Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organot�icas Usando desvitalizado derme humana

Resumo

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Resumo

Culturas organotípicas permitir a reconstituição de um ambiente 3D crítica para interacções de contacto célula-célula e célula-matriz que imita a fisiologia e função dos seus homólogos de tecido in vivo. Isto é exemplificado por culturas de pele organot�icas que recapitula fielmente a diferenciação epidérmica e programa de estratificação. Queratinócitos epidérmicos humanos primários são geneticamente manipuláveis ​​através de retrovírus onde os genes podem ser facilmente sobre-expressos ou derrubado. Estes queratinócitos geneticamente modificados podem então ser usadas para regenerar epiderme humana em culturas organotípicas de pele proporcionando um poderoso modelo para estudar vias genéticas crescimento epidérmico de impacto, a diferenciação e a progressão da doença. Os protocolos aqui apresentados descrevem métodos para preparar derme humana desvitalizados, bem como manipular geneticamente queratinócitos humanos primários, a fim de gerar culturas organotípicas de pele. Pele humana regenerado pode ser usado em downstream aplicações, tais como perfil de expressão gênica, immunostaining, e imunoprecipitações cromatina seguido de seqüenciamento de alta taxa de transferência. Assim, a geração destas culturas organotípicas de pele geneticamente modificados permite a determinação dos genes que são essenciais para a manutenção da homeostase da pele.

Introdução

A epiderme humana é um epitélio estratificado que se conecta à derme subjacente através de uma matriz extracelular conhecida como a epiderme zone.The membrana basal não somente serve como uma barreira impermeável para impedir a perda de humidade, mas também como uma primeira linha de defesa para proteger o corpo de substâncias estranhas e tóxicas ^1. A camada basal, que é a camada mais profunda da epiderme, contém as células estaminais e progenitoras da epiderme que dão origem a progenia diferenciada para que formam o resto da epiderme ^2. Como as células progenitoras diferenciam epidérmicas que migram para cima para formar a primeira camada de células diferenciadas conhecidos como a camada espinhosa ^3. Na camada espinhosa, as células ligar a expressão de queratinas 1 e 10, que, em seguida, fornecer a força necessária para suportar o esforço físico para as camadas diferenciadas da epiderme. À medida que as células da camada espinhosa diferenciar ainda mais, que se movem para cima na epiderme para am a camada granular, que é caracterizada pela formação de querato-hialina e grânulos lamelares, bem como proteínas estruturais que são montados por baixo da membrana de plasma. Como as células em prosseguir o processo de diferenciação, as proteínas abaixo da membrana plasmática estão transversal ligados uns aos outros, enquanto os grânulos lamelares são extrudadas a partir das células de modo a formar uma barreira de lípidos ricos chamada estrato córneo ^4.

As doenças que envolvem alterações no crescimento epidérmico e impacto diferenciação ~ 20% da população ^5. Assim, o entendimento dos mecanismos deste processo é de grande importância. Desde manifestação de muitas destas doenças é contingente após a célula-célula ou célula-matriz de contacto, as culturas organotípicas de onde a epiderme humana é reconstituída num ambiente 3D foram criadas ^6-10. Estes métodos envolvem tipicamente a utilização de queratinócitos primários ou transformadas semeadas em matriz extracelular, tais como humano desvitalizadoderme, Matrigel, ou colagénio.

Para compreender os mecanismos regulatórios dos genes que são importantes no crescimento e na diferenciação da epiderme, os queratinócitos podem ser geneticamente manipulados através de vectores retrovirais para knockdown ou sobre-expressar genes em cultura e em seguida reconstituída 2D em 3D. Estes métodos têm sido amplamente utilizados para caracterizar genes envolvidos na haste epidérmica de células progenitoras e de auto-renovação e diferenciação, bem como a progressão para neoplasia ^11-21. Aqui, um protocolo em profundidade sobre como alterar a expressão genética em culturas organotípicas epidérmicas através da utilização de retrovírus é fornecido.

