Fígado Preservação Human Funcional e cobrança através de Subnormothermic Máquina de Perfusão

Resumo

Descreve-se um método de perfusão ex vivo máquina de enxertos de fígado humano à temperatura subnormothermic (21 ° C).

Resumo

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation. Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of donor livers. Machine perfusion of donor liver grafts is an alternative to traditional cold storage of livers and holds much promise as a modality to expand the donor organ pool. We have recently described the potential benefit of subnormothermic machine perfusion of human livers. Machine perfused livers showed improving function and restoration of tissue ATP levels. Additionally, machine perfusion of liver grafts at subnormothermic temperatures allows for objective assessment of the functionality and suitability of a liver for transplantation. In these ways a great many livers that were previously discarded due to their suboptimal quality can be rescued via the restorative effects of machine perfusion and utilized for transplantation. Here we describe this technique of subnormothermic machine perfusion in detail. Human liver grafts allocated for research are perfused via the hepatic artery and portal vein with an acellular oxygenated perfusate at 21 °C.

Introdução

O transplante de fígado é o único tratamento curativo para dezenas de milhares de pacientes que sofrem de estágio final da doença hepática. Para facilitar o transplante bem sucedido, preservação óptima do fígado a partir do momento em que é obtido a partir do dador, até o momento em que são implantadas no receptor é necessário para evitar a deterioração rápida do enxerto. A norma actual para preservação fígado é denominado «armazenamento frio estático ': o fígado é arrefecida numa solução de preservação gelada, reduzindo, assim, o metabolismo do fígado e abrandar os efeitos deletérios da isquemia. Embora esta técnica de armazenamento a frio tem permitido para transplante bem-sucedido, os órgãos de qualidade marginal, como órgãos DCD danificadas por isquemia quente ou esteatose mostra paciente inferior resultados ^1. Há um corpo em rápida expansão de evidências de que ex vivo máquina de perfusão de enxertos de fígado como uma modalidade alternativa de preservação pode, potencialmente, improvar os resultados para esses órgãos marginais ^2,3.

O transplante de fígado tornou-se vítima do seu próprio sucesso. Far mais pacientes são encaminhados para transplante do que há fígados disponíveis, e milhares morrem na lista de espera nos Estados Unidos a cada ano. Dada a realidade da escassez de doadores de fígado e à crescente utilização de enxertos de fígado de qualidade abaixo do ideal para os destinatários carentes, é amplamente difundida de que ex vivo máquina de perfusão de enxertos de fígado antes da implantação mantém a promessa de uma mudança de paradigma no transplante de fígado. Houve um aumento acentuado no interesse em pesquisas sobre este tema nos últimos anos ^08/04. Em vários centros europeus e norte-americanos máquina de perfusão hipotérmica fez uma introdução ⁸ e normotérmica perfusão clínica máquina a temperaturas fisiológicas foi recentemente aplicada aos fígados humanos descartados e está sendo traduzido para o uso clínico, bem ^9.Extenso desenvolvimento conduziu ao desenvolvimento de vários protocolos, enquanto a optimização contínua identifica a perfusão óptima parâmetros ^10-12. O uso de enxertos marginal de qualidade aumentou mais de 10 vezes ao longo da última década ^13. Quando comparado com o padrão atual para a preservação do fígado (armazenamento a frio estático), ex vivo máquina de perfusão proporciona inúmeros benefícios potenciais, os quais resultam em expansão muito necessária para a piscina do órgão e um potencial diminuição na incidência de complicações pós-transplante. Em particular, as complicações biliares que atualmente afligem enxertos hepáticos abaixo do ideal de qualidade após o transplante continuam a ser um problema substancial ^14-18.

Máquina de perfusão em condições subnormothermic fornece uma janela de tempo para avaliar a função do enxerto objetivamente como a aptidão para o transplante de ^19. Enquanto o fígado está a ser perfundido num circuito ex vivo, tanto a um perfusadond a bile produzida durante a perfusão podem ser degustados para medição de marcadores de função do órgão. Desta forma "gravemente comprometida" fígados que são descartados para transplante de acordo com os critérios atuais podem ser objetivamente avaliados quanto à sua adequação para transplante. Avaliação da viabilidade permite potencialmente que para muitos destes órgãos a serem utilizadas para o transplante. Um igualmente poderoso benefício da máquina de perfusão é o reparo e melhoria de fígados que foram danificados por isquemia quente / frio. ATP está esgotado muito rapidamente durante a isquemia fria quente e posterior e pode ser repleted durante um período de máquina de perfusão antes da implantação do fígado ^20. O fígado, com suas reservas de energia e estado metabólico reabastecido, está pré-condicionado e melhor preparados para os efeitos prejudiciais de lesão de reperfusão após o implante no receptor.

Este trabalho descreve um método de máquina de perfusão ex vivo de fígado humano grafts em laboratório, o que será útil para pesquisadores que desejam estudar tanto a técnica e os efeitos benéficos do ex vivo máquina de perfusão. Nós fazemos uso de fígados de doadores humanos que tenham sido recusados ​​para o transplante e depois são alocados para fins de investigação.

Norma técnica procurement fígado envolve em resplendor arterial situ do fígado após o pinçamento no cérebro doadores mortos (DBD) ou após a parada circulatória em doadores circulatórios morte (DCD), descritos em mais detalhes em outro lugar ^20. Além disso, o fígado é resfriado durante a aquisição através do preenchimento da cavidade abdominal do doador com gelo. Lavar as preferências soluções variar entre regiões, com a maioria dos processos de aquisições utilizando a Universidade de solução de histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK) ou Wisconsin. Uma descarga adicional back-mesa da veia portal melhora a lavagem de sangue residual. Os fígados são muitas vezes adquiridos no deixando um segmento de aorta surarredondamento do tronco celíaco. A vesícula biliar é entalhada, bile é aspirado, e do ducto biliar é liberado. Os fígados são embalados em sacos estéreis contendo solução de conservação gelada e transportados em caixas designadas ou refrigeradores. Para obter resultados representativos tempo de isquemia quente e frio deve ser limitado a 60 minutos e 12 horas, respectivamente. Apesar de triagem sorológica de rotina para patógenos transmissíveis, devem ser tomadas precauções padrão quando da entrega órgãos humanos, as amostras obtidas a partir de órgãos humanos, e quaisquer produtos residuais.

O protocolo aqui descreve máquina de perfusão subnormothermic utilizando um dispositivo de perfusão do fígado disponível comercialmente. O uso de tal dispositivo permite mais rápida tradução para o contexto clínico e validação cruzada de diferentes protocolos e configurações do dispositivo, entre grupos de pesquisa e centros de transplante.

Protocolo

O uso de tecidos humanos deve ser revista por um conselho de revisão institucional (IRB) ou equivalente. O trabalho aqui descrito foi aprovado e declarado isento pelo Hospital Institutional Review Board Geral de Massachusetts (No. 2011P001496).

1. Preparação de Solução

1. Adicionar assepticamente suplementos para vermelho de fenol Williams 'medium E, conforme descrito na Tabela 1. A solução deve ser preparada antes da utilização. A insulina deve ser adicionado imediatamente antes da utilização.

2. Voltar Tabela Preparação do Fígado

1. Coloque uma tigela órgão cheio de gelo em uma superfície estéril, drapeado. Retire o fígado a partir da caixa, deixando-o no saco de solução de preservação frio. Mantenha o fígado principalmente submerso.
2. Identificar a artéria hepática (HA), que será localizada distalmente ao remendo aórtico. Dissecar livre da artéria para revelar vários ramos cortados ao longo do comprimento com uma tesoura Metzenbaum. Cuidadosamente Dissect todo o comprimento da artéria para evitar cortar um vaso que alimenta o fígado. Não corte ou amarrar ramos que não têm um fim visível.
3. Tie fora todos os ramos arteriais que não fornecem o fígado usando sutura de seda de tamanho variando de 0 a 4-0, dependendo do tamanho do vaso. Fechar filiais que são demasiado curto para amarrar ou buracos na artéria com um ponto de prolene 7-0. Tie e cortar as artérias esplênica e gástrica esquerda perto de sua origem no tronco celíaco.
4. Remova o sistema da aorta cortando o tronco celíaco diretamente sob o patch. Canular tronco celíaco utilizando a cânula aórtica.
5. Identifique a veia porta (PV) e sem rodeios dissecá-lo livre. Empate fora quaisquer ramos e cannulate o PV com o segmento preparado de tamanho 24 tubos.
6. Remover seções do diafragma da veia cava supra-hepática, sem cortar a própria veia. Do fluxo de saída a partir dos drenos da veia cava directamente para dentro da câmara de órgãos.
7. Corte 2 full-ti circunferênciassue amostras (2-3 mm de comprimento) a partir da extremidade do ducto biliar comum; congelar uma pressão em azoto líquido (armazenar a -80 ° C) e armazenar o outro em formalina tamponada a 10%, de tecidos e para análise histológica, respectivamente. Canular do ducto biliar comum com a cânula navio e um tubo de drenagem feita de tubos de oxigenador de membrana.
8. Identificar e ligadura do ducto cístico com um empate 0 seda. O ducto cístico é encontrada entre o ducto biliar comum e da vesícula biliar.
9. Conecte o flush tubo definido para sacos de gelo-frio de solução de Ringer com lactato (LR) e prepare o tubo, retirando todo o ar.
10. Ajuste o regulador de fluxo na tubulação de descarga a um gotejamento lento. Antes de ligar o tubo de descarga para a cânula na veia portal, oclusão da veia porta com os dedos no hilo e encher a cânula e veia com descarga para remover o ar a partir da veia porta. Não elevar o saco mais de 20 cm acima da altura do fígado durante a lavagem frio a fim de evitar uma pressão excessiva sobre oveia.
11. Durante o flush brevemente ocluir o PV no ponto mais baixo. Examine o PV se há vazamentos. Ramos do navio pode ser fechado como descrito acima. Lavar o fígado através da PV com um total de 2 L de gelo-LR frio.
12. Repita os passos de 2.10, 2.11 para o HA com 1 L de LR.

3. Operação do sistema SNMP

1. Primeiro o aparelho de perfusão através da adição de 2 L de perfusato (21 ° C) para a bacia de órgãos e de iniciar o dispositivo para preparar o tubo. Seguir as instruções do dispositivo para preparar a perfusão, ajustando a temperatura para 21 ° C. Comece com pressões de 3 mmHg e 30 mmHg no PV e HA, respectivamente. Abra o tanque de gás e ajustado para um caudal de 3 L / min.
2. Tomar uma amostra de gás no sangue, tanto do ingresso HA e PV desenhando uma amostra a partir dos portos de amostra de 0,3 ml e executá-lo na máquina de gasometria de acordo com as instruções do fabricante. Confirme oxigenação adequada (pO ₂> 700 mmHg) e pH (7,35-7,45).
3. Antes do fígado está ligado tomar uma amostra de 1,0 ml de solução de perfusão como a = 0 a medição em um tubo eppendorf e armazenar a -80 ° C. Corte duas ± 250 biópsias cunha mg do fígado usando uma lâmina de aço único gumes; congelar uma pressão em azoto líquido (armazenar a -80 ° C) e armazenar o outro em formalina a 10% tamponada. Pesa-se o fígado antes da perfusão.

4. Human Liver Perfusão

1. Transferir o fígado para o dispositivo. Ligue a entrada PV à cânula PV, após a remoção de ar do PV como na etapa 2.10. Ligue o HA de um modo semelhante. Definir PV e pressão HA para 3 e 30 mmHg. O fígado deve ser quase submerso por perfusato. Cubra todas as superfícies secas, incluindo os navios de afluência, com gaze estéril molhado para evitar a desidratação
2. Deixe o dreno tubulação bile em um recipiente de coleta. Certifique-se a abertura do ralo biliar é ao nível do fígado ou inferior para permitir que a bile para executar out livremente.
3. As taxas de fluxo alvo são 275-325 ml / min.kg e 50-100 ml / min.kg para a PV e HA respectivamente uma vez que o fígado tem aquecido a 21 ° C. Uma vez que cada fígado reage de forma diferente à perfusão, monitorar o fluxo de perto durante os primeiros minutos. Aumentar ou diminuir a pressão em qualquer um dos recipientes, se as taxas de fluxo alvo não são atingidos. Não exceda 50 mmHg na HA e 5 mmHg no PV.
4. As amostras podem ser tomadas a partir do tecido do fígado, do perfusato e biliar no preferência investigadores. Recomendamos, no mínimo, o seguinte esquema de coleta de amostras durante a perfusão.
   1. Biópsias de tecidos, n = 2 x 250 mg, a cada hora. Armazenamento: tirar congelar um em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C a longo prazo. Além disso, tomar outra biópsia antes e após a perfusão e corrigir em formalina a 10% tamponada (n = 1)
   2. As amostras de perfusado, n = 2 x 1 ml, cada 15 minutos durante a primeira hora e, posteriormente, a cada 30 min. Desenhe amostras da inf PVbaixo porta amostra. Armazenagem: -80 ° C a longo prazo.
   3. Gasometria do PV e HA ingresso e saída da veia cava. n = 3 X 0,3 ml, cada 30 minutos. Desenhe amostras, tanto do PV e portas de amostra de HA. Desenhar uma amostra a partir da veia cava de 0,3 ml por inserção de uma seringa na veia e executado directamente no analisador de gás do sangue. Através da saída para assegurar a oxigenação e pH adequado.
   4. Produção de bílis, n = 1 x 1 ml, a cada hora. Visualmente quantificar a produção de bile a cada hora e tirar uma amostra do recipiente de coleta. Renove o recipiente após a colheita. Armazenamento: gelo seco e -80 ° C a longo prazo.
5. Continuar a perfusão durante 3 horas. Controlo da pressão, pH e da oxigenação e da colheita de amostras por toda parte. Ajuste o pH se por adição de bicarbonato de sódio à solução de perfusão.
6. No final da perfusão tomar as amostras finais, enquanto o fígado é perfundido. Desligue o fígado e retirar a cânula do canal biliar. Tome 2 amostras de tecido pós-perfusão doducto biliar, tal como descrito antes, para armazenamento a -80 ° C e em 10% de formalina tamponada.
7. Descartar o fígado humano seguindo orientações de material biológico adequado.

Resultados

Uma série de observações e análises podem ser executadas no fígado durante a perfusão, incluindo observações directas tempo real, tais como as taxas de fluxo e a produção de bílis; medições em tempo real, tais como análise de gases do perfusato, e as medidas pós-hoc que são feitas após a coleta da amostra, incluindo a análise bioquímica do perfusato e tecido e análise histológica. Os resultados mencionados aqui são de 22 fígados humanos perfundidos. Os fígados foram rejeitados para transplante, por várias razões, incluindo a idade do doador, tempo de isquemia quente excessiva, os resultados da biópsia (esteatose, inflamação, fibrose) e por razões logísticas. 18 fígados foram adquiridos após a morte cardíaca, e 4, após a morte encefálica. Em ambos os casos, os dadores foram pré-tratados com 30.000 unidades de heparina e lavado in situ e na tabela da volta com uma solução de UW. Tempo de isquemia fria foi em média de 531 ± 237 (SD) min e o tempo de isquemia quente média foi de 27 ± 10 (SD) min, medido a partir de retirada da vidaapoio ao rubor frio. Observações e medições em tempo real pode ser utilizado para avaliar o fígado durante a perfusão, enquanto que as medições pós-hoc são reveladas após a perfusão.

Observações em tempo real

Fluxo através do fígado começa inferiores às taxas de fluxo alvo, como um resultado de uma resistência mais elevada no fígado frio. Utilizando uma pressão de 3 mm Hg sobre o PV e 30 mmHg sobre a HA os fluxos alvo podem geralmente ser obtidos uma vez que o fígado tenha sido aquecida até 21   ° C após 60 minutos de perfusão (Figura 1A). O fluxo biliar geralmente pode ser observado dentro de 10 min de perfusão e é produzido de forma constante durante a perfusão (Figura 1B). Bile quantidade depende da qualidade do fígado e varia de 0,3 ml / h / kg de fígado a 18 ml / min / kg. Em fígados com tempo de isquemia quente por mais tempo, o fluxo biliar tenderá a desaparecer, enquanto mais curtos quentes isquêmicos tempo resulta em um mais estável ou até mesmo aumentarprodução de bile.

As medições do tempo real

A medição direta e freqüente do perfusato por gasometria no essencial, tanto para fins experimentais, bem como a manutenção de condições de perfusão adequada, importante oxigenação e pH. A pressão parcial de oxigénio dissolvido deve ser superior a 700 mmHg, no fluxo, tanto da PV e HA. Pressão de oxigênio Vazão, medido na veia cava, geralmente diminui com o tempo de perfusão, refletindo um aumento de consumo de oxigênio. As taxas de captação de oxigénio pode ser calculada tal como descrito anteriormente e ¹³ variou 0,5-2,2 ml _de O ₂ / min / kg no início da perfusão de 2,4-9,7 ml de O ₂ / min / kg em t = 3 horas (Figura 1C). A queda no pH é observado nos primeiros 30 min (Figura 1D), principalmente como um resultado da libertação de lactato no perfusado. Isto pode ser apoiado por suplementação com bicarbo de sódio a 8,4%nate e depois de cerca de 90 min o pH cai para trás na faixa normal. Comumente, 30-50 mL de bicarbonato de sódio a 8,4% é necessário. Aumento da concentração de lactato rapidamente na primeira 15-30 min, mas começa a falecimento após a primeira hora (Figura 1E).

Medições Post-hoc

Transaminases hepáticas, tais como ALT pode ser medido no perfusado. Nos primeiros 30 min de um grande aumento dos níveis de ALT é geralmente observado que reflecte a lavagem de ALT que foi lançado durante a isquemia (Figura 1F). ALT mostrou boa correlação com o tempo de isquemia quente ^13. Máquina de perfusão aumentou o teor de ATP 2,8 vezes, refletindo um estado de energia de recuperação (Figura 1G). H & E análise histológica revela nenhuma lesão adicional sofridos durante máquina de perfusão (Figura 1H, I). Deve notar-se que o regime de biópsia proposto no presente protocolo é a resfins earch e podem não ser aplicáveis ​​para fins clínicos.

Figura 1:. Avaliação de fígados humanos durante a perfusão máquina de fluxo através da PV e HA durante SNMP (A), a produção de bílis, quantificado por hora de perfusão (B), a taxa de uprate oxigénio (OUR), calculado a partir da diferença de influxo (PV + HA) e saída (veia cava), interrompeu linhas mostram pressões parciais de oxigênio na entrada e saída durante a perfusão (C), pH e lactato durante a perfusão (D, E), liberação de ALT no perfusato (F), ATP teor medido em tecido de biópsias de hora em hora (G) e H & E as manchas do fígado (54 anos de idade DCD, 19 min de isquemia quente, 559 min de isquemia fria) antes de (H) e depois (I) perfusão. Os resultados são apresentados como média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Em uma tentativa de recuperar fígados feridos durante a isquemia, desenvolvemos um sistema SNMP que pode ser empregada após um período de armazenamento refrigerado. Máquina de perfusão Subnormothermic oferece uma alternativa viável para o armazenamento refrigerado convencional, assim como as modalidades de perfusão máquina hipotérmicos e normotérmicas. Existem vários sistemas diferentes; todos oferecem diferentes vantagens e desvantagens ^3,9,20. SNMP permite a perfusão sem uma transportadora de oxigênio, como demanda de oxigênio metabólicas em 21 ° C são atendidas por oxigenação ativa do perfusato.

Embora reduzido em condições subnormothermic, o metabolismo é substancial e requer o apoio de uma solução de perfusão rico em nutrientes. Soluções para perfusão tradicionais, tais como a solução de perfusão máquina Belzer, são geralmente mínima na composição e são projetados para perfusão frio. Williams Meio E tem sido utilizado como um meio de cultura de hepatócitos por muitos anos, e contém componentes que são universais para suportar a função celular, em especial no âmbito ex vivo condições quentes.

As medições efectuadas durante a perfusão máquina são o reflexo da função do órgão. Parâmetros diretamente observáveis, como a produção de bílis e consumo de oxigênio são medições em tempo real que podem ser usados ​​para avaliar a pré-transplante de fígado. Similarmente, os marcadores de isquemia e lesão celular (K +, libertação de lactato) pode ser medida directamente na solução de perfusão e pode ser indicativo de função do órgão ^20. Como a tecnologia de máquina de perfusão desenvolve e atinge aplicação clínica mais ampla, as correlações precisas entre ex vivo função e evolução clínica pode ser feito e parâmetros de perfusão será útil em ajudar decisões para transplante ou rejeitam fígados marginal qualidade. Além disso, como ponto-de ferramentas analíticas cuidados de antecedência, a análise mais sofisticada ficará disponível diretamente durante máquina perfusion ^21.

Neste trabalho, mostramos que os fígados podem ser suportados no sistema SNMP com lesão mínima para o fígado, refletida pela histologia e liberação de ALT. A recuperação funcional do fígado é melhor reflectida pela ATP, o que foi mostrado para correlacionar a viabilidade fígado e é fortemente sugestiva de sucesso do transplante em modelos animais ^22. Ex vivo e recuperação de pré-transplante de enxertos de fígado iria permitir uma expansão significativa do dador piscina fígado, corrigir a disparidade entre a oferta e demanda de fígados de doadores no transplante.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Liver Assist perfusion device	Organ Assist B.V.	Liver Assist
Liver Assist disposable set	Organ Assist B.V.	Liver Assist disposable
Williams’ Medium E	Sigma	W1878–6x500ml
Insulin	Eli Lilly & Co	Humulin R U-100
Penicillin/Streptomycin 5,000 U/ml	Life Technologies	15070-063
L-glutamine	Invitrogen	25030-156
Hydrocortisone	MGH pharmacy	7750500
Carbogen gas tank 95% O2/5% CO2	Airgas	ZO2OX9522000043
Specialty gas regulator	Airgas	Y11244D580
Lactated Ringer’s solution	Baxter	2B2324X
10% neutral buffered formalin	Fischer Scientific	316-155
Toothed Adson forceps	Roboz	RS-5234
Debakey tissue forceps, 7.75”, 2.25 mm	Roboz	RS-7562
Metzenbaum Scissors 7" Curved SureCut Tungsten	Roboz	RS-6965SC
Castroviejo Needle holder 5.5–7”	Fine Science Tools	12565-14
0 blackbraided silk sutures	Ethicon	SA66G
4-0 nylon suture, Nurolon RB1	Ethicon	C554D
Blood gas analysis machine	Siemens	RapidPoint 500
Balance scale	Cole Parmer	EW-10000-12
Pressure display box	Medtronic	66000
Disposable pressure display sets	Medtronic	61000
Handheld thermocouple thermometer and probe	Cole Parmer	EW-91500-04 and EW-08516-55
Acorn-tipped vessel cannula, 4 mm	Medtronic	30005
Irrigation set flush tubing	Hospira	06543-01
Mixing bowl, 4 L	Cole Parmer	EW-07300-40