Ensaio Cometa como uma medida indireta do Systemic Estresse Oxidativo

Resumo

Ensaio Cometa mede quebras de DNA induzidas por diferentes fatores. Se todos os fatores (exceto estresse oxidativo) que causam danos ao DNA são mantidas constantes, a quantidade de dano ao DNA é um bom parâmetro indireto do estresse oxidativo. O objetivo deste protocolo é usar o teste do cometa para a medição indireta do estresse oxidativo.

Resumo

Organismos eucarióticos superiores não podem viver sem oxigênio; No entanto, paradoxalmente, o oxigênio pode ser prejudicial para eles. A molécula de oxigênio é quimicamente inerte relativamente porque tem dois elétrons desemparelhados localizados em diferentes pi * anti-colagem orbitais. Estes dois elétrons têm spins paralelos, o que significa que gira na mesma direção sobre seus próprios eixos. É por isso que a molécula de oxigênio não é muito reativo. A activação de oxigénio pode ocorrer por dois mecanismos diferentes; ou através de redução por meio de um electrão de cada vez (monovalente redução), ou por meio da absorção de energia suficiente para inverter a rotação de um dos electrões desemparelhados. Isto resulta na produção de espécies oxidativas reactivas (ROS). Há um certo número de maneiras pelas quais o corpo humano elimina ROS no seu estado fisiológico. Se a produção de ROS excede a capacidade de reparação, os resultados de estresse oxidativo e danos moléculas diferentes. Existem muitos métodos diferentes pelos quais o estresse oxidativo pode estar measured. Este manuscrito incide sobre um dos chamados métodos de electroforese em gel de célula, também conhecido como "comet assay", que permite a medição das quebras de ADN. Se todos os factores conhecidos por causarem danos no ADN, à excepção de stress oxidativo são mantidas constantes, a quantidade de danos no ADN medida pelo ensaio do cometa é um bom parâmetro de estresse oxidativo. O princípio é simples e baseia-se no facto de que as moléculas de DNA são carregadas negativamente. Uma molécula de DNA intacto tem um tamanho tão grande que não migrar durante a electroforese. Quebras de ADN, no entanto, se estiverem presentes resultado em fragmentos mais pequenos, que se movem no campo eléctrico em direcção ao ânodo. Fragmentos menores migram mais rapidamente. À medida que os fragmentos têm diferentes tamanhos do resultado final da electroforese não é uma linha distinta, mas sim um contínuo com a forma de um cometa. O sistema permite uma quantificação do "cometa" resultante e, portanto, das quebras de ADN na célula.

Introdução

Ensaio Cometa foi desenvolvido pela primeira vez por cientistas suecos Ostling e Johanson ^1. O DNA é uma molécula carregada negativamente. Durante a eletroforese, fragmentos de DNA menores, danificadas viajar mais rápido em direção a um ânodo positivamente carregado ^2. O menor dos fragmentos de ADN, mais rapidamente a sua migração para o ânodo, para formar um "cometa" típica com uma "cabeça" do composto intacto, o ADN intacto e uma "cauda" constituída por fragmentos de ADN danificadas ^3. O DNA danificado pode ser reparado por diferentes mecanismos do corpo ^4, que mantêm a geração de DNA breaks bastante equilibradas ^5. Se, no entanto, o equilíbrio é a favor de quebras no ADN, as quebras podem acumular-se e, finalmente, contribuir para o desenvolvimento de uma doença.

O nosso DNA sofre danos aproximadamente 0.000165% em um determinado momento ^6. Quebras de ADN de cadeia simples referem-se a um defeito de um dos dois cordões da dupla hélice de ADNConsiderando quebras de cadeia dupla de ADN são causados ​​quando ambas as cadeias da dupla hélice de ADN são danificados. Existem vários factores que podem aumentar a quantidade de quebras no ADN em um determinado momento, tais como a idade da célula, o fumo do cigarro, várias drogas ou stress oxidativo ^7-9. Se todos os fatores que levam a quebras de DNA aprimorados são mantidas constantes, em seguida, a quantificação de quebras de DNA por meio de teste do cometa é um bom parâmetro indireto do estresse oxidativo.

