Um modelo de mouse subcrónica e Mild Derrota social Estresse para Compreender déficits comportamentais e fisiológicas induzida por estresse

Resumo

Aqui, métodos para desenvolver um modelo de mouse subcrónica e leve estresse derrota social são descritas e utilizadas para investigar as características patogênicas de depressão, incluindo hyperphagia- e sintomas polidipsia-like seguintes aumento do peso corporal.

Resumo

Stressful life events often increase the incidence of depression in humans. To study the mechanisms of depression, the development of animal models of depression is essential. Because there are several types of depression, various animal models are needed for a deeper understanding of the disorder. Previously, a mouse model of subchronic and mild social defeat stress (sCSDS) using a modified chronic social defeat stress (CSDS) paradigm was established. In the paradigm, to reduce physical injuries from aggressors, the duration of physical contact between the aggressor and a subordinate was reduced compared to in the original CSDS paradigm. sCSDS mice showed increased body weight gain, food intake, and water intake during the stress period, and their social behaviors were suppressed after the stress period. In terms of the face validity of the stress-induced overeating and overdrinking following the increased body weight gain, the sCSDS mice may show some features related to atypical depression in humans. Thus, a mouse model of sCSDS may be useful for studying the pathogenic mechanisms underlying depression. This protocol will help establish the sCSDS mouse model, especially for studying the mechanisms underlying stress-induced weight gain and polydipsia- and hyperphagia-like symptoms.

Introdução

Muitos tipos de eventos estressantes ocorrem ao longo da vida dos seres humanos. O estresse excessivo muitas vezes leva a conseqüências fisiológicas prejudiciais em humanos e animais. Nos seres humanos, eventos estressantes são os principais fatores de risco para a precipitação de transtornos psiquiátricos, como depressão ^1. A Global Burden of Disease estudo indicaram que a depressão é uma das doenças mais incapacitantes em termos de anos de vida ajustados por incapacidade (DALY) e anos vividos com incapacidade ^2. Além disso, a depressão representa a maior proporção de DALYs suicidas ^3. Pessoas que sofrem de depressão têm dificuldade em gerir as suas vidas, e, como resultado, sua qualidade de vida, muitas vezes piora. Por conseguinte, existe uma forte necessidade de desenvolver agentes terapêuticos eficazes para melhorar a qualidade de vida desses pacientes.

Muitos estudos têm sido realizados sobre os principais transtornos depressivos, e revelaram que a contribuição genética para a doença susceptibility é de cerca de 30-40%, a qual é explicada pelos efeitos de múltiplos loci de efeitos pequenos ^4. Por causa dos mecanismos patogénicos subjacentes complexos depressão, a etiologia detalhada da doença permanece elusiva. Os relatórios clínicos indicam que existem subtipos de depressão, como melancólico e atípico depressão ^5, que mostram reduzidas e aumento de peso corporal, respectivamente ^6. Apesar de 25-30% e 15-30% dos pacientes com depressão representam características melancólicas e atípicos puros, respectivamente, a maioria deles tem características em comum de ambos os subtipos ^7. Por conseguinte, a depressão major tem uma ampla variedade de sintomas. A fim de encontrar e desenvolver terapêuticas biomarcadores objectivas para os vários tipos de depressão em seres humanos, é importante estabelecer diversos modelos animais diferentes da depressão ^8.

Os modelos animais de depressão foram estabelecidas usando várias aproximações incluindo aprendidodesamparo, estresse leve crônico imprevisível e estresse social derrota crônica (CSDS) ^9-12. Toyoda e colaboradores estabeleceram os modelos CSDS de ratos e ratinhos ^{de 13-17,} a fim de elucidar o metabolismo e comportamentos que estão associados com a depressão. Tendo em conta que modelos animais de depressão são avaliados pela validade de face ^18, o contexto em que o modelo está estabelecido é importante. Além disso, Golden et al. ^{19 relataram} os métodos para a criação de ratinhos CSDS em detalhe. Sabe-se que as deficiências de comportamento social de ratinhos CSDS pode ser recuperado por tratamento crónico, mas não pelo tratamento agudo com antidepressivos, e que eles compartilham sintomas semelhantes aos dos doentes com depressão, em termos da regulação da neurotrófico derivado do cérebro fator de ^seis.

Goto et al. ¹³ previamente desenvolvido o subcrónica e leve estresse social derrota (sCSDS) modelo de mouse, modificando os métodosde Golden et al. ^19. Os ratos sCSDS mostrar sintomas polydipsia- e hiperfagia-like seguintes ganhos de peso corporal e índice de água aumentou ^corpo 13. Neste relatório, o protocolo para o estabelecimento do modelo de rato sCSDS é fornecido e discutimos a utilidade deste modelo.

Protocolo

Os estudos com animais foram aprovados pelo e cumpridas as orientações, tanto do Animal Care e Use Committee da Universidade de Ibaraki e do Ministério da Educação Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia (MEXT), Japão (Notificação No.71). Uma descrição completa do protocolo é demonstrado na Figura 1.

1. Aparelho

1. Prepare dois tipos de gaiolas: uma única gaiola (largura [W] × profundidade [D] × altura [H] = 143 milímetros × 293 milímetros × 148 mm), e uma "derrota sociais (SD)" gaiola (W × D × H = 220 mm × 320 mm × 135 milímetros).
2. Como mostrado na Figura 2, a gaiola SD dividir em dois compartimentos com uma placa acrílica transparente divisor (5 mm de espessura) com 15 furos circulares (3 × 5 matriz: 8 mm de diâmetro).
3. Obter chips de madeira-de barbear feitos de abetos, purificada por dieta pelotas do alimento, e uma garrafa de água potável. Além disso, obter toalhas de papel, uma máscara e luvas de látex.
4. Para o teste de interação social, preparar uma arena de campo aberto (W × D × H = 40 centímetros x 40 centímetros x 40 cm) feitos de cloreto de polivinilo cinza, um peso de aço (190 g), e uma caixa de interação plástico (W × D × H = 10 centímetros x 10 centímetros × 13 cm; 100 g) com três janelas de malha de arame (W × D = 5 centímetros x 5 cm) (Figura 3).
5. Coloque uma câmara CCD (2,8-12 mm; F ​​= 1: 1,4; 1/3 polegada CCD) e um sistema de seguimento automático na sala de testes de comportamento na instalação para animais. Coloque uma prateleira apropriado para as gaiolas de rato na sala de testes de comportamento que se habituem os ratos para o ambiente da sala de teste durante pelo menos 30 min.

2. A habituação ao Meio Ambiente

1. Use macho C57BL / 6JJmsSlc (B6) ratos que são 7 semanas de idade e do sexo masculino Slc: ICR (ICR) ratos que são mais de 5 meses de idade e entregar para a instalação de uma empresa de criação de animais.
2. Independentemente mover dois grupos de ratinhos B6 (n= 12 em cada grupo) para a instalação; utilize um grupo (B6 ratos screener) para o rastreio de ratinhos ICR agressivos e outro grupo (sujeito ratos B6) para o desenvolvimento do modelo sCSDS.
3. Introduzir ratinhos ICR (n = 12) para a instalação, a fim de rastrear seus comportamentos agressivos.
4. Casa os ratos individualmente em gaiolas individuais durante 1 semana sob um ciclo de luz-escuro de 12 h (cerca de 100 lux de luz fluorescente, luzes acesas às 08:00) com temperatura constante (cerca de 23 ° C) e os níveis de humidade (cerca de 40%) de modo a habituar-los para o ambiente. Particionar cada gaiola, colocando placas de plástico de cor branca, entre as gaiolas para que os ratos não são afetados pelos comportamentos dos ratos vizinhos.
5. Faça purificada por dieta grãos de ração e água de osmose reversa disponível ad libitum. Use AIN-93G Chow porque os ingredientes de outros peletes de dieta não purificada pode variar.
6. Medir o peso corporal, a ingestão de alimentos (FI), e ingestão de água (WI) dos ratinhos todos os dias. Calcule a bganho de peso Ody (BWG) desde o dia inicial.