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Protocolo

O protocolo de pele humana foi realizada em conformidade com as diretrizes da Universidade da Califórnia, o Comitê de Ética em Pesquisa do San Diego. A pele humana pode ser obtido a partir de amostras cirúrgicas descartados ou comprados a partir de bancos de pele (pele banco está listado na Tabela de Materiais / Equipamentos). A localização, onde a pele é derivado a partir de ou a idade do dador não é crítica para a experiência, enquanto as proteínas da membrana basal (zona de colagénio / laminina) na derme não são degradados.

1. Preparação de desvitalizados derme humana

1. Ao receber a pele humana, colocar o tecido no capuz de cultura de tecidos de descongelar (~ 3-5 min). Dependendo do tamanho da pele, colocar o tecido descongelado num descartável tubo de 50 ml estéril ou frasco de 125 ml. O tamanho típico da pele a partir do banco de pele é de 0,75 pés quadrados.
2. Encha o depósito de 75% completo com penicilina e estreptomicina 4x (pen / strep) em 1x PBS. Agite vigorosamente durante5 min e descarte do líquido. Repita este passo mais 3 vezes.
3. Após a última lavagem, transferir o tecido para um novo tubo / frasco e adicionar 4x fresco Pen / Strep / PBS para encher 75% do recipiente. Incubar esta mistura numa incubadora de cultura de tecidos a 37 ° C durante 2 semanas para permitir a separação da derme da epiderme.
4. Sob condições estéreis, utilizar uma pinça para descascar a epiderme da derme. A derme é completamente branco enquanto a epiderme terá coloração, dependendo da raça do doador (Figura 1A). Descarte a epiderme acordo com o protocolo da instituição para lidar com o tecido humano.
5. Coloque a derme em um tubo ou garrafa e lavá-lo em 4x pen / strep diluído em 1x PBS com agitação forte (5 mínimo de lavagens por 4 vezes). Após a última lavagem, transferir a derme para um novo tubo / frasco em 4x pen / strep diluído em 1x PBS e armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para uso. Derme pode ser armazenado a 4 ° C durante até um ano.

2. modificar geneticamente Primária queratinócitos humanos

NOTA: Use pilhas phoenix anfotr�icas cultivadas em meio DMEM completo [DMEM + 10% de soro fetal bovino (FBS) + pen / strep] para produzir o vírus para infectar queratinócitos humanos primários. Genes de empacotamento virais que codificam proteínas tais como gag-pol e do envelope são integrados de forma estável no genoma da célula Phoenix que permite a produção de vírus quando transfectada com um vector retroviral. Phoenix células podem ser transfectadas com alta eficiência, permitindo a produção em alta título viral. Vírus produzido a partir desta linha de embalagem também pode infectar uma grande variedade de células de mamíferos incluindo o ser humano.

