Um Sistema Organotípicas alta taxa de transferência para Caracterização de Drogas de sensibilidade de células de mieloma múltiplo primárias

Resumo

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Resumo

Neste trabalho, descrevemos uma nova abordagem que combina ensaios ex vivo de sensibilidade a drogas e análise de imagem digital para estimar chemosensitivity e heterogeneidade de mieloma múltiplo células derivadas de pacientes (MM). Esta abordagem consiste na sementeira de células primárias MM recentemente extraídos a partir de aspirados de medula óssea para as câmaras de microfluidos aplicadas em placas de poços múltiplos, cada um consistindo de uma reconstrução do microambiente da medula óssea, incluindo a matriz extracelular (colagénio ou matriz de membrana basal) e estroma (paciente- as células estaminais mesenquimais derivadas) ou células endoteliais de origem humana (HUVECs). As câmaras são drogados com diferentes agentes e concentrações, e são gravadas sequencialmente durante 96 horas por meio de microscopia de campo claro, em um microscópio motorizado equipado com uma câmera digital. Software de análise de imagem digital detecta as células vivas e mortas da presença ou ausência de movimento da membrana, e gera curvas de alteração da viabilidade como uma função óf concentração de fármaco e o tempo de exposição. Usamos um modelo computacional para determinar os parâmetros de quimio-sensibilidade da população do tumor para cada droga, bem como o número de sub-populações apresentam-se como uma medida da heterogeneidade de tumores. Estes modelos adaptados para o paciente pode, então, ser usado para simular regimes terapêuticos e estimar a resposta clínica.

Introdução

O objectivo deste método é para caracterizar a sensibilidade à droga de mieloma múltiplo (MM), as células primárias a um painel de agentes ex vivo, tão próximo quanto possível das condições fisiológicas, e com suficiente precisão que estes resultados podem ser usados ​​para identificar, resistente à quimioterapia sub populações dentro a carga tumoral e, em última instância, para parametrizar modelos computacionais desenvolvidos para estimar a resposta clínica.

Modelos computacionais são ferramentas poderosas para analisar sistemas complexos, tais como interações cancer-host-terapia. No entanto, os modelos são apenas tão bom quanto os dados utilizados para parametrizar-los. Infelizmente, a maioria dos dados disponíveis na literatura não podem ser utilizados na sua forma actual para parametrizar tais modelos, uma vez que muitas vezes são obtidos em condições experimentais que se excluem mutuamente. Assim, novas experiências são muitas vezes necessários com o objetivo de obter o conjunto de parâmetros experimentais necessários. A maioria dos ensaios de viabilidade, no entanto, são destrutivos e thnos limitada a um pequeno número de pontos de tempo, muitas vezes, apenas um. Isso prejudica enormemente o uso de ensaios quimiossensibilidade para parametrizar modelos computacionais, uma vez que tais experiências não fornecem informações sobre a dinâmica temporal do sistema. Isto é especialmente verdadeiro com as células cancerosas primárias, que são muitas vezes limitadas a alguns milhões por amostra, e têm uma vida útil curta após a biópsia, limitando assim o número de condições experimentais disponíveis. Além disso, a maioria dos ensaios de viabilidade exigir a separação do cancro das não-cancro (estroma), as células no momento da quantificação, o que aumenta o trabalho extra para o protocolo, perturba ainda mais as células, e limita o número de experiências que pode ser realizado .

Há 40 anos, Salmon e colaboradores ^uma proposta de seu famoso ensaio de formação de colónias vitro para avaliação de chemosensitivity de células tumorais. Infelizmente este ensaio encontrou o sucesso misto, devido ao pequeno número de mye múltiplaloma (MM) amostras de doentes que foram capazes de formar colónias em condições de controlo: Estimou-se que apenas um pequeno subgrupo de 0,001% a 0,1% de culas de MM foram capazes de replicação, sendo denominado como células estaminais mieloma múltiplo ^2. Isto limita significativamente a taxa de sucesso do ensaio e do número de fármacos que pode ser testado de uma só vez, até mesmo nos modelos mais recentes ^3. Esta questão é muito mais importante agora, quando agentes MM (padrão ou experimentais) são mais numerosos do que há quatro décadas.

