Camada por camada de colágeno Deposição em microfluídicos para Microtissue Estabilização

Resumo

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Resumo

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

Introdução

Although microfluidics allows for the exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells, especially primary cells, within microfluidic devices can be challenging. Many traditional cell culture techniques have been developed to sustain and stabilize cell function when cultured in tissue culture plates, but translating those techniques to microfluidic devices is often difficult.

One such technique is the culture of cells on or sandwiched between collagen gels as a model of the physiological 3D cell environment.¹ Type I collagen is one of the most frequently used proteins for biomaterials applications because of its ubiquity in extracellular matrix, natural abundance, robust cell attachment sites, and biocompatibility.² Many cells benefit from 3D culture with collagen, including cancer cells^3,45, microvascular endothelial cells⁶, and hepatocytes⁷, among others. While the use of collagen gels is easy in open formats, such as tissue culture plates, the limited channel dimensions and enclosed nature of microfluidic devices makes the use of liquids that gel impractical without blocking the entire channel.

To overcome this problem, we combined the layer-by-layer deposition technique⁸ with chemical modifications of native collagen solutions to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These layers can stabilize cell morphology and function similar to collagen gels and can be deposited on cells in microfluidic devices without blocking the channels with polymerized matrix. The goal of this method is to modify native collagen to create polycationic and polyanionic collagen solutions and to stabilize cells in microfluidic culture by depositing thin collagen matrix assemblies onto the cells. This technique has been used to stabilize the morphology and function of primary hepatocytes in microfluidic devices.⁹

Although layer-by-layer deposition has previously been reported with natural and synthetic polyelectrolytes¹⁰ to cover hepatocytes in plate culture^11,12 and as a seeding layer for hepatocytes in microfluidic devices^13,14, this method describes the deposition of a pure collagen layer on top of hepatocytes, mimicking the 3D collagen culture techniques. In this protocol, we use hepatocytes as example cells that can be maintained using 3D collagen layers. The many other types of cells that benefit from 3D culture in collagen may similarly benefit from culture after layer-by-layer deposition of an ultrathin collagen matrix assembly.

Protocolo

1. Preparação da solução de colagénio nativo solúvel

1. Prepare comprar ou 200 mg de acidificada, solúvel, de colagénio tipo I da cauda de ratos a 1-3 mg / ^{15 ml,} utilizando protocolos de isolamento convencionais, tais como relatado por Piez et ai.
2. Escala a quantidade de material de partida com base no volume final desejado de soluções de colagénio modificados. Aproximadamente 25-30 ml de fazer metilado e 25-30 ml de soluções de colagénio succiniladas, cada um em 3 mg / ml, a partir de 200 mg de colagénio nativo solúvel.

2. O colágeno metilação

1. Dilui-se 100 mg da solução nativa, acidificou-se (pH 2-3) de colagénio a uma concentração de 0,5 mg / ml com água estéril gelada e manter a solução em gelo para evitar a gelificação.
2. Ajuste o pH da solução de colagénio para 9-10 com algumas gotas de NaOH 1 N e agita-se à TA durante 30 min. Observe-se o precipitado de colagénio, fazendo com que a solução se tornar turva.
3. Girar a solução de colágeno precipitado a 3000 × g durante 25 min. Um precipitado claro, semelhante a gel deve ser visível no fundo dos tubos. Aspirar e descartar adequadamente o líquido sobrenadante.
4. Ressuspender o precipitado de colagénio em 200 ml de metanol com HCl 0,1 N e permitir que a reacção de metilação para ocorrer com agitação à temperatura ambiente durante 4 dias. O colágeno não vai dissolver, mas deve se quebrar em pedaços muito pequenos visíveis que irão tornar a solução turva.
5. Após a metilação, centrifugar a solução a 3000 × g durante 25 min para sedimentar o colagénio metilado. Aspirar e descarte do sobrenadante metanol acidificado.
6. Dissolve-se o colagénio metilado em 25 ml de PBS estéril, dando uma concentração de aproximadamente 3 mg / ml, com uma pipetagem repetida, e filtrar a solução através de um filtro de células de 60 mm. Ajuste o pH da solução para 7,3-7,4 usando 20 ul incrementos de 1 N NaOH.
7. Avaliar a Concentraçãn da solução utilizando um kit de ELISA comercial colágeno rato ou kit de ensaio de hidroxiprolina. Dilui-se a solução a 3 mg / ml com PBS estéril.
8. Esterilizar a solução de colagénio metilado, transferindo-a para um frasco de vidro com uma tampa de rosca, de camadas cuidadosamente 3 mL de clorofórmio, na parte inferior da garrafa, permitir que a garrafa para definir O / N a 4 ° C, e em seguida assepticamente remover e armazenar o camada superior, que é o colagénio metilado.
9. Guardar a solução a 4 ° C para utilização no prazo de 1 mês.