O método de ensaio do cometa é usado cada vez mais hoje em medicina incluindo oftalmologia. Uma razão para isto é que o stress oxidativo é cada vez mais reconhecido como um mecanismo patogénico para várias doenças e ^8-11 comet assay é um método com o qual o stress oxidativo pode ser quantificada indirectamente.

Protocolo

Estudos sobre ensaio do cometa realizadas na Universidade de Basel, Departamento de Oftalmologia foram aprovados pelo Comitê de Ética local Basel

1. Preparação dos Reagentes

1. Prepare a solução pela adição de PBS (1 L de pacotes) e 990 ml de _dH2O para a mídia fosfato salino tamponado de Dulbecco (PBS) (livre de Ca ++, Mg ++). Ajustar o pH para 7,4. Armazenar à temperatura ambiente.
2. Preparar solução de lise: Para preparar 1000 ml de adicionar 2,5 M de NaCl (146,1 g), EDTA 100 mM (37,2 g) e 10 mM de base de Trizma (1,2 g) em _dH2O
3. Preparar tampão de electroforese (NaOH a 300 mM / EDTA 1 mM), adicionando 30 mL de NaOH 10 M e 7,5 ml de 0,2 M de EDTA, qs para 1500 ml _{de dH2O} e misturar bem. O volume total depende da capacidade de caixa de gel. Antes da utilização, medir o pH do tampão para garantir um pH> 13.
4. Preparar tampão de neutralização de Tris contendo 0,4 M (48,5 g adicionado a ~ 800 mL _{de dH2O,} ajustar o pH a 7,5), concentrou-se (& #62; 10 M HCl) em 1000 ml com dH ₂ O. Guardar a solução à TA.
5. Prepare a solução de coloração. Para o brometo de etídio (EtBr; 10x da, 20 ug / ml) adicionam-se 10 mg de EtBr em 50 ml _dH2O e armazenamento à temperatura ambiente. Para 1x Ações - misturar 1 ml com 9 ml dH ₂ O. CAUTELOSOS! Lidar com EtBr com precaução adequada, pois é um conhecido agente cancerígeno.

2. Isolamento de Leucócitos

1. Obtenção de amostras de sangue humano (20 ml) com anti-coagulante, tal como a heparina por punção venosa.
2. Separa-se os linfócitos utilizando um separador de células por gradiente de densidade, tais como Histopaque.
   1. Resumidamente, o sangue diluído em proporção 1: 1 com PBS ou meio RPMI (sem FBS) e camada de mais de 600 ul líquido separador de células.
   2. Centrífuga 1800 xg durante 20 min a 4 ° C. Aspirar o revestimento "buffy" em 3-5 mL de PBS / RPMI e centrifugado a 300 xg durante 10 min para sedimentar os linfócitos.
   3. Recuperar linfócitos de apenas acima fronteira entre PBS (RPMI) E líquido separador de células, usando uma pipeta. Retirar as bandas de leucócitos a partir da interface entre o plasma e os separadores de célula camadas líquidas de cada tubo e recolher em um tubo de 50 ml.
3. Levar o volume total a 50 ml com Meio Eagle Modificado de Dulbecco frio (DMEM). Lava-se a suspensão de células três vezes com DMEM a 300 xg durante 10 min.
4. Contar o número total de células utilizando um hemocitómetro. Suspender as células em PBS e alíquota em tubos de microcentrífuga a 10 ⁷ células / tubo.
5. Pipetar 0,4 ml de células em 5 ml de um tubo de plástico descartável. Adicionar 1,2 ml de 1% de agarose-gelificante de baixa temperatura a 40 ° C. Misture e rapidamente e pipetar 1,2 ml de suspensão de células sobre a superfície coberta de agarose de uma lâmina pré-revestidos. Evitar a produção de bolhas.
6. Permitir que o gel de agarose a durante cerca de 2 min. Seja consistente com o tempo e temperatura utilizadas para a gelificação, e garantir que agarose está totalmente definido antes de submergir em solução de lise. Depois de totalmente set, mergulhe em solução de lise em ~ 4 ºC.

3. A lise e electroforese

NOTA: O procedimento descrito é para a electroforese em condições de pH> 13 alcalino.