Uma das principais limitações destes primeiros ensaios é a sua saída dicotomizada: ou um paciente é "sensível" ou "resistentes" a um fármaco particular. Não são fornecidas informações sobre o grau de sensibilidade e heterogeneidade da população do tumor. Assim, os pacientes com pequenos sub-populações de células de crescimento rápido resistentes seriam classificados como "sensíveis" à terapia, mas recaída em breve, e, portanto, não benAFE do tratamento. Dada a importância da duração da resposta na sobrevida global (OS) de pacientes com câncer ^{de 4,5,} é claro como estes ensaios não foram capazes de estimar corretamente OS de forma consistente.

A fim de contornar estas limitações, e para ser capaz de gerar modelos computacionais específicas do paciente que se estimar a resposta clínica personalizado para um painel de drogas, nós desenvolvemos um método para teste de sensibilidade ao fármaco de forma não destrutiva de mieloma múltiplo (MM) linhas celulares e culas do MM primários em uma reconstrução ex vivo do microambiente da medula óssea, incluindo a matriz extracelular e estroma ^6. Este ensaio, no entanto, tinha a limitação de depender de um slide microfluídico comercial particular, cujas dimensões e custo restringiu o número de experimentos ou drogas que poderiam ser realizados de uma só vez em uma determinada peça de equipamento.

O sistema aqui descrito estende este ensaio original em um alto-throughput plataforma de dose-resposta organotípica, in vitro para rastreio de drogas, com base num algoritmo de análise de imagem digital para quantificar de forma não destrutiva a viabilidade celular. Cada poço em 384 ou 1536 poços placas é uma reconstrução em 3D do microambiente da medula óssea, incluindo células primárias mM, matriz extracelular, e do estroma e factores de crescimento derivados do paciente. Microscopia vivo e análise de imagem digital são utilizados para detectar acontecimentos de morte celular em diferentes concentrações de fármaco, os quais são utilizados para gerar as superfícies de dose-resposta. A partir dos dados in vitro, um modelo matemático identifica o tamanho e a quimiossensibilidade de sub-populações dentro a carga tumoral do paciente, e pode ser utilizado para simular a forma como o tumor responderá à droga (s) em condições fisiológicas, num regime clínico ⁶ ( Figura 1).

As principais inovações desta plataforma são: (a) pequeno número de células cancerosas necessários (1.000-10.000 por concent drogaração); (B) avaliação da eficácia do fármaco em condições fisiológicas (matriz extracelular, estroma, fatores de crescimento derivado do paciente); (C) Nenhuma toxicidade de viabilidade marcadores já que apenas ⁷ de imagens de campo claro é usado, portanto, não há necessidade de transferir células com fluorescência ⁸ ou ⁹ bioluminescência; (D) proporciona um efeito de imagem contínua de droga como uma função da concentração e do tempo de exposição (farmacodinâmica); e (e) entre a integração in vitro e modelos computacionais evolutivos, para estimar o resultado clínico ⁶ (Silva et al., em preparação).

O factor essencial que permite que o algoritmo de análise de imagem digital para discernir cancro a partir de células do estroma é a sua diferente afinidade para o fundo do poço: culas do MM não aderem, e permanecem em suspensão na matriz, enquanto que as células estromais aderir ao fundo do bem e em seguida, alongamento.

Esta separação ocorre mesmo que MM e estroma umre inoculadas ao mesmo tempo, e ocorre durante o processo de S / N de incubação. O girar para baixo no centrifugador seguinte semeadura da placa acelera ainda mais o processo. Como consequência, as células MM aparecem na imagem como discos brilhantes redonda rodeada por um anel de escuro, enquanto que o estroma mantém um perfil baixo e um tom mais escuro (Figura 2). Assim, o ensaio na sua forma actual é o mais adequado para as células de cancro não-aderentes, embora ajustes no algoritmo poderia ser feito para o cancro e estroma separados com base em outras características morfológicas, tais como o tamanho e forma. Neste protocolo, descrevem dois tipos de matriz extracelular (colagénio e da matriz da membrana basal), bem como dois tipos de co-culturas, com (derivadas de medula óssea as células estaminais mesenquimais) BMSC e HUVEC, representando os nichos intersticial e perivascular da medula óssea , respectivamente.