3. O colagénio succinilação

1. Dilui-se a outros 100 mg da solução nativa, acidificou-se (pH 2-3) de colagénio a uma concentração de 0,5 mg / ml com água estéril gelada e manter a solução em gelo para evitar a gelificação.
2. Ajuste o pH da solução de colagénio para 9-10 com algumas gotas de NaOH 1 N e agita-se à TA durante 30 min. O colagénio deve precipitar, fazendo com que a solução se tornar turva.
3. Dissolve-se 40 mg de sucanidrido cínico (0,4 mg por mg de colagénio) em 10 ml de acetona ^(1/20 do volume da solução de colagénio). Lentamente (em cerca de 0,5 ml incrementos) adicionar esta mistura à solução de colagénio com agitação, enquanto se monitorizava continuamente o pH. Manter o pH acima de 9,0 através da adição de 1 ou 2 gotas de NaOH 1 N conforme o pH se aproxima de 9,0.
4. Continuar a agitar à temperatura ambiente durante 120 minutos após a adição de todo o anidrido succínico em acetona. Observe a solução para se tornar claro como o colágeno succinilado dissolve. Verifique periodicamente o pH para assegurar que ela permaneça acima de 9,0.
5. Ajustar o pH da solução para 4,0 com 20 ul incrementos de 1 N de HCl. Observar a solução turva novamente, como o colagénio precipita succinilada.
6. Após a succinylation, centrifugar a solução a 3000 × g durante 25 min para sedimentar o colagénio succinilado. Aspirar e descarte do sobrenadante acidificou-se com anidrido succínico não reagido.
7. Dissolve-se o colagénio succiniladoem 25 ml de PBS estéril, dando uma concentração de aproximadamente 3 mg / ml, com uma pipetagem repetida, e filtrar a solução através de um filtro de células de 60 mm. Ajuste o pH da solução para 7,3-7,4 usando 20 ul incrementos de 1 N NaOH.
8. Avaliar a concentração da solução, utilizando um kit de ELISA comercial de rato de colagénio ou kit de ensaio de hidroxiprolina. Dilui-se a solução a 3 mg / ml com PBS estéril.
9. Esterilizar a solução de colagénio succinilado, transferindo-a para um frasco de vidro com uma tampa de rosca, de camadas cuidadosamente 3 mL de clorofórmio, na parte inferior da garrafa, permitir que a garrafa para definir O / N a 4 ° C, e em seguida assepticamente remover e armazenar o camada superior, que é o colagénio succinilado.
10. Guardar a solução a 4 ° C para utilização no prazo de 1 mês.

4. Verificação do colagénio Modificações

1. Preparar amostras de 1 ml a partir de cada uma das soluções de colagénio nativo, metilados, e succiniladas e diluir para um coneentration de 0,1 mg / ml com água pura esterilizada para titulação de íons de hidrogênio. Diluir o tampão de pelo menos 1.000 vezes por diálise contra água através de um corte de 10 kDa membraneusing 3 mudanças de solução de pelo menos 4 horas cada.
2. Ajustar o pH das soluções para 7.3 com pequenas quantidades de HCl e de NaOH. Usando pH 7,3 como uma referência arbitrária, executar titulação de iões de hidrogénio em cada uma das amostras, como descrito por Tanford ¹⁶ para criar curvas de titulação para as soluções de colagénio nativo, metilados, e succinilada.
3. Traça-se a mudança de pH por volume de ácido adicionado em relação ao número de iões H ⁺ ligada por molécula. O pH elevado "amino" intervalo deve mostrar uma mudança no colagénio succinilado em direcção ao ponto neutro (uma perda de grupos amina), e o pH baixo "carboxilo" intervalo deve mostrar um deslocamento para a esquerda no colagénio desnaturado (uma perda de grupos carboxilo ) e um desvio para a direita na colagénio succinilada (um ganho no grupo carboxilos), em comparação com o colagénio nativo.
4. Avaliar a eficácia da reacção succinylation pela determinação da% de grupos amino no colagénio nativa substituído por succinylation usando o método colorimétrico de ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico (TNBA), seguindo protocolos padrão ^17,18.

5. fabricação de dispositivos microfluídicos e propagação de celular

1. Fabricar dispositivos microfluídicos usando métodos padrão ^9. Use réplica moldagem de PDMS de SU-8 mestres de silício definido usando fotolitografia para criar câmaras de cultura de células de microfluidos com 100 um de altura, 0,4-1,5 mm de largura e 1-10 mm de comprimento canais para o crescimento celular.
2. Use um limpador de plasma para oxidar as superfícies do dispositivo e uma lâmina de vidro, em seguida, pressione em conjunto para ligação. Após a esterilização do dispositivo em caso de exposição à luz UV durante pelo menos 30 min, encher a câmara com 50 ug / ml de fibronectina em PBS estéril e incubar a 37 ° C durante 45 min.
3. Semear o dispositivo com as células, tais como de rato primária ou hepatócitos humanos, que necessitem de um gel de colagénio para a estabilização do fenótipo ou do estado de diferenciação. Usamos 20 ul de recém-isolados hepatócitos primários de rato ^7,19 comercialmente disponíveis ou criopreservados hepatócitos humanos primários semeadas a 14 x 10 ⁶ células / ml para cada dispositivo.
4. Permitir que as células para anexar para 4-6 horas, e, em seguida, lavar a células não ligadas e substituir a mídia chapeamento com meios de crescimento. Incubar O / N para assegurar célula completa divulgação e criar uma monocamada confluente de células.