3. Triagem de Aggressive ICR Mice

1. Depois de habituação para 1 semana como mencionado acima, a tela de ratinhos ICR (residente), utilizando testes de residente-intrusão para um julgamento 3 min com ratos screener B6 (intruso; 8 semanas de idade) no período da tarde (14: 00-17: 00) sob a iluminação de cerca de 300 lux na sala de habitação.
   1. Especificamente, teste cada ratinho ICR para três ensaios por dia durante 5 dias consecutivos (15 ensaios no total) em relação a muitos ratos B6 diferentes quanto possível para encontrar que ratinhos ICR mostram alta agressividade para com os intrusos. Durante os testes, registrar o ataque latência e duração do comportamento agressivo (movimentos rápidos com ataque cortante).
2. Identificar ratinhos ICR hiper-agressivo, verificando as feridas danos em ratos intrusos B6 após cada tentativa.
3. Calcular a proporção de ensaios em que a latência ataque é inferior a 30 segundos, como um primeiro índice de pontuação da agressão.
4. Calculate a proporção de ensaios em que a latência de ataque é menor do que 3 minutos, como um segundo índice de pontuação da agressão.
5. Avaliar os escores de agressividade desde o primeiro índice. Use o segundo índice quando o primeiro índice é igual.
6. Selecione os ratinhos ICR que tiveram pontuações mais altas de agressão sem comportamentos hiper-agressivo como ratinhos ICR agressivos. Use os ratinhos ICR agressivos repetidamente ao longo do próximo conjunto de experimentos até aproximadamente 12 meses de idade; no entanto, realizar o processo de triagem para ratos ICR agressivos como descrito acima antes de cada experimento para confirmar a agressividade dos ratinhos ICR.
7. Depois de cada sessão do rastreio, registrar o grau de lesão dos ratos screener B6. Se um mouse estiver ferido, isolar o mouse em uma única gaiola e observar o progresso, verificando seu ganho de peso corporal, a ingestão de alimentos e ingestão de água. No caso de feridas graves, que afectam a fisiologia e comportamento em ratinhos, sacrificar-los de acordo com I locaisOrientações ACUC.

4. sCSDS

1. Introduzir ratinhos B6 sujeita 7 dias antes (dia -6) no dia da exposição inicial de stress (dia 1) e casa os ratos individualmente em gaiolas individuais para habituar-los para o ambiente.
2. Três dias antes do dia 1 (no dia -2), mover os ratinhos ICR agressivas para um compartimento de cada gaiola de SD, o qual é dividido por um divisor de acrílico para permitir que os ratinhos estabelecer seus territórios nas gaiolas SD (o mesmo número de sujeitos B6 ratos).
3. Separe as gaiolas SD usando placas de separação de cor branca, como no estado de gaiola única descrito acima.
4. Para ratinhos B6 não-esforçado de controlo, preparar gaiolas SD (metade do número de murganhos) para manter os ratos aos pares; colocar os dois ratos em cada compartimento dividido pelo divisor numa gaiola SD durante 10 dias.
5. Após as medições diárias BWG, FI, e WI no dia 1, os ratos local sujeito B6 em um dos compartimentos das gaiolas SD (home-gaiola do residente) no afternoon (14: 00-16: 00) com iluminação de cerca de 300 lux na sala de habitação e medir o tempo de contato físico a partir da primeira mordida ataque para completar o teste residente-intruso.
6. No dia 1, defina o tempo de contato físico para 5 min da primeira mordida ataque e ter observadores contar o número de picadas de ataque de ratos ICR que são direcionadas preferencialmente na parte de trás ou flancos do oponente como descrito por Miczek et al. ^{20 a} determinar o grau de stress físico para ratinhos B6.
7. Após o tempo de contato físico, B6 resgate sujeitos, e verificar e registrar o seu estado de pele e feridas. Em seguida, colocar os ratinhos B6 para outro compartimento ao lado dos ratinhos ICR nas gaiolas SD até que a exposição ao stress físico no dia seguinte.
8. Porque o divisor de acrílico na gaiola SD é transparente e contém furos, expor ratinhos B6 sujeita a várias tensões emocionais, incluindo visual, auditiva e estímulos olfativos, dos ratinhos ICR no compartimento vizinhomento da gaiola SD durante 24 horas todos os dias.
9. Medir a BWG, FI, e WI de ratinhos B6 controle diário e, em seguida, colocá-los em cada compartimento nas gaiolas SD para 1 dia.
10. No dia 2, após as medições diárias de BWG, FI, e WI, introduzir ratinhos B6 sujeitos nos territórios de outros ratinhos ICR para expô-los ao estresse físico.
11. Defina a duração do contato físico em 4,5 min a partir da primeira mordida ataque no dia 2, e contar o número de picadas de ataque.
12. Mova ratinhos B6 controle em diferentes compartimentos e mudar as combinações de pares, a fim de embaralhar a colocação e parceiro dos pares de cada dia.
13. Diminuir a duração do contacto físico por 0,5 min por dia, de modo que a duração do dia em 10 é definida como 0,5 min a partir do primeiro ataque mordida.
14. No dia 7, substituir cerca de metade das aparas de madeira em todos os compartimentos nas gaiolas SD.
15. Após a exposição ao stress físico último no dia 10, mover-se ratinhos B6 sujeito em gaiolas individuais. Similar aos ratinhos B6 sujeitos, mova o controle camundongos B6 em gaiolas individuais no dia 10.
16. Se um rato ICR não mostra quaisquer picadas de ataque até 5 minutos em cada tentativa nos dias 1 a 10, pôr termo ao julgamento. Substituir o rato ICR com ratinhos ICR agressivos peças e realizar um julgamento alternativa para o mouse assunto B6.
17. Se um mouse estiver ferido, isolar o mouse em uma única gaiola e observar o progresso, verificando seu ganho de peso corporal, a ingestão de alimentos e ingestão de água. Siga as diretrizes IACUC para analgesia. No caso de ferimentos graves que afetam a fisiologia e comportamento em camundongos, sacrificá-los de acordo com as directrizes locais IACUC.