Usando uma placa de 384 poços, 5 concentrações por droga e duas repetições, fomos capazes de test até 31 drogas diferentes com a amostra de um único paciente. Em placas de 1536 poços este número é 127. A Figura 3 ilustra a disposição actualmente usada para a propagação de células Manual, enquanto que a Figura 1 representa uma carta a distribuição óptima utilizando um pipetador robotizado. No desenho da Figura 3, cada placa de 384 poços pode transportar três amostras de doentes com sete drogas diferentes, ou uma amostra de pacientes testados com 21 drogas. Cada droga é representado por 5 concentrações, e cada condição é semeada em duplicado. 4 poços de controlo (sem fármaco adicionado) são semeadas para cada conjunto de sete medicamentos (por exemplo, poços 36-39, 126-129 e 200-203). Para garantir a eficácia dos fármacos utilizados, uma linha de células de mieloma humano (por exemplo, H929 ou MM1.S) também é semeado, e drogados em duplicado na concentração mais elevada de cada um dos fármacos utilizados poços (76-89). O controlo positivo linha celular assegura que as drogas utilizadas têm uma potência adequada, uma vez que as suas curvas de resposta de dose são ac comparávelexperimentos de Ross. Dois poços foram semeadas com uma linha de células de mieloma como controlo para as condições ambientais, em outras palavras, para detectar possíveis problemas na incubadora de bancada durante imagiologia poços (75 e 90). A enumeração dos poços segue um padrão em zigue-zague, a fim de reduzir a distância percorrida pela fase motorizada do microscópio, o que reduz o tempo de aquisição e reduz o desgaste do equipamento.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

O uso de células humanas derivadas de biópsias conforme descrito abaixo foi aprovado pelo Institutional Review Board do Moffitt e conduzidos sob o ensaio clínico MCC # 14745 realizado no H. Lee Moffitt Cancer Center e Instituto de Pesquisa.

1. Seleção de MM Células de Medula Óssea aspirados

1. Recolhe aspirados de medula óssea (20 ml) a partir de pacientes em heparina sódica seringa.
2. Isolar células mononucleares por centrifugação medula diluído (1: 1 com PBS estéril) ao longo de um gradiente de meio aquoso estéril centrifugação a 400 xg durante 30 min à temperatura ambiente.
3. Recolhe-se o interface, que contém as células mononucleares. Lave as células com PBS frio e contar com um hemocitômetro ou contador de células automatizado, usando azul de tripano para a determinação da viabilidade.
4. Prepare uma camada fina preparação de células de slides ¹⁰ e mancha com Wright-Giemsa para avaliar a percentagem de células de plasma ^11.
5. Calculara quantidade de grânulos de CD138 para ser utilizada com base no número de células e percentagem de células de plasma. Se a partir da amostra é inferior a 20% de células do plasma, em seguida, re-suspender as células utilizando 90 mL de tampão de separação e 10 ul de pérolas de CD138 por 5 x 10 ⁶ células. Se a partir da amostra é mais do que 20% de células do plasma, ressuspenso usando 80 ul de tampão de separação e 20 ul de pérolas de CD138 por 1 x 10 ⁷ células.
6. Incubar as células com esferas, a 4 ° C durante 15 min.
7. Passar as células através de um coador 35 uM adicionado separação de pré-humedecido (LS) colunas colocado no separador de campo magnético (ver lista de materiais).
8. Remover coluna de ímã. Recolhe-CD138 células seleccionadas por lavagem da coluna 3 vezes com 1 ml de tampão de separação.
9. Avaliar CD138 enriquecimento com outra preparação de células em camada fina manchado slide ^10.
10. Filtro de plasma obtidas a partir de biópsia de medula óssea a partir de cada paciente, com um filtro de seringa de 0,22? M. Use plasma frescoa partir do mesmo paciente que as células CD138 +.
11. Prepare meios para a experiência, completando meio RPMI-1640 com 10% de calor de soro fetal de bovino inactivado, 10% de plasma do paciente e 1% de penicilina-estreptomicina.
12. Recolhe-se o fluxo através da selecção (CD138-) e seguir o método clássico de aderência ¹² para seleccionar as células mesenquimais da medula óssea (BMSC). Uma vez que este processo requer semanas antes BMSC estão prontos para serem utilizados, é necessário dispor de BMSC pronto a partir de pacientes anteriores ou doadores saudáveis.