1. Dia 1: No dia antes da transfecção, as células Phoenix semente em uma placa de 6 poços a uma densidade de 800.000 células por poço em meio DMEM completo.
2. Dia 2: O dia da transfecção, 3 ug de utilizar vectores retrovirais por poço. Aliquota de 3 ug de vector retroviral para um tubo de 1,5 ml. Use uma mistura de 100 μ; l DMEM mais 6 ul de reagente de transfecção para cada 3 ug de vector. Misturar 6 ul de reagente de transfecção com 100 ul de DMEM em um tubo de 1,5 ml. (Os vectores retrovirais que são usados ​​estão indicados na tabela do equipamento / materiais).
   1. Incubar durante 5 min e adicionar 106 uL da mistura para dentro do tubo de pré-alíquota contendo a 3 ug de vector retroviral. Misturar e incubar à TA durante 30 min. Adicionar gota a gota toda esta mistura a cada poço das células Phoenix.
3. Dia 3: O dia após a transfecção, remova a mídia a partir das células phoenix e adicionar 2 ml de meio DMEM completo fresco. No mesmo dia, semear queratinócitos humanos primários em placas de 6 poços a uma densidade de 75.000 células por poço. Manter os queratinócitos em um meio de soro livre de queratinócitos (KCSFM) com antibióticos (pen / strep).
   NOTA: queratinócitos humanos primários foram comprados. As células podem ser adquiridos a partir de uma variedade de fornecedores (listada na tabela de material / Equipamento).
4. Dia 4: Harcolete a mídia a partir das células transfectadas phoenix, que agora contém partículas virais. Passe a mídia através de um filtro de 0,45 um, utilizando uma seringa (para remover quaisquer células phoenix contaminantes) e coloque 2 ml para os queratinócitos (banhados em 75.000 células / poço no dia anterior: ver passo 2.3). Adiciona-se brometo de hexadimetrina (5 ug / ml) para os meios para ajudar a mediar o processo de infecção. Títulos virais são de 1 x 10 ~ ⁷ TU / mL.
   1. Rodar as placas de 6 poços numa centrífuga a 200 xg durante 1 h à TA. Após a rotação, remova a mídia que contém vírus e lavar as células uma vez com 1x PBS antes de adicionar KCSFM.
5. Dia 5: infectar o mesmo lote de queratinócitos de novo como no passo 2.4.
   NOTA: Escolha os queratinócitos usando um fármaco se houver um marcador seleccionável no vector retroviral e expandir para uso em análise ou aplicações, tais como as culturas organotípicas de jusante.

3. Configurando culturas de pele organot�icas

1. Construir ocassete organotípico a partir de materiais comuns encontrados no laboratório ou as cassetes podem ser feitos através de uma oficina de fabricação de metal (Figura 2A - F). Para fazer com que essas cassetes de 3,5 cm de uma placa de cultura de tecido, utilizar um cautério para remover um 1,0 cm x 1,0 cm quadrados do centro da tampa de uma 3,5 cm de prato (Figura 2A-B). Faça isso em condições estéreis.
   1. Anexar pinos quadrados para a parte inferior da cassete (tampa de 3,5 cm de placa) utilizando claro unha polonês (Figura 2C). Permitir 5 min para a unha polonês para secar e virar a cassete de forma que ele está descansando sobre os pinos quadrados (Figura 2D). Coloque a cassete em um disco de 6 cm.
      NOTA: Praça estacas podem ser comprados a partir de uma variedade de lojas de artesanato.
2. Preparar o meio de crescimento de queratinócitos (KGM) composta de 66% de DMEM, 22% de F12 de Ham, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 10% de FBS, 2,67 ug / ml de adenina, 40 Ng / ml de hidrocortisona, 10 ng de toxina da cólera ml /, 4,94 ug / ml de insulina, 5 ug / ml de transferrina, 1,36 ng / ml triiodo-L-tironina, 10 ng / ml de EGF, e 10 ug / ml de cloridrato de ciprofloxacina. Filtra-se a meios de comunicação através de um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C até estar pronto para usar.
3. Aqui a derme para fora da 4x Pen / Strep + solução de PBS e lavar 2 vezes em KGM e em seguida incuba-se a 37 KGM ° C durante dois dias antes da utilização.
4. Corte a derme utilizando um bisturi para 1,5 cm x 1,5 cm pedaços de tamanho e, em seguida, coloque-a cassete organotípico. Coloque a derme com a parte superior da derme virados para cima. A parte superior da derme será o lado que entra em contacto com os queratinócitos (Figura 1B).
5. Coloque a derme pré-cortadas para o furo quadrado da cassete organotípicas com o lado superior da derme voltadas para cima (Figura 3A).
6. Virar toda a cassete organotípico contendo a derme mais usando uma pinça (Figura 3B). Descongelar a solução de matriz extracelular em gelo. Use uma agulha e seringa para tirar 100 ml de solução de matriz extracelular por cassete. Adicione 5 gotas para o fundo da derme (lado brilhante) e agitar ligeiramente para assegurar uma distribuição uniforme da derme (Figura 3B).
7. Permitir 5 min para a solução comercial de matriz extra-celular para solidificar completamente (Figura 3C). Após a solidificação, utilize uma pinça para rodar a fita para trás sobre. Adicionar 4 ml de KGM com o disco de 6 cm.
8. Coloque 0,5-1 milhões de queratinócitos geneticamente modificados para as cassetes organot�icas contendo a derme (Figura 3D).
   1. Tripsinizar queratinócitos por colocar 4 ml de tripsina a 0,05% em placas de 10 cm durante 5 minutos e diluiu-se com 4 ml de meio DMEM completo.
   2. Contagem dos queratinócitos utilizando um hemocitómetro e, em seguida girar a 200 xg durante 5 min. Ressuspender as células 0,5-1 milhões (dependendo do número de células disponíveis) em 90 μl de KGM e colocar todas as células para a derme.
      NOTA: É importante colocar o mesmo número de células na derme dentro da mesma experiência para assegurar que quaisquer diferenças observadas na espessura da epiderme regenerada não é devido a diferenças no número de células de partida. Colocando menos de 0,5 milhões de células em derme pode levar a uma má estratificação e diferenciação.
9. Mudar meios KGM sobre as culturas organotípicas de todos os outros dias. Tecido colheita 1-14 dias após a colocação dos queratinócitos na derme. Estratificação completa e diferenciação da epiderme geralmente ocorre após o dia 5.

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Resultados

O primeiro passo na geração de pele humana organotípica é remover a epiderme da derme. A incubação de duas semana da pele a 37 ° C em 4x Pen / Strep / PBS deve permitir a separação da derme da epiderme (Figura 1A). Se a separação da epiderme e da derme, em seguida, é difícil colocar o tecido a 37 ° C em 4x Pen / Strep / PBS durante uma semana e, em seguida, tente novamente casca utilizando fórceps.

Uma das chaves para a regeneração da epiderme humana na derm...

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Discussão

A manipulação genética na pele humana culturas organotípicas oferecem muitas vantagens para comumente estudada 2D células cultivadas, bem como modelos de mouse. Culturas 2D faltam os três célula-célula e célula-matriz extracelular interacções dimensionais encontradas em tecidos e órgãos intactos. Estudos recentes também têm encontrado enormes diferenças entre as células de câncer de pele cultivadas em 2D e 3D com as células cultivadas em 3D que mostram muito mais semelhanças de expressão do gene par...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human skin	New York Firefighters Skin Bank	http://www.cornellsurgery.org/pro/services/burn-surgery/skin-bank.html
PEN/STREP	GIBCO	15140-122
amphotropic phoenix cell lines	ATCC	CRL-3213
FUGENE 6 transfection reagent	Promega	E2691
Keratinocyte Media (KCSFM)	Life Technologies	17005042
DMEM	GIBCO	11995
Ham's F12	Cambrex	12-615F
FBS	GIBCO	10437-028
Adenine	Sigma	A-9795
Cholera Toxin	Sigma	C-8052
Hydrocortisone	Calbiochem	3896
Insulin	Sigma	I-1882
EGF	Invitrogen	13247-051
Transferrin	Sigma	T-0665
Ciprofloxacin Hydrochloride	Serologicals	89-001-1
cautery	Bovie Medical Corporation	AA01
Matrigel	Corning	354234
Keratin 1 antibody	Biolegend	PRB-149P
square pegs	Arts and crafts stores
human neonatal keratinocytes	ATCC	PCS-200-010
human neonatal keratinocytes	Cell Applications	102K-05n
MSCV retroviral vector	Clontech	634401
LZRS retroviral vector	Addgene
pSuper.Retro.Puro Retroviral vector	Oligoengine	VEC-PRT-0002
hexadimethrine bromide	Sigma	H9268-5G