1. Depois de pelo menos 2 horas a ~ 4 ° C, remover suavemente slides da Solução de Lise. Colocar as lâminas lado a lado na caixa de gel na horizontal perto de uma extremidade, deslizando-los tão próximos quanto possível.
2. Encha os reservatórios de buffer com pH> 13 eletroforese recentemente feito até que o nível do líquido cobre completamente os slides (evitar bolhas sobre a agarose).
3. Deixe lâminas sentar-se no tampão alcalina durante 20 min para permitir o desenrolamento do DNA e a expressão dos danos alcalino-lábil.
4. Ligue a fonte de alimentação de 25 volts (~ 0,75 V / cm) e ajustar a corrente de 300 miliamperes, aumentando ou diminuindo o nível de buffer. Electroforese as lâminas durante 30 min.
5. Desligue a energia. Levante cuidadosamente os slides do buffer e prendas em uma bandeja de drenagem. Deixe cair casaco sábio as lâminas com neutralização Buffer. Permitir que os slides para descansar por pelo menos 5 min. Escorra lâminas e repetir mais duas vezes.
6. Manchar as lâminas com 80 ul 1x brometo de etídio (EtBr) e deixe por 5 minutos e em seguida, mergulhar em água destilada gelada para remover o excesso mancha. Em seguida, coloque uma lamela sobre a lâmina e armazená-los imediatamente. Loja desliza por um mês à temperatura ambiente em condições secas.
   NOTA: Outras manchas de ADN (por exemplo, SYBR verde) podem também ser utilizados. Cuidado! usar luvas de proteção como a maioria dos corantes são mutagênicos.

4. Quantificação de quebras de DNA

1. Para visualizar o dano ao DNA, observar o slide DNA EtBr manchada sob um microscópio de fluorescência 40X objetiva.
2. Avaliar quantitativamente danos no ADN nas células, medindo o comprimento da migração de DNA e a percentagem de ADN migrou (Figura 1A). Quantificar o dano ao DNA (Figura 1B) pelo momento Cauda e Olive-moment. Definições de Cauda-Moment e Olive -Moment tenham sido previamente dada ^8-10.
   NOTA: Em nossa experiência, é o suficiente para ficar por um dos parâmetros. As células são fotografados, definindo a ferramenta automatizada que varre sobre as células de slides e fotografias microscópio. Quantificação de quebras de ADN pode ser feito por pacotes de software de análise de imagem. Existem vários pacotes de software diferentes que são feitos para capturar a imagem das células e quantificação dos danos de ADN. Recomendamos usar o mesmo pacote de software durante todo o experimento. O técnico de laboratório identifica a célula ou cometa intacta para ser marcado no computador e clica com o mouse sobre ele. A célula cometa ou intacto é, então, marcou automaticamente.

Resultados

Embora o método de teste do cometa torna reprodutibilidade dos resultados, que podem ser influenciadas por uma série de factores. Um desses factores é se ou não os leucócitos são criopreservadas antes da lise e electroforese em gel ou se este passo for realizado em leucócitos recentemente preparadas. A Figura 2 mostra que, no Grupo 2, em que os leucócitos foram criopreservados antes de ADN de lise e electroforese em gel de SS- breaks foram significativamente maiores do que no Grupo 1, onde lise e gel -electrophoresis foi feito em células preparados na hora.

O ensaio também pode ser utilizado para avaliar indirectamente estresse oxidativo sistémica. A Tabela 1 mostra a estatística descritiva para Cauda momento e momento de azeitona em fumantes e indivíduos saudáveis. Os dados revelam que fumar meio maço de cigarros por dia mais do que duplica breaks ssDNA nos leucócitos circulantes ^9.

Figura 1. (A) representa o microscópio utilizado durante a análise comet assay. (B) Δ descreve um "cometa" típico com uma cabeça e cauda (danificado fragmentos de DNA menores) brilhante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. quebras de ADNcs foram significativamente mais elevados quando os leucócitos foram criopreservados (Grupo 2) do que quando os leucócitos preparadas de fresco foram usadas antes da lise e electroforese em gel.

Tabela 1. Os fumantes tinham mais do dobro do número de ssDNA quebra em relação à idade e sexo correspondentes saudáveis ​​não-fumantes.