2. Células Sementeira em placas (usando um Multi-channel Pipetador manual)

1. Usar uma placa multi-poços (384 ou 1536) com paredes negras e um fundo plano transparente, preferencialmente um optimizado para aplicações ópticas e de cultura de células.
2. Co-cultura BMSCs com células MM em qualquer colágeno tipo I ou matriz da membrana basal, no entanto, exigem HUVECs matriz da membrana basal.
3. Mantenha as densidades finais de cada tipo de célulaa seguinte gama: 3 x 10 ⁵ células / ml para as linhas celulares de MM, 2 x 10 ⁵ células / ml para células HUVEC ou BMSC, e 2 x 10 ⁶ células / ml para células derivadas de pacientes de MM.
   Nota: Estas densidades são o resultado da optimização experimental para permitir a mais elevada qualidade de imagem e tempo mais longo de imagem possível, mantendo relevância biológica nos ensaios. Linhas celulares de MM foram semeadas a densidades mais baixas do que culas do MM primário devido à sua taxa de replicação mais rápida e maior tamanho.
4. Co-cultura de culas do MM com BMSC primárias:
   1. Preparar alíquotas de 100 ul de meio de pré-misturada que consiste em 20 ul de MEM 10x, 20 ul de _H2O desionizada, 10 mL de solução de bicarbonato de sódio a 7,5%, e 50 ul de 1x meio RPMI 1640 e armazenar a 4 ° C.
   2. No momento da sementeira das placas com culas de MM, misturar aliquotas de meio de pré-misturada com 150 ul de 3,1 mg / ml de colagénio tipo I bovino para um volume final de 250 ul.
   3. Re-suspextremidade 50 ul de células em meio RPMI 1640 em seis vezes a densidade final desejada.
   4. Misture a suspensão de células com uma mistura de colagénio para criar um volume final de 300 ul usando uma pipeta P200.
   5. Usando uma pipeta manual ou repetidor, depositar uma gota de 8 ul de mistura final de células / matriz, no centro de cada poço em placas de 384 poços, ou 2 uL em cada poço de placas de 1536 poços (Ver passo 2.6 para um exemplo de arranjo espacial de poços).
   6. Placa Centrifugar durante 2 minutos a 500 xg para concentrar todas as células para o mesmo plano focal durante o exame.
   7. Deixar placa numa incubadora (5% de _CO2, 37 ° C) durante 1 hora, para a polimerização em gel.
   8. Adicionar 80 ul de meio de crescimento suplementado (RPMI-1640, 10% de FBS, 10% HI plasma derivado de paciente, 1% P / S) a cada poço em placas de 384 poços, ou 8 ul em placas de 1536 poços.
   9. Deixar placa S / N na incubadora (5% de _CO2, 37 ° C) para a adesão do estroma para o fundo da placa.
5. Co-CuLTURE de células primárias com células HUVEC MM:
   1. Transferência da matriz da membrana basal de -80 ° C a um balde com gelo para descongelar.
   2. Contagem e re-suspender as células primárias e as células HUVEC em meio RPMI-1640 a 4 vezes a densidade final, cada um, num tubo em separado.
   3. Misturar as células do paciente e volume de HUVECs em proporção de 1: 1.
   4. Uma vez matriz da membrana basal é descongelado, mas ainda não polimerizada, mistura 1: 1 com a mistura de células a partir do passo anterior.
   5. Gotículas de semente com um volume adequado de mistura de células-matriz, no centro de cada poço (8 ul para placas de 384 poços e 2 ul para placas de 1536 poços, ver passo 2.6 para um exemplo de arranjo espacial dos poços).
   6. Centrifugar a placa a 500 xg durante 10 min.
   7. Colocar a placa na incubadora (5% de CO _2, 37 ^o C) durante 1 hora para a polimerização da matriz.
   8. Adicionar meio de crescimento (RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS, 10% de plasma do paciente e 1% de P / S) a cada poço (80 uL para placas de 384 poços, 8 ul de 1,5Placas de 36 poços).
   9. Deixar placa S / N na incubadora (5% de _CO2, 37 ° C) para a aderência de HUVECs ao fundo da placa.
6. Semente de uma placa de 384 poços. A Figura 3 representa uma distribuição espacial típico de semeadura.
   1. A partir de bem B2, semear as colunas drogas a serem testadas. No exemplo da Figura 3, utilizar sete drogas.
   2. Repita sementeira tantas vezes quantas as concentrações a utilizar. No exemplo da Figura 3, usar cinco concentrações.
   3. Semente mais quatro poços para condições de controle.
   4. Repita os passos 2.6.1 e 2.6.2 para a segunda repetição.
   5. Repita os passos 2.6.1 a 2.6.4 para cada amostra de doente a ser testado na placa.
   6. Propagar uma linha de células de MM em duas linhas de poços, cada um com o máximo de poços como drogas a serem testadas (em duplicado). Cada uma destas cavidades será tratado com a concentração mais elevada de cada fármaco para assegurar que o material utilizado tinha poten adequadacy (ver Figura 3, por exemplo).
   7. Semente de dois poços com uma linha celular de MM para servir como controlo das condições experimentais, tais como bom funcionamento da incubadora de bancada, meios de crescimento, etc.

