As análises de expressão de miRNA no câncer de próstata tecidos clínicos

Resumo

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Resumo

Um desafio crucial no cancro da próstata (PCA) manejo clínico é representada pela inadequação dos biomarcadores atualmente utilizados para o rastreio da doença, diagnóstico, prognóstico e tratamento. Nos últimos anos, microARNs (miARNs) surgiram como biomarcadores alternativos promissores para o diagnóstico e prognóstico do cancro da próstata. No entanto, o desenvolvimento de miARNs como biomarcadores eficazes para o cancro da próstata depende fortemente de sua detecção precisa em tecidos clínicos. analisa miRNA em amostras clínicas de câncer de próstata é muitas vezes um desafio devido à heterogeneidade do tumor, erros de amostragem, a contaminação do estroma etc. O objetivo deste artigo é descrever um fluxo de trabalho simplificado para análises de miRNA em FFPE arquivado ou espécimes clínicos de câncer de próstata fresco congelado usando uma combinação de -PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR) e hibridação in situ (ISH). Dentro desse fluxo de trabalho, otimizar as metodologias existentes para a extração de miRNA de FFPE e congelado tissu próstataes e expressão análises por sonda Taqman-base miRNA RT-PCR. Além disso, nós descrevemos um método otimizado para ISH analisa detecção formiRNA em tecidos da próstata, utilizando ácido nucleico bloqueado (LNA) - sondas de base. Nosso protocolo miARN ISH optimizada pode ser aplicada a lâminas de tecido de cancro da próstata ou cancro da próstata Tissue microarrays (TMA).

Introdução

O câncer de próstata é um tumor maligno masculino comumente diagnosticado que é uma das principais causas de mortalidade relacionada com câncer entre os homens. Nos EUA, uma 220,800 novos casos estimados e 27.540 mortes serão relatados em 2015 ^1.

O câncer de próstata é uma doença heterogênea com doença altamente variável course- tumores podem ser indolente ou muito agressivo. Um desafio crítico no manejo clínico do câncer de próstata é representada pela inadequação dos atualmente utilizados métodos / biomarcadores para o rastreio da doença, diagnóstico, prognóstico e tratamento ^2. Métodos de rastreio atuais incluem antígeno (PSA), em específico da próstata e um exame de toque retal (DRE), seguido de biópsias de próstata ^3. Antígeno específico da próstata (PSA) é o biomarcador de câncer de próstata mais amplamente utilizado que revolucionou significativamente a gestão clínica e melhoria das taxas de sobrevivência ^4. No entanto, devido às limitações inerentes de PSA incluindo lack de especificidade, o rastreio baseada em PSA levou a mais de diagnóstico e tratamento ao longo da doença. Em vista disso, os esforços intensivos estão sendo direcionados para a busca de biomarcadores de câncer de próstata alternativos, especialmente aqueles que podem prever a agressividade da doença e tomar melhores decisões de tratamento ^4,5. Ao longo dos últimos anos, microRNAs (miRNAs) surgiram como promissoras biomarcadores de câncer de próstata suplentes.

Os microRNAs (miRNAs) constituem uma classe evolutivamente conservadas de pequenos RNAs não-codificantes que suprimem a expressão gênica pós-transcricionalmente através de interacções específicas para a sequência com os 3'- não traduzidas (UTRs regiões) de alvos de RNAm cognatos. Estima-se que> 60% de mRNAs são alvos de miARNs ⁶ conservada. miRNA genes estão localizados em regiões intergénicas ou dentro de exões intrões ou de proteína / proteína não-codificantes genes ^7. Estes genes são preferencialmente transcrito pela ARN-polimerase II em primamiRNAs ry (pri-miRNAs, vários quilobases de comprimento) que as estruturas secundárias de loop haste em forma de forma hairpin. Estes miRNAs pri-são transformados em miRNAs precursoras (pré-miRNAs, 60-75 nucleótidos de comprimento) que são exportados para o citoplasma e novamente transformadas em miRNAs maduros (18-25 nucleótidos de comprimento) ^8-10. miARNs regular processos celulares chave, incluindo a proliferação, desenvolvimento, diferenciação e apoptose ^11. Estudos sugerem uma desregulação generalizada de perfis de expressão de miARN em várias malignidades humanas, incluindo cancro da próstata ^12-15. perfis de expressão de miARN têm sido relatados para ser amplamente desregulado no cancro da próstata primário e metastático. MiRNA expressão alterada têm sido relacionados com a progressão do câncer de próstata, agressividade e recorrência destacando o potencial prognóstico de miRNAs ^12,14,16-19. Um crescente corpo de evidências indicam que os miRNAs desempenham papéis importantes mecanicistas na iniciação do câncer de próstata, o desenvolvimento, o progressoião e metástase. No geral, os miRNAs estão emergindo como biomarcadores alternativas promissoras para o diagnóstico e prognóstico do câncer de próstata que podem distinguir entre tecidos e ajuda normais e cancerosas na estratificação de tumores de próstata ^12. Além disso, os miRNAs são alvos importantes para o desenvolvimento de terapias eficazes contra o câncer de próstata ^20.

Devido ao seu pequeno tamanho e resistência à actividade da RNase endógena, miARNs biomarcadores são estáveis ​​que podem ser facilmente detectadas em tecidos fixados em formalina ²¹ e ²² em biópsias da próstata. Além disso, os perfis de expressão miARNs foram comparadas em tecidos congelados e fixados em formalina e foram encontrados para ser fortemente correlacionada ^21. No entanto, a expressão miRNA perfis em tecidos clínicos de câncer de próstata é muitas vezes um desafio devido à heterogeneidade do tumor, erros de amostragem, a contaminação do estroma etc. O desenvolvimento de miRNAs como biomarcadores eficazes para o cancro da próstata fortemente reliES na sua detecção precisa em tecidos clínicos. Aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho simplificado utilizado em nosso laboratório para a expressão miRNA de perfis FFPE arquivado ou espécimes clínicos de câncer de próstata fresco congelado. Nós empregar uma combinação de PCR quantitativo em tempo real e a hibridização in situ para miARN análises de amostras clínicas, com a ex-rendendo mais informações quantitativas e o último para visualizar a expressão diferencial de biomarcadores potenciais miARN em uma variedade de tecidos. Dentro desse fluxo de trabalho, otimizar as metodologias existentes para a extração de miRNA de FFPE e tecidos da próstata congelados, analisa expressão por Taqman-sonda baseada miRNA RT-PCR e miRNA in situ utilizando técnica de hibridização de ácidos nucleicos bloqueados (LNA) à base de sondas ^23. Sondas à base de LNA oferecem maior sensibilidade e especificidade em relação ao ADN ou RNA-sondas base e permite a detecção robusta de todas as seqüências de miRNA, independentemente do seu conteúdo GC e também permitir que discriminação de famílias de miARN. Nosso protocolo miARN ISH optimizada pode ser aplicada a lâminas de tecido de cancro da próstata ou cancro da próstata Tissue microarrays (TMA), com este último que oferece o potencial para acelerar miARN descoberta biomarcador.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Foram obtidas amostras de câncer de próstata fresco congelado-fixada em formalina, embebidos em parafina (FFPE) ou a partir do SFVAMC. Amostras eram de pacientes com câncer de próstata submetidos à prostatectomia radical em SFVAMC. Termo de consentimento informado foi obtido de todos os pacientes eo estudo foi aprovado pelo Comitê UCSF em Pesquisa com Seres Humanos. Alternativamente, tecidos de câncer de próstata microarrays foram adquiridos a partir de fontes comerciais e utilizados para análises de miRNA por ISH. Informações clínico-patológico e acompanhamento para pacientes com câncer de próstata analisados ​​foram coletados.

1. As amostras de tecidos

1. Cortar amostras de tecido da próstata câncer em 10 mm seções usando um micrótomo e mancha com H & E seguindo o protocolo do fabricante.
2. Comente lâminas coradas para a identificação de focos de câncer de próstata, bem como epitélio glandular normal adjacente.
   Nota: A placa certificada patologista deve rever os slides H & E manchada e maRK para o tumor e zonas normais. Use os slides marcados como guias nas seções subseqüentes para miRNA análises de tumor vs áreas normais.

2. miRNA expressão quantitativa Análises por PCR em tempo real

Nota: Esse fluxo de trabalho envolve as seguintes etapas: Captura de Laser microdissection, isolamento de RNA total (incluindo miRNA e mRNA), ensaio de miRNAs maduros usando os ensaios de expressão TaqMan MicroRNA conforme detalhado nas seções seguintes.

1. Extração de RNA
   1. Isolamento de miRNA de cancro da próstata tecidos FFPE
      1. Captura Laser microdissection (LCM)
         Nota: Siga as etapas 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 em um exaustor química.
         1. Preparar lâminas de tecido (10 mm seções) para LCM. Deparrafinize secções de tecido por imersão em xileno (2x), durante 10 min cada, em seguida, re-hidratar os tecidos através da incubação das lâminas durante 5 min cada em etanol graduado (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) seguido por destilada água(5 min).
         2. Após reidratação, as secções com hematoxilina mancha durante 30 seg seguido de água.
         3. Coloque tecidos em etanol graduado (70%, 95%, 90%, 80%, 70%) (5 min cada) e xileno (5 min).
         4. Lâminas secas em um exaustor e, em seguida, colocar no instrumento LCM para microdissection.
         5. Execute microdissecações com o Sistema de LCM de acordo com as instruções do fabricante ^24. Uso patologista marcado lâminas como guias para a identificação de focos de cancro da próstata, bem como o tecido normal adjacente. Use o feixe de laser em uma pulsos 10-20 mm de diâmetro com uma potência de 70-90 mW.
         6. Áreas de captura de interesse com pulsos de laser infravermelho em bonés LCM. Combinar células de 2-5 cápsulas para a extração de miRNA por amostra. Para garantir a integridade de ARN extraído, imediatamente processar células capturadas para extracção miARN.
         7. Alternativamente, as células lisam em tampão de extracção de miARN (de acordo com o protocolo do fabricante) e STOre lisados ​​a -80 ºC.
      2. miARN Extracção e análises de LCM microdissecadas tecidos
         1. Extrair o ARN total a partir de tecidos FFPE microdissected utilizando um kit comercial, seguindo as instruções do fabricante.
            Nota: O rendimento de RNA de captura a laser miscrodissection é geralmente baixa. Portanto, o RNA é fluido em volumes baixos (20-30 ul) e utilizada para criação de perfil de expressão, utilizando ensaios de expressão de microRNA Taqman seguintes instruções do fabricante (também descrito na seção 2.2). Optimização de ARN de entrada para detecção por PCR em tempo real de miARNs maduras sugere que o 5 ul do ARN eluído é óptima para cada reacção de transcrição reversa miARN-específicos. Como um controle endógeno, RNU48 / RNU24 é usado. Para as reacções de controlo, 2 ul do ARN eluído foi utilizado para a reacção de transcrição reversa.
   2. Isolamento de miRNA de cancro da próstata tecidos congelados
      1. Homogenhecer tecidos da próstata ressecados congelados por trituração dos tecidos em azoto líquido usando um almofariz e pilão. Transferir tecido homogeneizado para um tubo de microcentrífuga utilizando uma espátula arrefecida. Manter a argamassa / pilão e uma espátula à mesma temperatura por imersão em azoto líquido então homogeneizado de tecido pode ser facilmente transferido.
      2. Adicionar comercial de isotiocianato de guanidina-fenol reagente (1 mL / 0,1 g de tecido) para o tecido homogeneizado e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
         Nota: Os tecidos homogeneizados em reagente isotiocianato de guanidina-f enol comercial pode ser armazenado a -80 ° C durante vários meses.
      3. Adicionar clorofórmio ao homogeneizado (0,2 ml de clorofórmio / mL) e agitar vigorosamente durante 30 segundos. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 3-5 minutos, seguido por centrifugação a 10.000 xg durante 20 min a 4 ºC.
      4. Transferir a fase aquosa superior a um tubo de 1,5 ml estéril fresco livre de RNase.
      5. Adicionar um volume igual de álcool isopropílico. Misturar e incubar por 10 miN, à TA, seguido por centrifugação a 12.000 xg durante 20 min a 4 ° C para sedimentar a ARN.
      6. Aspirar o sobrenadante e lavar o sedimento de ARN com 1 mL de etanol a 70%. Centrifuga-se a 12000 xg durante 10 min a 4 ºC.
      7. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Sedimentos de RNA secar à temperatura ambiente durante 5-10 min. Dissolver RNA em 50-100 ul de água livre de nuclease.
      8. Realizar quantificação de ARN utilizando um espectrofotómetro NanoDrop determinar a integridade de ARN e com um Bioanalyzer. Ajustar a concentração de ARN e 10 ng / ul. Use 10-50 ng RNA para miRNA- reação cDNA específico seguido por análises em tempo real PCR (Seção 2.2).
2. PCR quantitativa em tempo real para análises de expressão de miARN
   Nota: miARNs maduros ensaio utilizando um protocolo de duas etapas de RT-PCR tal como descrito abaixo.
   1. Transcrição Reversa (RT)
      1. Realizar a transcrição reversa de ARN a partir de ADNc utilizando um kit de transcrição reversa miARN em conformidade com as instruções do fabricante.Use de 10-50 ng de ARN total com miARN iniciador específico do kit MicroRNA Ensaios e RT. Use RNU48 / RNU24 / RNU6B como controles. Dilui-se ADNc de 1: 5 a 1:10 (dependendo da abundância de miARN analisados) e utilizar na detecção em tempo real de PCR tal como descrito no passo seguinte.
   2. PCR em tempo real para detecção de miRNA maduro
      1. Amplificar produtos de PCR de amostras de ADNc utilizando os ensaios MicroRNA com uma mistura mestre universal de modo rápido de acordo com as instruções do fabricante. Normalizar amostras para RNU48 / RNU24 controle / RNU6B. Usar o método comparativo Ct (limiar de ciclo) para calcular as alterações relativas na expressão do gene no rápido tempo real do sistema de PCR. Analisar cada amostra em triplicado.

3. miRNA expressão análises por hibridação in situ (ISH)

1. Pré-tratamento de tecidos
   1. Corte 5 mm de blocos de tecido de câncer de próstata FFPE usando um micrótomo.
   2. Fix secções de tecido através da incubação das lâminas a 56 ° C durante 1 h.
      Nota: As lâminas podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante várias semanas para análises miARN.
   3. Deparrafinize os tecidos por imersão das lâminas com xileno (2 x), durante 15 min cada.
   4. Reidratar os tecidos através da incubação das lâminas durante 5 min cada em etanol graduado (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%), seguido por água destilada (5 minutos).
   5. Fixar as lâminas com paraformaldeído a 4% em PBS à temperatura ambiente durante 20 min.
   6. Lavam-se as lâminas com PBS (2x) à temperatura ambiente durante 5 min cada.
   7. Tratar as lâminas com 10 ug / ml de Proteinase K a 37 ° C durante 10 min em tampão de proteinase K pré-aquecido (5 mM Tris-HCl pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl a 1 mM).
   8. Seguindo o tratamento com proteinase-K, enxaguar as lâminas com 0,2% de glicina em PBS durante 30 segundos.
   9. Lavagem das lâminas em PBS (1x) à temperatura ambiente durante 5 min.
   10. Fixar as lâminas com paraformaldeído 4% em PBS durante 15 min.
   11. Lavar as lâminas comPBS durante 5 min.
2. Hibridização
   1. Pré-hibridar as lâminas com solução de pré-hibridação durante 3-4 horas a 55 ° C numa câmara humidificada. Use lenços de laboratório de tecido embebido em formamida 50% / 50% 5x SSC para manter a câmara úmida.
   2. Use 5 'sondas marcadas com digoxigenina a uma concentração de 20-50 nM em tampão de hibridação. Diluir sonda específica para miRNA (20-50 nM) e sonda de controlo U6 pequeno RNA nuclear (20 nM), aquecer a 90 ºC durante 4 minutos, coloque-o no gelo, e adicionar ao gelo tampão de hibridação frio (2-4 ng / mL ).
   3. Remoção da solução de pré-hibridação, adicionar solução de hibridação (sonda + tampão de hibridação, 100 ul por slide), incubar durante 12-16 horas a sonda de temperatura específicas de hibridação (temperatura = hibridação sonda-21 Tm ºC). Realizar hibridações em uma câmara humidificada (50% de formamida / 50% 5x SSC).
3. Lavar Passos
   1. Lavam-se as lâminas com 2x SSC durante 10 min a 45 ºC.
   2. Wash tele desliza com SSC 1,5x durante 10 minutos a 45 ºC.
   3. Lavar as lâminas com SSC 0,2x (2x) a 37 ºC durante 20 minutos cada.
   4. Incubar as lâminas com solução de bloqueio 1x durante 1-2 horas à temperatura ambiente
4. Detecção
   1. Incubar as lâminas com 1: 100 PBS diluído anticorpo anti-digoxigenina conjugado AP-para 1-4 horas ou durante a noite a 4 ºC.
   2. Lavam-se as lâminas com PBS (3x), temperatura ambiente, durante 10 min cada.
   3. Lavar as lâminas (2x) com fosfatase alcalina de tampão (100 mM Tris pH 9,5, 50 _mM de MgCl2, 100 mM de NaCl, 0,1% de Tween-20) à temperatura ambiente durante 5 min cada.
   4. Incubar as lâminas em substrato BM roxo AP no escuro à temperatura ambiente durante 1-20 horas.
   5. Lavar as lâminas com PBS contendo 0,1% de Tween-20 e de lavagem (2x) em água.
   6. Montar as lâminas utilizando uma mídia de montagem aquosas e examinar ao microscópio.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Perfil de expressão de miR-203 em amostras clínicas LCM cancro da próstata primário por RT-PCR análises (Figura 1)

Análises de RT-PCR da expressão relativa de miR-203 em LCM tecidos de cancro da próstata primário e as regiões adjacentes normais correspondentes foi realizada como descrito no Saini et ai. RNU48 ¹⁵ foi utilizada como um controlo. A tabela abaixo resume a expressão de miR-203 em relação a tecidos de tumor de cancro da próstata r...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Neste artigo, descrevemos um fluxo de trabalho simplificado para criação de perfil de expressão de miRNA em FFPE arquivados ou tecidos clínicos de câncer de próstata fresco congelado. No cancro da próstata, diversos estudos sugerem um papel importante na iniciação da microARNs cancro da próstata, progressão e metástase. No entanto, resultados conflitantes são frequentemente obtidos em um determinado miRNA ²² desde a extração de miRNA e analisa métodos diferem amplamente. Em vista da evidência...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtome	Leica Biosystems	RM2255
Arcturus Autopix for LCM	Arcturus/ Life Technologies	LCM1621/LCM1110	Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used.
CapSure Macro LCM Caps	Life Technologies	LCM0211
miRNeasy FFPE Kit	Qiagen	217504
7500 Fast Real-time PCR System	Applied Biosystems/ Life Technologies	4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit	Applied Biosystems/ Life Technologies	4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix	Applied Biosystems/ Life Technologies	4352042
DIG labeled LNA probe for U6	Exiqon	99002-01
BM Purple AP substrate	Roche	11442074001
Pre-hybridization solution	Biochain	K2191050-1
Hybridization solution	Biochain	K2191050-2
Blocking solution	Biochain	K2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibody	Biochain	K2191050-7
Aqueous mounting media	Vector Laboratories	H-5501
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)	Life Technologies	15596-018
Harris hematoxylin	Statlab	SL200
Eosin	Statlab	SL201