concentrações.

Para superar estes obstáculos, uma nova técnica de alto rendimento de produção de esferóides de células de cancro tamanho consistente em placas de 96 poços padrão foi desenvolvido. ^22,23 A abordagem baseia-se num sistema de duas fases aquosa polimérica (SAB) com polietileno-glicol ( PEG) e dextrano (DEX) como polímeros de formação de fases. ²⁴ ATPSs foram recentemente utilizado em uma variedade de aplicações biológicas romance celulares que permitam micropatterning célula e entrega localizada de reagentes biológicos para as células em meios aquosos altamente ^25-32. Para formar uma esferóide, as células cancerosas são misturados com a fase aquosa DEX e uma gota de sub-microlitros da suspensão resultante é pipetada para dentro de uma solução aquosa de fase de PEG contendo a imersão bem. A queda continua a fase imiscível de imersão e confina células para facilitar a formação de um esferóide. Diabinhoortantly, a fase de imersão altamente aquoso fornece os nutrientes para as células do esferóide e minimiza o problema bem conhecido de evaporação meios comum para alguns outros ensaios que causa mudanças na osmolalidade meios e flutuações de concentrações de droga. Esta técnica permite a produção esferóide e tratamento de drogas só utilizando reagentes comercialmente disponíveis e as ferramentas de pipetagem em placas de 96 poços convencionais. É importante notar que a análise de respostas celulares de esferóides é realizada na mesma placa por meio de ensaios bioquímicos convencionais e leitores de placas. A facilidade de trabalhar com ATPS e adaptabilidade da abordagem para manipulação de líquidos robótico faz geração de alto rendimento de ambos mono-cultura e co-cultura esferóides uma técnica de laboratório simples. Esta nova abordagem será um grande passo à frente em direção à integração de esferóides de células cancerosas em processos de desenvolvimento de drogas e de descoberta com melhor rendimento testes e custo-efetividade (aumento do número de compostos testados e reduconsumo ced reagente) e eficiência (reduzindo mãos no tempo).

Um protocolo detalhado para produção robótico de esferóides de células de cancro em placas de 96 poços utilizando a abordagem APTS é descrito abaixo. Além disso, os detalhes do tratamento medicamentoso de esferóides resultantes e análise de respostas celulares a jusante utilizando um ensaio bioquímico comercial são apresentados.

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Protocolo

1. Preparação de polimérica aquosa sistema de duas fases (SADF)

1. Pesar 0,5 g de polietileno glicol (PEG) (PM: 35.000) e adicioná-lo a 9,5 ml de meio de crescimento completo numa cónico de 15 ml estéril para preparar 10 ml de 5% (w / v) de PEG fase aquosa.
   Nota: A adição de metade do meio com o primeiro cónica seguido pela adição do polímero e, em seguida, a quantidade remanescente de forma minimiza a adesão do polímero às paredes cónicas e ajuda o polímero dissolver-se mais rapidamente.
2. Pesar 0,128 g de dextrano (DEX) (MW: 500.000) e adicioná-lo a 0,872 ml de meio de crescimento completo num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril para preparar a 1 ml de 12.8% (w / v) de fase aquosa DEX.
3. Vortex tanto soluções durante cerca de 1 min para dissolver os polímeros na forma.
4. Mantenha as duas soluções num banho de água a 37 ° C durante 1 hora para assegurar a dissolução e misturas homogéneas. Manter as tampas acima do nível de água para evitar a possibilidade de contaminação das soluções do banhoágua.
5. Carregar a solução em uma fase de PEG estéril, uma seringa de plástico e passá-la através de um filtro de seringa de 0,2 um de tamanho dos poros para remover as impurezas.
   Nota: Encher a seringa com a solução de PEG, colocá-lo na inserção do filtro no topo de um tubo cónico e utilizar a força, empurrar lentamente a solução através do filtro. É normal a ocorrência de resistência contra o movimento do êmbolo da seringa. Menor perda da solução de polímero ocorre como parte da solução permanece no filtro, mas a concentração de polímero não irá mudar.
6. Pipetar 10 ml da solução da fase de DEX e dilui-lo em 10 ul de meio em um tubo separado para resultar em 6,4% (w / v) de fase DEX. Aspirar 100 ul da solução da fase de PEG e fornecê-las a uma placa de Petri.
   1. Dispensar a 0,5 ul de 6,4% (w / v) de fase DEX na solução de fase de PEG. Confirme visualmente formação ATPS sucesso observando uma queda DEX sob um microscópio. O limite gotadeve permanecer visível, indicando presença de duas fases aquosas estáveis, separados.
7. Guarde o estoque aquoso PEG e soluções fase DEX em 4 ° C até o uso.
   Nota: Recomenda-se que as soluções de polímeros são preparados fresco antes de cada experiência e utilizada dentro de 24 horas de armazenamento.

2. Preparação para a Impressão de Câncer Spheroids Celulares

1. Crescer as células cancerosas de interesse (por exemplo, células MDA-MB-157 de cancro da mama) com um 90% -100% monocamada confluente. Para MDA-MB-157 células, utilizar um meio composto por DMEM contendo 10% de FBS, 1% de glutamina, e 1% de antibiótico.
   1. Células colheita, usando um tampão de dissociação celular (de acordo com o protocolo do fabricante) e carregar a suspensão para um cónico de 15 ml. Centrifuga-se que durante 5 min a 173,3 xg, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio de crescimento completo.
2. As células de carga em um hemocitômetro e contá-los para calcular o número necessáriode células para uma densidade de células desejada esferóide. Uma monocamada confluente de células MDA-MB-157 células cultivadas em um frasco T75 geralmente dá ~ 7 x 10 ⁶ células.
   Recomenda-se a densidade celular Requerida para um volume de gota para gerar um único esferóide dependerá do tipo de célula ²² Por exemplo, uma densidade de 1,5 x 10 ⁴ ou maior para MDA-MB-157 células por 0,3 ul de fase gota a DEX: Nota. assegurar a formação de um único esferóide.
3. Centrifugar células para uma segunda vez durante 5 min a 173,3 x g e ressuspender-los num volume apropriado de meio de crescimento para concentrar a suspensão até uma densidade de células desejada.
   Nota: Por exemplo, se 7 x 10 ⁶ células cancerosas foram colhidas, o volume total de suspensão de células necessário para formar um esferóide de densidade de 1,5 x 10 células em ⁴ ul de 0,3 DEX gota fase será de 140 ul. No entanto, devido à diluição com a solução da fase de DEX no passo seguinte, utilizar apenas 70 ul de meio de cultura celular para ressuspender as células.
4. Adicionar a suspensão de células resultante num volume igual de 12,8% (w / v) de solução aquosa de fase DEX preparado em 1.2. Para o exemplo de densidade esferóide 1,5 x 10 ⁴ células, 70 ul da solução da fase de DEX é adicionado a 70 uL de suspensão de células.
5. Misture bem a suspensão de células para garantir a distribuição uniforme de células e mistura de solução DEX. A pipetagem para cima e para baixo deve ser feito com cuidado para evitar a formação de bolhas.

3. Preparação para a Impressão de Spheroids Co-cultura

1. Crescer as células cancerosas (por exemplo, MDA-MB-157 células de cancro da mama humano) e células de suporte (por exemplo, fibroblastos humanos) para um de 90% -100% monocamada confluente. Colheita de cada tipo celular utilizando um tampão de dissociação de células (de acordo com o protocolo do fabricante).
   1. Carregar cada suspensão numa cónico de 15 ml e centrifugar para clarificação durante 5 min a 173,3 x g, e a partir de cada sobrenadante aspirado cónica. Ressuspender as células de cada cónica em 1 ml de completa gmédio rescimento.
      Nota: corantes fluorescentes tais como Calceina AM (mancha de células vivas) e corantes nucleares (Hoechst) pode ser utilizada para distinguir os dois tipos de células.
2. Carregar cada tipo de célula separadamente para um hemocitómetro e contá-las para calcular o número necessário de cada tipo de célula para uma proporção desejada de células cancerosas para células de suporte em esferóides co-cultivadas. As monocamadas confluentes de células MDA-MB-157 e as células fibroblastos cultivadas em frascos T75 geralmente dar 7 x 10 ~ ⁶ e 10 ~ 6 x ⁶ células, respectivamente.
3. Adicionar o volume correcto a partir da suspensão de células de suporte para as células cancerosas suspensão para dar uma proporção desejada dos dois o número de tipos de células. Por exemplo, usar uma proporção de 50 células cancerosas para 1 célula de fibroblasto.
4. Centrifugar a cónico contendo a suspensão celular misturada durante 5 min a 173,3 xg células e ressuspender em um volume apropriado para resultar na densidade final compreendendo de volumes iguais de meio de crescimento e a 12,8% (w / v) aquosa DEXem fase de solução (preparado em 1.2).
5. Pipeta suavemente a suspensão de células resultante para cima e para baixo para assegurar a homogeneidade da suspensão.

4. Impressão de esferóides de Tumor em uma placa de 96 poços

1. Um dia antes das experiências, revestimento, de fundo redondo de placas de 96 poços não tratados com 1% (w / v) de Pluronic a 37 ° C durante 24 horas. Este revestimento impede a fixação das células durante o período de cultura.
2. Dispensar a 50 ul de filtrado 5% (w / v) de fase aquosa de PEG em cada poço de uma placa de 96 poços (placa de destino).
3. Usando uma pipeta, mistura da suspensão de células (preparado no passo 2 passo 3 ou para mono- e co-cultura, respectivamente) e adicionar 20 ul da suspensão a cada poço de uma outra coluna de uma placa de 384 poços (placa de fonte) .
4. Ligue o manipulador de líquidos e "casa" a cabeça de pipetagem para registrar as coordenadas. Em seguida, elaborar um protocolo previamente definido (abaixo de 4.6) para garantir material de laboratório e os parâmetros são definidos corretaly. Este "homing" passo pode ser diferente para manipuladores de líquidos diferentes.
   Nota: O fluxo do protocolo, mostrado passo-a-passo abaixo em 4.6, será semelhante independentemente do manipulador de líquidos robótico usado; no entanto, a interface de programação podem ser diferentes, devido à utilização de software diferente.
5. Colocar a placa de fonte, a placa de destino, e caixas de ponta da pipeta em posições definidas na estação de trabalho do manipulador de líquidos, tal como mostrado na Figura 1.
6. Executar o protocolo que inclui os seguintes passos:
   1. Coloque uma coluna de barris de cabeça pipetagem do manipulador líquido com mistura pontas de pipeta (8 pontas) da estação de trabalho (Figura 1).
   2. Misture a suspensão de células em cavidades da placa de fonte (Figura 1). Escolher um volume de mistura menor do que o volume de suspensão de células em poços para evitar a formação de bolhas.
   3. Ejetar dicas em uma caixa de aterros vazio (Figura 1).
   4. Carregar uma coluna de barris de a cabeça de pipetagem com 10 ul de distribuição de pontas de pipetas (Figura 1).
   5. Aspirar 0,3 ul da suspensão de células a partir da placa de fonte (Figura 1) em cada ponta de pipeta.
   6. Dispensar a suspensão de células em cavidades de uma coluna da placa de destino (Figura 1). Utilize uma altura de distribuição de 0,5 mm e um caudal de distribuição de menores do que 1? L / seg.
   7. Repita os passos 4.6.1 4.6.6 através de impressão até a coluna-a-coluna para a totalidade da placa de destino é completa.
7. Remover cuidadosamente a placa de destino a partir da superfície da estação de trabalho e colocá-lo numa incubadora húmida a 37 ° C e 5% de CO _2. Manter a placa horizontal quando o levar para a incubadora para evitar prejudicar o de gotas de fase DEX contendo células.
8. Incubar a placa durante 24 h, para permitir a agregação de células num esferóide dentro da gota fase DEX.

5. Drug Treatment of Cancer Spheroids Celulares

Note-se que o protocolo seguinte é para um tratamento medicamentoso de 4 dias e inclui uma renovação com droga fresca após dia 2. Ela pode ser modificado para outros períodos de tratamento.

1. Confirmar visualmente a formação de esferóides, em placas de 96 poços depois de 24 horas. Se necessário, poços de imagem para medição do tamanho de esferóides pela média das menores e maiores diâmetros de cada esferóide.
2. Preparar a solução de stock de um medicamento desejado, dissolvendo-o num solvente recomendado pelo fabricante, a uma concentração pré-determinada a solubilidade. Por exemplo, dissolve-se a cisplatina em água a 2 mg / ml.
   Nota: Proteja a solução estoque da droga da luz, se a droga é sensível à luz.
3. Usando a técnica de diluição em série, preparar as concentrações de droga diluídas com meio de cultura de células a partir da solução preparada no passo anterior. Cada diluição deve ser feita duas vezes a concentração desejada. Dilrácios ution irá variar dependendo da concentração do material de partida desejado e concentrações de trabalho.
4. Adicionar 50 ul de solução de droga foi preparada na etapa anterior a cada poço. Isto pode ser realizado roboticamente ou por pipetagem manual.
   Nota: Cada concentração de droga será diluído para metade, para a concentração desejada por 50 ul da fase aquosa PEG já em cada poço.
   1. Use esferóides de duas colunas de uma placa de 96 poços (n = 16) para cada concentração.
   2. Em cavidades de controlo, adicionar apenas 50 ul de meio de cultura fresco aos 50 ul existentes da fase aquosa PEG.
5. Incubar esferóides com o fármaco durante 48 horas a 37 ° C e 5% de CO _2, protegido da luz.
6. Após 48 horas de incubação, preparar diluições frescas de droga em concentrações desejadas e renovar droga por adição de 50 uL de solução de droga fresco a cada poço.
   Nota: Os poços já conter a concentração da droga desejada a partir da primeira droga tratamento. Por conseguinte, nesta fase renovação, cada concentração é preparada na concentração desejada, desde que não irá ocorrer a diluição.
7. Incubar esferóides com a droga durante mais 48 horas a 37 ° C e 5% de CO _2, protegido da luz.

6. Análise de Viabilidade Celular em esferóides

1. Após 48 horas de incubação com renovada droga (isto é, o tempo total de tratamento de esferóides com um fármaco é de 4 dias), medir o volume total do meio de um bem por pipetagem manual.
   Nota: O volume típica em um poço é de ~ 140 mL (uma pequena diminuição ocorre devido à evaporação).
2. Calcular o volume de reagente a viabilidade das células (por exemplo, PrestoBlue) como a concentração de 10% do volume total do bem. Adicionar o volume de reagente a viabilidade das células para cada poço.
   Nota: Com um volume de suporte existente de 140 pi de um poço, num volume de 15,6 uL é necessária para dar uma concentração de 10% do total bem. Este valor é calculadodividindo o volume de mídia existente por 9 (140 l / 9 = 15,6 ul).
3. Incubar a placa, com o reagente de viabilidade celular adicionada a cada poço, durante 6 h a 37 ° C, protegida da luz.
4. Colocar a placa num leitor de micro-placa e ler o sinal de fluorescência a 560 nm e 590 nm de excitação e de emissão de comprimentos de onda, respectivamente.
5. Calcula-se a percentagem de viabilidade de células em esferóides com a normalização do sinal fluorescente de poços tratados para os poços de controlo de que a média dos valores depois de as mesmas condições de tratamento.

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Resultados

A estação de trabalho do manipulador de líquidos robótico é mostrado na Figura 1. A cabeça de pipetagem e todas as estações utilizadas na impressão robótico de esferóides na secção 4.6 são rotulados. A imagem mostra a utilização de duas estações diferentes para caixas de ponta (um conjunto de dicas para a mistura e o segundo conjunto para aspiração / dispensação de mistura fase DEX suspensão aquosa de células). Toda a configuração está alojado dentro de um armário de norma de...

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Discussão

Spheroids apresentar um modelo realista para compreender melhor a fisiologia tumor e eficácia da droga e fornecer uma ferramenta útil para anti-câncer de descoberta de drogas. Tais aplicações iria beneficiar muito de técnicas simples de geração e manutenção esferóide que exigem apenas o material de laboratório padrão, ferramentas de manipulação de líquidos e equipamentos de rastreio. O uso de um sistema aquoso de duas fases nas células cancerosas, espontaneamente agregados dentro da fase gota permite a ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, MW: 35,000	Sigma-Aldrich	94646
Dextran, MW: 500,000	Pharmacosmos	5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D6429
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12306C
Glutamine	Life Technologies	35050-061
Antibiotic	Life Technologies	15240-062
Clacein AM	Life Technologies	C3100MP
Hoechst	Life Technologies	33342
Cisplatin	Spectrum Chemicals	15663-27-1
PrestoBlue	Life Technologies	A-13261
Pluronic F-108	Sigma Aldrich	542342
Disposable Tips (10 µl)	Fluotics	C-P10V11.ST
Disposable Tips (70 µl)	Fluotics	C-P70V11.ST
Round-bottom 96-well plates	Nunc	268200
Equipment
Liquid Handler	Agilent Technologies	SRT Bravo
Microplate Reader	Biotek Instruments	Synergy H1M