3. sementeira de células em placas (Usando um Robotic Pipetador)

Nota: Esta série de passos de sementes de uma placa de 384 poços, utilizando um pipetador robotizado. O design da placa está ilustrado na Figura Suplementar 1, em que as células primárias MM são testados contra um painel de 31 drogas diferentes em cinco concentrações diferentes em duas repetições, para além do controlo negativo. Uma linha celular é também semeadas como controlo positivo para a avaliação da eficácia de drogas e testadas contra todos os 31 medicamentos na concentração mais elevada, em duas repetições. Os ficheiros são fornecidos por uma marca e modelo específico (ver quadro Materiais), mas o algoritmo pode ser adaptado a quaisquer pipetadores robóticos.

1. Co-cultura de células MM primários com BMSC:
   1. Preparar um tubo de 15 ml consistindo em 240 ul de MEM de 10x, 240 ul de _H2O desionizada, 120 mL de solução de bicarbonato de sódio a 7,5%, 600 ul de 1x meio RPMI 1640 e 1,8 ml de 3,1 mg / ml de colagénio tipo I bovino etiqueta tubo como "pré-mistura para CD138 +". Colocar em gelo até à utilização.
   2. Preparar um tubo de 1,5 mL consistindo em 50 ul de MEM 10x, 50 ul de _H2O desionizada, 25 mL de solução de bicarbonato de sódio a 7,5%, 125 ul de 1x meio RPMI 1640 e 375 ul de 3,1 mg / ml de colagénio tipo I bovino etiqueta tubo como "pré-mistura para a linha celular". Colocar em gelo até à utilização.
   3. Re-suspender 300 ul de células CD138 + em RPMI 1640 em seis vezes a densidade final desejado. Re-suspender a 300 ul de células BMSC em meio RPMI 1640 a seis vezes a densidade final desejada. Misturar ambos os volumes em conjunto num tubo de 1,5 ml e rótulo "CD138 +". Colocar na incubadora até à sua utilização.
   4. Re-suspender 60 ul delinha celular em meio RPMI 1640 a seis vezes a densidade final desejada. Re-suspender 60 ul de células BMSC em meio RPMI 1640 a seis vezes a densidade final desejada. Misturar ambos os volumes em conjunto num tubo de 1,5 ml e rótulo "linha celular". Colocar na incubadora até à sua utilização.
   5. Usando o software fornecido com a pipeta de robótica, carregue o primeiro arquivo de script, "cell_seedingPt47.PGM". Coloque uma caixa de 200 ul ponta da pipeta, uma placa de microtitulação, e uma placa de 384 poços estéril nas estações A, B e E, respectivamente, do robô.
   6. Misturar os conteúdos dos tubos de "pré-mistura para CD138 +" e "CD138 +". Transferir 1,5 ml de o seu conteúdo para o bem # 1 da placa de microtitulação. Colocar o tubo com volume restante no gelo. Inicie o programa. O robô vai semear as primeiras 176 poços (11 mais à esquerda colunas) da placa de 384 poços e, em seguida, fazer uma pausa. Transferir o restante do tubo em gelo para assim # 2 da placa de microtitulação. Retomar o programa. Orobot semearão as restantes 144 poços da placa de 384 poços e pausa.
   7. Misture o conteúdo de tubos "pré-mistura para a linha celular" e "Linha celular" e transferir o conteúdo para o bem nº 3 de placa de microtitulação. Resume programa. O robô vai semear as restantes 64 poços da placa de 384 poços.
   8. Coloque 384 poços na placa de centrifugação durante 10 min a 500 xg e 4 ° C. Placa de transferência para incubadora (5% de _CO2, 37 ° C) durante 1 hora para a polimerização do colagénio.
   9. Coloque o segundo arquivo de script, "media_layer.PGM". Coloque a caixa da ponteira 120 uL, de um reservatório de reagente com 31 ml de meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS, 10% de plasma do paciente e 1% de P / S, e a placa de 384 poços com células em postos A, B e E, respectivamente. Execute o programa. O robô irá transferir 81 ul de meio para cada poço. Uma vez terminado, transferem placa de 384 poços a incubadora e permitir estroma para aderir ao substrato S / N.