6. Camada por camada de colágeno Deposição

1. Em um fluxo laminar capuz de cultura de tecidos, volumes suficientes de preparar soluções de colagénio desnaturado e succiniladas de 10 aplicações de solução por cada dispositivo, bem como de alguns ml de meio. Mantenha as soluções no gelo. Nós usamos 20 jul (10-15 vezes o volume total de dispositivo) de colágeno por camada por dispositivo.
2. Serdescaroçamento com a solução metilado (policatiónico), suplente rubor os dispositivos com 20 l de metilado e depois succinilado soluções de colágeno, esperando 1 min entre cada aplicação. Lave o dispositivo de um total de 10 vezes por solução, que deve levar cerca de 20 min. Trabalhar rapidamente para minimizar a quantidade de tempo que as células são sem meios.
3. Observar colagénio lentamente acumulam à entrada / saída em função do tamanho. Se a resistência ao fluxo do fluido aumenta, lave o dispositivo uma ou duas vezes com a mídia, e depois continuar estratificação.
4. Após a aplicação de todas as camadas, lavar duas vezes com o dispositivo de meios frescos e retornar para a incubadora. Dependendo do tipo de célula, as alterações morfológicas induzidas extracelulares da matriz, tais como a polarização aumentada em hepatócitos, deve ser visível dentro de algumas horas.
5. Prepare dispositivos representativos para microscopia electrónica de transmissão usando métodos ^padrão de 9 para verificar a presença de uma matriz de colagénioa montagem no topo das células cultivadas.

7. Estabilização do fenótipo celular e função

1. Imagem da morfologia celular, viabilidade, e a polaridade usando métodos padrão para o tipo de célula. Para hepatócitos, coletar imagens ao longo de 14 dias, utilizando microscopia de fase, coloração Live / Dead para a viabilidade, e corante CMFDA para a polarização apical para demonstrar os efeitos da deposição de colágeno.
2. Para a morfologia das células, lave o dispositivo através da entrada, com uma pipeta, com 20 ul de PBS para enxaguar, injectar 20 ul de PBS, e a imagem do dispositivo usando microscopia de contraste de fase.
3. Para a coloração Live / Dead, irrigue o dispositivo através da entrada com uma pipeta com 20 l de PBS para lavar, injetar 20 ml de solução de coloração Live / Dead com DAPI preparado seguindo as instruções do fabricante, incubar por 30 min a 37 ° C, lavar a Dispositivo de novo com 20 ul de PBS, e a imagem do dispositivo usando a microscopia de fluorescência.
4. Para bile canalicoloração Culi, lave o dispositivo através da entrada, com uma pipeta, com 20 ul de PBS para enxaguar, injectar 20 ul de 2 gotas de solução corante uM CMFDA com DAPI preparados de acordo com as instruções do fabricante, incubar durante 30 minutos a 37 ° C, lavar novamente o dispositivo com 20 ul de PBS, e a imagem do dispositivo usando microscopia de fluorescência.
5. Recolher os meios gastos e medir produtos metabólicos celulares em pontos de tempo apropriados ao longo da duração da cultura para determinar a função das células. Para hepatócitos, medir a quantidade de albumina e ureia na mídia gastos.
6. Realizar análises funcionais de ponto final nas próprias células, como as que avaliam os níveis de enzimas de atividade, coloração de anticorpos, ou análise de RNA. Para hepatócitos, induzir e medir a atividade das enzimas do citocromo P450 ou fase II conjugação enzima glutationa S-transferase.

Resultados

Colagénio nativo pode ser modificado usando metilação e succinylation para criar soluções de colagénio policatiónicos e polianiónicos para uso na deposição de camada por camada. Succinylation modifica os grupos e-amino de colagénio nativo com grupos succinilo, metilação e modifica os grupos carboxilo de colagénio nativo com um grupo metilo (Figura 1A). Estas modificações às cadeias laterais de aminoácidos da proteína de colagénio alterar as curvas de titulação para pH das soluçõe...

Discussão

Ultrafinos assembleias de colágeno puro pode ser depositado em células carregadas ou superfícies de material usando deposição de camada por camada de colágenos modificados. Os resultados deste estudo demonstram que a metilação e succinylation de colagénio nativo criar soluções policatiónicos e polianiónicos de colagénio (Figura 1) que pode ser utilizado com a técnica de camada-a-camada para depositar conjuntos de matriz de colagénio ultrafinos em células (Figura 2) ou o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
collagen type I, rat tail	Life Technologies	A1048301	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	EMD Millipore	08-115	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	R%D Systems	3440-100-01	option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride	Sigma-Aldrich	239690-50G	succinylation reagent
anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322415-100ML	methylation reagent
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881-500G	pH precipitation reagent
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331-500ML	pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA	Chondrex	6013	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	option for detecting collagen content