5. social Prevenção de teste (Teste de Interacção social)

1. Realizar testes comportamentais para evitação social na parte da manhã (09: 00-12: 00) no dia 11.
2. Trinta minutos antes do ensaio, transferir as gaiolas dos ratinhos de controlo e sujeitos B6 para uma prateleira (luz fraca de menos de 1 lux) na comportamentalquarto sob uma iluminação de teste inferior a 20 lux para lhes permitir habituar ao ambiente.
3. Para reduzir os efeitos de ordem, alternadamente testar ratinhos de controlo e sujeitos B6.
4. Limpar uma arena de campo aberto (iluminada com uma luz de 20 lux no centro do campo) e uma caixa de interacção plástico usando toalhas de papel embebidos com etanol a 70% antes do teste comportamental para cada rato para remover fezes, urina, e todos os odores .
5. Coloque um rato desconhecido ICR (não usado como um agressor) a partir de uma única gaiola perto do aparelho de campo aberto.
6. Coloque um rato B6 para o campo aberto da caixa de interacção vago, como mostrado na Figura 4. Monitorar e analisar o seu comportamento durante 2,5 minutos usando o sistema de análise automática (descrito no passo 5.10).
7. Após o primeiro ensaio, remover o rato B6 do campo e colocá-lo na sua gaiola de origem.
8. Em seguida, coloque o macho desconhecido ICR rato (meta social) na caixa de interação e, em seguida, introduzir a B6rato para o campo aberto e monitorar o seu comportamento durante 2,5 min.
9. Após a segunda tentativa, retornar tanto a B6 e ratinhos ICR para as suas gaiolas, e limpar o domínio da interacção e a caixa, como mencionado acima.
10. Repita essas etapas para cada ratinho B6 para testar o seu comportamento social. Durante cada ensaio, ficha top-view de filmes usando uma câmera CCD.
    1. Após os testes comportamentais, calcular o tempo gasto na zona de interacção (em segundos) e na zona de canto (em segundos) para cada teste, como mostrado em Goto et ai. ^13. Julgar a posição do rato com base no centro do rato.
    2. Calcular a pontuação de interação social como 100 × (tempo de interação, com alvo) / (tempo de interação, sem alvo), seguindo os métodos publicados em Krishnan et al. ^21.

Resultados

Para monitorizar o grau de stress físico ao longo dos períodos de 10 dias, o número de picadas de ataque em ratos ICR foi contado manualmente por um investigador. A Figura 5A indica os valores individuais para o número de picadas de ataque recebidos. Houve grande variabilidade na fase inicial (cerca de 10-120 mordidas no dia 1), mas essa variabilidade foi reduzida na fase posterior (aproximadamente 5-20 mordidas no dia 10). Figura 5B indica que o número médio de ataque bites receb...

Discussão

Houve diferenças definitivas no peso corporal entre sCSDS ratos e camundongos CSDS submetidos ao protocolo padrão CSDS (5 a 10 min de contato físico com os agressores por dia) ^19. Os ratos mostraram aumento sCSDS BWG durante o período de stress, enquanto que os camundongos normais CSDS mostraram uma diminuição no peso corporal durante o período de estresse ^21,22,23. Há uma diferença substancial entre os dois protocolos em termos da duração total do contato físico com os agressores duran...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
single cage	Charles River Laboratories Japan		width [W] × depth [D] × height [H] = 143 × 293 × 148 mm
M cage	Natsume Seisakusho		W × D × H = 220 × 320 × 135 mm
Whiteflake	Charles River Laboratories Japan		Wood-shaving chips made from spruce trees
AIN-93G	Oriental Yeast		purified-diet food pellets
Kimtowel	Nippon Paper Crecia Co.		Paper towels
open-field arena	O’Hara & Co.		made of gray polyvinylchloride