4. Drogas Preparação e drogar Plates (Usando um Multi-channel Pipetador Manual)

1. Preparar um modelo semelhante ao da Figura 3, a fim de facilitar o processo de adição de droga aos poços e reduzir a probabilidade de confusão.
2. Preparar, numa placa de 96 poços, uma diluição em série de cada um dos fármacos a serem testados na placa, por exemplo, para cinco concentrações utilizando uma diluição de 3 vezes:
   1. Adicionar 120 ul de fármaco a 10x a concentração desejada na concentração mais elevada bem. Por exemplo, usar 500 uM melfalano se a concentração mais elevada as células serão expostas na placa será de 50 uM.
   2. Adicionar 80 ul de meio de crescimento (meio RPMI suplementado com 10% de FBS, 10% de plasma derivado do paciente e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S)) para as quatro poços subsequentes.
   3. Transferir 40 uL da primeira cavidade para o segundo e misturar, para um volume total de 120 ul, a 1/3 da concentração de fármaco do primeiro poço, ou 167? M.
   4. Repita o passo 4.2.3 para os poços restantes (por exemplo, transferir 40 ul da segunda para a terceira, misturar, em seguida, transferir 40 ul da terceira para a quarta, etc.).
3. Transferir 8 ul a partir de cada fármaco que contém a bem o correspondente poço na placa de células. Cada droga contendo também deve ter um volume suficiente para 10 poços da placa de células. No exemplo da Figura 3, cada concentração de fármaco é adicionada a seis poços diferentes, excepto para a concentração mais elevada, a qual é adicionada a 8 poços.
4. Adicionar 8 mL de meio de crescimento (meio RPMI suplementado com 10% de FBS, 10% de plasma derivado do paciente e 1% de P / S) para os poços de controlo.
5. Coloque as células em microscópio assim que pronto e virar na bancada de incubação.