Discussão

Cientistas suecos Ostling e Johanson foram os primeiros em seu campo para usar ensaio cometa para quantificar o dano ao DNA em células de ^um. As condições neutras que os dois cientistas utilizado, no entanto, apenas foi possível a detecção de quebras de cadeia dupla de ADN. Singh et al., Depois adaptado o ensaio para o uso sob condições alcalinas, o que produziu uma versão sensível que poderia avaliar quebras duplas e ADN de cadeia simples e detectar sítios lábeis ^alcalino-12. Uma vez que o seu desenvolvimento inicial, o teste foi modificado em vários passos para torná-lo adequado para avaliar os tipos de danos no DNA em diferentes tipos de células ^13-15.

Tal como acontece com todas as técnicas, prestando atenção rigorosa aos detalhes técnicos é importante para obter resultados precisos ^16. Com base em nossa experiência, os melhores resultados são obtidos se cada passo da preparação metodológica solução para cometa quantificação-é realizada por especialista tecnol laboratórioicians. O uso de fresco e preparado corretamente mídia, técnicas de pipetagem adequadas, tempo exato e (como mencionado anteriormente na seção de resultados) o uso de leucócitos preparados na hora são essenciais para que a lise e eletroforese em gel para obter resultados precisos ^17.

Todas as etapas individuais neste ensaio são igualmente importantes para a obtenção de resultados confiáveis. Em ¹⁶ melhores resultados gerais são obtidos se cada passo metodológico de preparação da solução até cometa quantificação é realizada por especialista technicians.Important laboratório parecem a utilização de meios frescos e preparados corretamente , técnicas de pipetagem adequadas, tempo exato e como já foi referido na seção de resultados do uso de leucócitos preparados na hora para lise e electroforese em gel para obter resultados adequados a partir do ensaio ^17.

Como fazer outras metodologias, a técnica de ensaio do cometa tem sua advantages e desvantagens. Sendo um método sensível, o ensaio é vulnerável a factores (por exemplo, luz UV), que poderia aumentar quebras de DNA e, assim, afetar os resultados. Qualquer fator que pode aumentar o estresse oxidativo, exceto o que está sendo pesquisado, deve ser evitado. Factores de stress pode aumentar o nível de estresse oxidativo, não só em leucócitos, mas também em todos os outros meios e linfócitos sanguíneos. Como mencionado anteriormente, existem muitas maneiras diferentes e mais diretos de medição de estresse oxidativo ^18,19. O ensaio do cometa é um dos muitos métodos que tem certas vantagens. Estes incluem o seu custo relativamente baixo, o pequeno número de células necessárias (<10.000 células) e, portanto, as pequenas amostras de sangue necessários por paciente, o período relativamente curto de tempo necessário para quantificar os danos no DNA em células (aproximadamente 3 dias), a sua sensibilidade e sua aplicabilidade generalizada a danos no DNA jumentos em diferentes tipos de células. No passado, nós escolhemos trabalhar com leucócitos desde que teve experiência com estedo tipo de célula e que era aplicável para o estudo particular planeada. Outra vantagem do ensaio de cometa é que ele pode ser utilizado para detectar diferentes tipos e níveis de danos no ADN e, portanto, pode ser aplicada em várias outras áreas para além dos estudos de stress oxidativo, tais como estudos de reparação de ADN, ensaios de complementação ou estudos de genotoxicidade.

O stress oxidativo é agora reconhecido como desempenhando um papel crucial na patogénese de várias doenças. O método de ensaio de cometa, enquanto uma das muitas maneiras de medir o stress oxidativo ^18,19, é relativamente simples, barata e versátil. Quando dominado, este método pode ser usado em todas as áreas da medicina, em que o stress oxidativo desempenha um papel ^8-10,20,21.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Qualigens	(CPW59)
Disodium EDTA	HiMedia	(RM1370)
Ethidium Bromide	Sigma	(E-8751)
Histopaque	Sigma	(1077-1)
Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free)	HiMedia	(TS1006)
Sodium Chloride (NaCl)	Ranbaxy Rankem	(S0160)
Sodium Hydroxide (NaOH)	BDH-Merck	(89021)
Triton X-100	HiMedia	(RM 845)
Trizma Base	Spectrochem
Materials required for gel electrophoresis
Normal Melting Agarose (NMA)	HiMedia	(RM273)
Low Melting Point Agarose (LMPA)	Sigma	(A9414)
Methanol - Qualigens
Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)	Blue Star
Microcentrifuge Tubes	Tarsons	(500010)
Micropipettor and Tips	Tarsons
Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides