Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Resumo

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Resumo

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force.

The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

Introdução

Microscopia de força atómica (AFM) gera uma imagem de uma superfície de varrimento através de uma área da amostra, utilizando um braço de suporte com uma ponta muito afiada ^1. O movimento do braço de suporte investiga a topologia de superfície da amostra. AFM tem sido amplamente aplicado para moléculas biológicas - incluindo proteínas, DNA e membranas, devido à sua versatilidade na análise de amostras fixadas no ar ou estado quase nativo em líquido ^2-5.

Para além da sua capacidade de imagiologia de alta resolução em escala nanométrica, o cantilever AFM actua como uma mola para sondar forças de interacção (adesão e repulsão) e as propriedades mecânicas da amostra ^5,6. Isto é conhecido como espectroscopia de força. Neste modo, a sonda se aproxima primeiro da amostra e exerce uma força sobre ele, em seguida, é retraído até que perde o contacto com a amostra (Figura 1A). As curvas geradas mostram força em função da distância do braço de suporte, tanto para a aplicaçãobarata e retração. Várias propriedades, incluindo o módulo de elasticidade para medir a rigidez de um material, e as forças de adesão pode ser derivada.

Bicamadas lipídicas suportados são membranas biológicas modelo que encontram-se no topo de um suporte sólido - geralmente mica, vidro de borosilicato, de sílica fundida, ou oxidado silício ^7. Elas são preparadas utilizando várias técnicas, como a deposição de vesículas, método Langmuir-Blodgett e spin-coating ^8,9. Imagiologia AFM foi utilizado para seguir a formação destas camadas duplas suportados ^10, e sondar diferentes estruturas formadas por membranas de diferentes composições ^11-15.

Execução de espectroscopia vigor em apoiadas resultados bicamadas em um pico na curva de abordagem. Este pico indica a força necessária para perfurar a camada dupla, e é chamada força de avanço. A espessura da bicamada pode também ser medido usando a curva de força ^6. A força típica avanço de bilayersintervalo entre 1-50 nN ^6. Estas propriedades dependem embalagem lípido (fase líquida ou gel) e da estrutura (comprimento da cadeia acilo e grau de insaturação) e alterado pelos agentes activos de membrana ^16. A teoria por trás da ruptura foi explicada ¹⁷ e outros parâmetros experimentais, tais como maciez cantilever, raio de ponta e velocidade de aproximação também afetam a força de avanço ^15,16,18. Espectroscopia de força foi usado para analisar as propriedades de diferentes fases lipídicas ^11,19, dependente da composição alterações ^12,20, bem como os efeitos de outras biomoléculas, tais como péptidos, sobre a estabilidade da membrana ^21.

A orientação plana de bicamadas suportados é vantajoso para a combinação de AFM com outros métodos tais como ressonância ²² e microscopia de fluorescência de plasma de superfície ^11,19 para caracterizar melhor a estrutura e as propriedades das membranas.

Este proto vídeo detalhadacol destina-se a preparar bicamadas lipídicas suportados usando deposição de vesículas e analisá-los com a AFM e espectroscopia de força. Enquanto vesículas de diferentes tamanhos podem ser utilizados para preparar bicamadas, este protocolo concentra-se em pequenos e grandes vesículas unilamelares. Bilayers suportados que separam em fase líquida ordenou (L _o) e (L _d) fases líquidas desordenados foram caracterizados ^11,15. A membrana é composta de di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC), esfingomielina (SM), e colesterol (Chol) a 2: 2: 1. Esta composição modelos as jangadas lipídicas, que são propostas para se comportar como plataformas importantes para o tráfico de proteína e de triagem, sinalização celular e outros processos celulares ^23,24.

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Protocolo

1. Preparação de Bicamadas Lipídicas suportados (SLB) ^11,12,21

1. Preparação de mistura de lípidos e de Vesículas multilamelares Suspensões
   1. Preparar os seguintes tampões de antemão.
      1. Preparar tampão PBS a concentrações de 2,7 mM de KCl, 1,5 mM _de KH ₂ PO _4, 8 mM de Na ₂ HPO _4, e 137 mM de NaCl, pH 7,2.
      2. Prepare SLB (suportado bicamada lipídica) em concentrações de tampão de 150 mM de NaCl, 10 mM de HEPES, pH 7,4.
      3. Prepara-se uma solução de 1 M de _CaCl2.
   2. Dissolve-se os seguintes lípidos em clorofórmio a uma concentração desejada: por exemplo, di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC) a 25 mg / ml, esfingomielina (SM) a 25 mg / mL e colesterol (Chol) a 10 mg / ml.
   3. Aqui 18,38 ul de DOPC, 17,10 mL de SM e 11,30 mL de Chol para fazer uma solução com 1 mg de lipidos totais na proporção de 2: 2: 1 de DOPC: razão molar Chol: SM. Variar os volumes em conformidade com base no concentrations dos lipídios preparadas em 1.1.2. No entanto, manter a proporção molar de 2: 2: 1 de DOPC: SM: Chol, como alterar a relação molar irá alterar as características de fase da membrana ^25.
   4. Misture a solução completamente por agitação em vórtex. Adicionar um corante fluorescente lipídica a 0,05% molar, se alguém deseja visualizar a bicamada por um microscópio de fluorescência.
      Nota: A família de dialkylcarbocyanines de cadeia longa, como o fez, DII e DiO abrangem uma ampla gama de comprimentos de onda e pode ser preferencialmente utilizadas para etiquetar membranas lipídicas. Alternativamente, lípidos marcados com fluorescência, assim como a rodamina-fosfatidiletanolamina ou BODIPY-colesterol pode ser utilizado. Em qualquer caso, a concentração do corante deve ser optimizado de acordo com a configuração de microscopia, mantendo em mente que as altas concentrações do fluoróforo ligado ao lípido pode alterar o comportamento de lípido ^19.
   5. Seque o clorofórmio utilizando gás _N2 (ou qualquer gás inerte disponíveis, tais como Ar e He).
   6. Além disso seco tele lípido mistura sob vácuo durante pelo menos 1 h.
      Nota: Se armazenar esta mistura de lípidos, purgar o ar com o gás inerte _(N2, Ar ou He) e armazenar a -20 ° C. Alíquota excesso de lípidos-em-clorofórmio em pequenos frascos castanhos. Secá-las de uma maneira semelhante como a mistura de lípidos, deslocar o ar com o gás inerte _(N2, Ar ou He) e armazenar a -20 ° C.
   7. Dissolve-se os lípidos secos em tampão PBS até uma concentração de 10 mg / ml.
   8. Vortex-se a mistura vigorosamente durante cerca de 20 segundos a 1 min para obter uma suspensão turva, contendo vesículas multilamelares. Certifique-se de que não há a filmes lipídicos adira às paredes do frasco.
   9. Distribuir esta suspensão em alíquotas de 10 ul (1 mg de lípido torna alíquotas de 10).
   10. Armazenar a -20 ° C até à sua utilização.
2. Preparação de Vesículas Unilamelares
   Nota: Os vários tamanhos de vesículas unilamelares podem ser preparadas utilizando o método de sonicação ou o método de extrusão. Sonication usa sound energia para agitar a mistura e separar as camadas da suspensão multilamelar. Isto é indicado por limpar da suspensão turva. Extrusão obriga as vesículas multilamelares de passar através de um filtro de membrana com um tamanho de poro definido.
   1. Método de sonicação
      1. Pegue os 10 ul de suspensões lipídicas multilamelares e adicionar 150 mL de tampão SLB.
      2. Transferir a mistura em pequenos (2 ml) frascos de vidro tapados e selar com Parafilm.
      3. Sonicar a mistura à temperatura ambiente num banho de ultra-sons durante 10 min ou até se tornar clara, para se obter pequenas vesículas unilamelares (SUVs, abaixo de 50 nm de diâmetro).
   2. Método de extrusão
      1. Pegue os 10 ul de suspensões lipídicas multilamelares e adicionar 150 mL de tampão SLB.
      2. Transferir a suspensão para um tubo criogénico.
      3. Congelar a suspensão de lípido através da submersão do tubo criogénico por alguns segundos em azoto líquido.
      4. Descongele osuspensão de lípido através da submersão do tubo criogénico num banho de água à temperatura ambiente ou a 37 ° C durante alguns minutos. Repetir os passos de congelamento e descongelamento, pelo menos, 10 vezes.
      5. A fim de extrusão da suspensão de lípido, utilizar uma membrana de policarbonato com 200 nm de tamanho de poro (outros tamanhos dos poros estão disponíveis como, 100 nm ou 400 nm) e um dispositivo de extrusão comercial ^26.
         Nota: Actualmente, existem dois dispositivos de extrusão comercialmente disponíveis: um extrusor manual está disponível para pequenos volumes (200 uL para alguns mL). Neste caso, a amostra é submetida a extrusão através da membrana, empurrando manualmente a suspensão e para trás entre duas seringas. Dependendo do fabricante, alíquotas de lípidos teriam de ser combinadas para atingir o volume mínimo do conjunto acima. Para volumes maiores (até 50 ml) dispositivos mais sofisticados são utilizados em que a suspensão é forçada através da membrana de policarbonato utilizando gás comprimido. Condições de set-up e extrusão pode mudar de acordo com o model. Consulte as instruções do fabricante antes de usar. Este protocolo refere-se ao extrusor manual para pequenos volumes.
      6. Equilibrar a extrusora em água por passagem da água através da extrusora. Imergir a membrana na água.
      7. Colocar a membrana entre os dois pistões, montar o dispositivo e equilibrar em tampão, fazendo passar o tampão através da extrusora, a partir de uma seringa para a outra. Este passo permite adicionalmente ensaios de leakiness do sistema. Se ele vazamentos, desmontar e remontar-lo novamente alterando a membrana.
      8. Tome a suspensão lipídica usando uma seringa da extrusora ("lado sujo ').
      9. Introduzir a seringa que contém a suspensão de lípido em uma câmara e a seringa vazia na câmara oposta.
      10. Empurre a seringa em uma extremidade. Filtrar a solução através da membrana e para dentro da seringa oposta. Este é o passo 1 ^r.
      11. Passá-lo através da membrana para um total de 31 vezes taisque a solução acaba na seringa adversária ('lado limpo').
          Nota: Verifique a membrana após a extrusão. Se ele foi quebrado, então o processo de extrusão não foi bem sucedida e necessita de ser repetida.
      12. Esvaziar a seringa num pequeno tubo. As grandes vesículas unilamelares (LUV) são estáveis ​​durante 1-2 dias se mantida a 4 ° C.
3. Preparação de Mica e Lamelas
   1. Lavar lamelas primeiro em água e depois em etanol. Ar seco.
   2. Tome discos de mica e descolar a camada exterior usando fita adesiva.
   3. Coloque o disco de mica sobre a lamela. Colas ópticas transparentes são ideais para que se possa verificar as camadas duplas com um microscópio de fluorescência.
   4. Anexar cilindros de plástico (2,5 cm de diâmetro externo, diâmetro interno 2 cm, e 0,5 cm de altura), utilizando óptica cola / graxa. Certifique-se de que tudo está selado e que não há fugas. Use graxa quando querendo voltar a utilizar os cilindros como eles podem ser facilmente retirado do the lamela e lavados. As dimensões dos cilindros de plástico depender do tamanho do suporte do braço de suporte de AFM e devem ser ajustados em conformidade.
4. Deposição de Unilamelares vesículas em suporte sólido
   1. Pipetar toda a solução de lipossomas directamente sobre a mica. Adicionar mais tampão SLB para chegar a um volume de 300 ml.
   2. Adicionar 0,9 ml de solução 1 M de cloreto de cálcio para alcançar uma concentração final de 3 mM de Ca ^2+.
   3. Incubar a 37 ° C durante 2 minutos e depois a 65 ° C durante pelo menos 10 min. Sempre cobrir as bicamadas com tampão. O contato com as bolhas de ar e ar irá destruí-lo. Durante a incubação, adicionar mais tampão, se necessário, especialmente se a incubação a temperaturas mais elevadas.
      Nota: As temperaturas de incubação variam de acordo com as misturas de lípidos e as fases necessárias. É necessário um período de incubação de pelo menos 10 minutos para formar bicamadas suportados, mas pode ser mais longo, dependendo da temperatura e composição.
   4. Lavagema bicamada com quente (65 ° C) Tampão de SLB 15-20 vezes para remover o cálcio e vesículas não fundidas. Tome cuidado extra durante as etapas de lavagem para manter a bicamada sob tampão e pipeta suavemente a solução de lavagem para evitar a destruição da camada dupla.
   5. Bilayers legal suportados à temperatura ambiente antes medições AFM. Isto é necessário para formar as diferentes fases da membrana, bem como minimizar o desvio térmico no instrumento.

2. Microscopia de Força Atômica Medidas ^11,12

1. Imagem
   Nota: Execute projeção de imagem atômica no modo de contato ou o modo de tocar. Imagem suportado bilayers em solução; Não deixe que a solução para evaporar completamente, pois isso irá destruir as camadas duplas. Como era de se estar trabalhando com tampão, observe as precauções de segurança para garantir que qualquer parte AFM está protegido contra derramamento de líquidos.
   1. Selecione um cantilever macio (abaixo de 0,2 N / m constante da mola é aconselhável) e montá-lo para tele AFM. A escolha da rigidez cantilever é mais crítico para a espectroscopia de força (e isso será discutido mais tarde).
   2. Monte a amostra no palco AFM e certifique-se que todos os módulos vibração de isolamento estão ligados. Aguarde pelo menos 15 minutos para equilibrar e reduzir a dispersão térmica do sistema. Dependendo da AFM set-up, especificações de ajuste e de imagem podem variar. Consulte o manual do fabricante.
   3. Aproxime-se da amostra com a ponta do AFM até que o contato.
   4. Desde bicamadas lipídicas são geralmente 4 nm de altura, utilize o Z-gama do instrumento que lhe dará a mais alta resolução z (por exemplo, 1,5 mm).
   5. Selecione uma região para a imagem. Para obter uma visão geral da bicamada lipídica, uma 50 mm x 50 mm ou 25 mm x 25 mm região será um bom ponto de partida para a imagem. Se aparecer pequenos recursos, imagem uma lata em áreas menores (10 mm x 10 mm, ou 2 mm x 2 mm). A escolha de uma área de imagem depende também da r trabalhandoange do scanner piezoeléctrico. Por favor, consultar o manual do instrumento para isso.
   6. Como camadas duplas são muito frágeis, ajustar o ponto da ponta do AFM conjunto durante a imagem para manter a força no mínimo e corrigir deriva térmica, mantendo contato com a amostra. No modo de contato, minimizar o set point. No modo de tocar, maximizar o set point.
   7. Processar imagens por encaixando cada linha de digitalização para funções polinomiais de nivelamento. Executa a remoção linha para verificações que perdem contato com a membrana usando o software proprietário da empresa de fabricação de AFM.
2. Força Spectroscopy
   1. Calibrar o cantilever seguindo as instruções de acordo com o protocolo do fabricante. A calibragem permite a conversão do sinal eléctrico dos fotodiodos de força (Figura 1B).
      1. Calibrar a sensibilidade da ponta para medir a deflexão de movimento piezo-z (em unidades de comprimento) em vez do sinal eléctrico em volts.
         Nota: AFM detecta mudanças na deformação do cantilever usando um laser reflectida na parte traseira do braço de suporte. O laser atinge um fotodíodo que pode detectar a posição espacial do ponto de laser. Uma mudança na deflexão do braço de suporte, uma vez que se dobra quando em contacto com a amostra é detectada por este fotodíodo como "de deflexão vertical", e isto é nas unidades de tensão. Uma vez que o braço de suporte é movido pelo piezo-z, a deflexão vertical está relacionado com o movimento na z-piezo. A relação entre a deflexão vertical e z movimento é chamado de sensibilidade e converte a tensão de distância.
      2. Calcula-se a constante de mola cantilever usando o método de frequência de ruído térmico, geralmente incorporados no software AFM. Neste método, traçar a amplitude de vibração de ruído em relação à frequência de oscilação, a criação de uma trama densidade espectral de potência. Este gráfico irá mostrar um pico em torno da freqüência de ressonância. A freqüência em que o i amplitudeé a maior é a freqüência de ressonância. Ajustar uma função Lorentzian em torno do pico para calcular automaticamente a constante de mola pelo software. Alguns recursos úteis para a teoria do método de ruído térmico são dadas nas referências ^27-30.
   2. Depois de imagiologia uma área da bicamada, seleccionar uma região x 5 mm 5 mm na bicamada para realizar espectroscopia de força.
   3. Configure o AFM para que ele leva curvas de força em uma grade de que a região de 16 x 16. Isso resulta em 256 curvas força por região. O espaço entre dois pontos vizinhos deve ser suficiente para evitar que a área de membrana sendo sondado por um ponto coincidiria com o próximo ponto. Isto é dependente do raio da ponta. Uma distância de 100 nm entre dois pontos seria ideal. Divide x 5 uM a região 5 um de 16 x 16 em grade. Dependendo do tamanho da fase, pode-se seleccionar uma região mais pequena ou maior, e, em seguida, ajustar o tamanho da grelha em conformidade.
   4. Definir deslocamento z piezo-a400 nm. Isso determina o alcance máximo do movimento do z-piezo. Ele deve ser suficientemente grande para garantir que o braço de suporte está totalmente retraída a partir da amostra entre as medições.
   5. Definir velocidade de aproximação de 800 nm / seg e retrair a velocidade para 200 nm / seg. Utilize uma velocidade de aproximação entre 400 a 6000 nm / seg dependendo da composição da bicamada lipídica e da fase a ser estudado ^6,16.
   6. Depois de configurar todos os parâmetros, adquirir curvas força, pressionando o botão "run" do software AFM.
   7. Salvar curvas de força como força vs. curvas de altura (uma medida do movimento z-piezo). Isso não leva em conta a curvatura do cantilever quando em contacto com a amostra. Durante a etapa de processamento de dados, o software permite a correção da AFM para cantilever dobrar para obter força vs. curvas de separação ponta-amostra (Figura 1C), o que dará valores adequados para a espessura da camada dupla. Os valores de correcção são geralmente incorporados na calibradoção, que são guardadas com cada curva de força. Calcular separação ponta-amostra subtraindo a deflexão vertical do movimento piezo a um determinado ponto.
      Nota: O pico na curva da força de aproximação (o valor da força vai para baixo, mesmo se o movimento cantilever ainda está no ciclo de abordagem) é a força de ruptura da membrana, enquanto que a diferença entre a posição do pico e a posição do ponto em que a força começa a levantar-se de novo fornece a espessura da membrana.
   8. Adquirir, pelo menos, 500 curvas de força para cada condição para obter boas estatísticas. Traçar um histograma dos valores usando programas como origem ou MatLab, e se encaixam os histogramas para uma distribuição de Gauss para obter o pico e largura da distribuição.

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Resultados

Bicamadas lipídicas constituídas suportados de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) foram fotografadas em AFM (Figura 2 CA). Devido à composição de lípido, foram observados SM / Chol-rico e L _o DOPC-ricas fases G _d. O perfil de altura a partir da imagem AFM pode fornecer informações importantes sobre a estrutura da membrana. Ao olhar para o perfil de altura, a espessura da bicamada pode ser medido na presença de defeitos na membrana (Figura 2B), ou a diferença de alt...

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Discussão

SLBS compostos de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) foram formadas em mica após adsorção vesícula e ruptura induzida por cloreto de cálcio. Esta composição de lípido separado em L e L _{o d} fases. A fase L _o é enriquecida em esf ingomielina e colesterol e é menos fluido / mais viscoso (Figura 1A) do que a fase L _d ^11. A separação de fase a partir de L _o G _d manifesta como estruturas circulares elevados acima da circundante (Figur...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850375P	Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sphingomyelin (Brain, Porcine)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860062P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Cholesterol	Avanti Polar Lipids, Inc.	700000P	Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20 °C. Visit here for more information on storage and handling.
Sodium chloride (NaCl), 99.8%	Carl Roth GmbH + Co. KG	9265.1
Potassium chloride (KCl), 88%	Sigma	P9541
Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), >99%	AppliChem GmbH	A1046
Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%	Carl Roth GmbH + Co. KG	3904.1
Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade	AppliChem GmbH	A4689
HEPES, molecular biology grade	AppliChem GmbH	A3724
Glass coverslip, 24 x 60 mm, 1 mm thickness	Duran Group	2355036
Punch and Die Set	Precision Brand Products, Inc	40105
Optical Adhesive	Norland Products, Inc.	NOA 88	Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.
[header]
Mica blocks	NSC Mica Exports Ltd.		These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.  Always handle mica with gloves or tweezers.
Laboratory Equipment Grease	Borer Chemie AG	Glisseal N
Liposome Extruder	Avestin	LiposoFast-Basic	As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.
Adhesive Tape	3M	Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)
Bath Sonicator	Bandelin Sonorex Digitec	DT-31	No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (Data sheet)
Silicon Nitride AFM Cantilever	Bruker AFM Probes	DNP-10	Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.
AFM	JPK	JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200