5. Preparação de drogas e drogar Plates (Usando um Robotic Pipetador)

1. Baixar arquivos de script para pipettor robótico de http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Precision XS files.zip
2. Carregar o script "media_layer_DRUGPLATE.PGM" na interface do usuário pipettor robótico. Coloque uma caixa de ponta de pipeta 120 uL, reservatório com 21 ml de meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS, 10% de plasma do paciente e 1% de P / S e uma placa de 384 poços vazios nas estações A, B e E, respectivamente. Executar o programa, o pipetador robotizado irá adicionar 30 ul de meios de comunicação para todas as cavidades na placa de 384 poços.
3. Seguindo o modelo da Figura 2 Suplementar adicionar 200 ul de fármaco a 20x a concentração máxima para cada poço de uma placa de microtitulação. Esta instalação acomoda até 31 drogas. Para o controlo do poço (CTRL), adicionar meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS, 10% de plasma do paciente e 1% de P / S.
4. Coloque uma caixa da ponteira 120 ul, de placas de microtitulação com drogas em concentração 20X, e de 384 poços com meios (do passo 5.1) em postos A, B e C, respectivamente. Carregar o programa "drug_plate.PGM". A pipeta robótico irá criar uma diluição em sériede 1: 3, na sequência da distribuição espacial em Suplementar Figura 1.
5. Coloque uma caixa de ponta de pipeta 120 uL, a placa de 384 poços com diluição de fármaco (a partir do passo 5.3) e a placa de 384 poços com células (a partir do passo 3.1.9) em postos A, B e C, respectivamente. Carregar e executar o programa "drug_add.PGM". O pipetador robotizado transferirá 8 ul de fármaco a partir de cada poço na placa de droga para a sua contrapartida na placa de células. Uma vez terminado, a transferência de células para a placa da incubadora microscópio digital o mais rapidamente possível.

6. imagens de células em placa

Nota: O procedimento que se segue aplica-se ao microscópio Evos Auto FL, mas pode ser facilmente adaptada a outros microscópios platina motorizada com bancada de incubação ou microscópios embebidos em incubadora.

1. Limpar o interior da incubadora de bancada com uma mistura de etanol-esfregão húmido e cuidadosamente remover a tampa da placa, enquanto a colocação da tampa do incubator.
2. Siga os passos de software para adicionar as balizas. Este é o termo usado para se referir a pontos de referência para as regiões de interesse, a ser trabalhada, sucessivamente, durante o experimento (veja o guia do usuário do software para obter detalhes).
3. Use um objetivo ampliação 5X ou 10X. Certifique-se de que o foco é semelhante à Figura 2: células MM aparecem como discos brilhantes cercadas por um anel escuro e BMSCs ou HUVECs são pouco visíveis. Algumas células MM primários são muito pequenas e, portanto, um ajuste fino pode ser obrigado a encontrar o melhor foco.
4. Ajuste o intervalo de aquisição entre 10-30 min e para a duração de pelo menos 96 horas. Enquanto intervalos mais longos entre aquisições são aceitáveis, intervalos de 45 minutos ou mais pode reduzir significativamente a precisão da medição de viabilidade.
5. Configure o software para que as imagens de cada poço são armazenados em arquivos separados chamados Beacon-1, Beacon-2, etc. Se foi usada a pipeta de robótica, definir as balizas na ordem descrita naFigura Suplementar 3.
6. Certifique-se de que há água suficiente no umidificador incubadora e gás, de modo que as células estarão em melhores condições.
7. Após a conclusão do experimento, copie as pastas que contêm as imagens para o computador que irá executar a análise.

7. Quantificação de sensibilidade aos fármacos

Nota: Os seguintes instruções orientam o uso da análise de imagem utilizando um computador aglomerado, uma vez que a análise de uma placa multi-poços em um computador pessoal é extremamente demorado.

1. Baixe software ImageJ do site da NIH: http://imagej.nih.gov/ij/
2. Baixe roteiro e plugins em http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/
3. Siga as instruções em http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/UserGuide.pdf para executar o software de análise de imagem digital. O resultado deve ser uma planilha denominada Results.csv que contém as medições de viabilidade em intervalos regulares para each cavidade da placa para a duração da experiência (isto é, 96 horas).
4. Se estiver usando uma pipeta multi-canal manual, execute os seguintes passos.
   1. Baixe o arquivo http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/ExperimentalDesign.txt e modificá-lo para coincidir com o layout da placa definido no passo 3.1 (por exemplo, a Figura 3).
   2. Faça o download do software http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar e executá-lo usando os arquivos criados nos passos 5.3 e 5.4 como o parâmetro de entrada. O resultado será um Relatório de nome da pasta que contém várias planilhas, cada agrupamento dos resultados para um determinado medicamento.
   3. Copiar e colar o conteúdo em modelo de planilha http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/GraphPadAnalysisPT.pzfx
      Nota: O resultado deve ser gráficos, tais como o representado na Figura 4, que representa a quimiossensibilidade da amostra para drogas diferentes como uma função da concentração do fármaco e o tempo de exposição.
   4. Se estiver usando uma pipeta de robótica, execute os seguintes passos.
      1. Baixar arquivos de modelo de transferir arquivos de script para pipettor robótico de http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Robotic Template Files.zip e extrair arquivos em um diretório.
      2. Modificar o arquivo DrugList.csv de acordo com a lista de medicamentos e maior concentração da droga na placa com células. Siga o layout de Suplementar Figura 2.
      3. Execute o programa BuildExperimentalDesign.java passando como parâmetro a pasta que contém os arquivos extraídos na etapa 7.5.1 e os arquivos Results.csv a partir do passo 7.3. O resultado deve ser duas pastas nomear MM1_S e PtSample. O primeiro contém uma descrição dos poços (drogas) e as concentrações para o controlo positivo linha celular. A segunda contém a mesma informação, mas sobre a parte da placa semeada com células do paciente.
      4. Copie o arquivo Results.csv em cada um dos diretórios criados na etapa 7.5.3. Baixaro software http://www.i-genics.com/Jove2014Silva/Evos384.jar e executá-lo usando os arquivos criados nos passos 7.5.3 para ambas as pastas. O resultado será um Relatório de nome da pasta em cada uma das pastas criadas no 7.5.3. A pasta relatório contém várias planilhas, cada agrupamento dos resultados para um determinado medicamento.
      5. Execute o programa BuildGraphPadFile.java e passar como parâmetro a pasta que contém os arquivos extraídos na etapa 7.5.1 e os arquivos Results.csv a partir do passo 7.3. O resultado será um ficheiro GraphPad contendo as curvas de resposta à dose para cada uma das 31 drogas, e normalizada por controle. Cada gráfico irá conter cinco concentrações de drogas para as células MM primárias e uma concentração para o controlo positivo linha celular.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

O fluxo da experiência é brevemente descrito na Figura 1 Se todas as etapas são completadas com sucesso, as imagens obtidas por microscópio deve ser equivalente à Figura 2:. Vivo culas do MM deve ser claramente visto como discos brilhantes e BMSC ou HUVECs deve ser pouco visível e bem distribuídas no fundo. Como pode ser visto na Figura 2A, culas do MM variam em tamanho de um paciente para outro, mas, em geral, eles são menores do que as linhas celulares. Uma ve...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Em resumo, este é um método poderoso e alta taxa de transferência para quantificar a quimiossensibilidade de culas do MM primárias e ex vivo farmacodinâmica da droga através de uma reconstrução da medula óssea. Os passos críticos dentro deste protocolo são a semeadura adequada dos poços e concentrando adequada (ver Figura 2 para os resultados esperados): assegurar que as células estromais MM e são distribuídos uniformemente, que as células estromais são aderentes ao fundo do po...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
EVOS FL AUTO	AMG	AMAFD1000 + AMC1000	Digital microscope equipped with motorized stage and bench top incubator.
384-well plate CellBind	CORNING	CLS3683 SIGMA	Corning CellBIND 384 well plates 384 well plate, polystyrene, CellBIND surface, sterile, clear flat bottom, black, w/lid
1,536-well plate CellBind	CORNING	CLS3832 ALDRICH	Corning 1,536 well plates, low base, surface treatment CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	For in vitro isolation of lymphocytes from human peripheral blood.
CD138 magnetic beads	Miltenyi	130-051-301	Antibody conjugated magnetic beads for selection of CD138+ cells.
LS columns	Miltenyi	130-042-401	Column for separation of cells.
MidiMACS Separator	Miltenyi	130-042-302	Magnet for separation column.
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	ECM Gel from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma
Getrex	Life Technologies	A1413201	LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC )
RPMI-1640 media	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 Medium + L-Glutamine + Phenol Red
FBS Heat inactivated	GIBCO	10082-147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
3.1 mg/ml Bovine collagen type I	Advanced Biomatrix	5005-B	Bovine Collagen Solution, Type I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS	BIOTEK	PRC3841	Robotic pipettor system