Um cromossomo Dropping Ar seco rápido Método de Preparação Adequado para FISH em plantas

Resumo

A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.

Resumo

Preparação dos spreads de cromossomos é um pré-requisito para o bom desempenho de hibridização fluorescente in situ (FISH). Preparação de alta qualidade para barrar planta cromossômicas é desafiador devido à parede celular rígida. Um dos métodos aprovados para a preparação dos cromossomas de plantas é uma preparação gota chamada, também conhecido como espalhando-gota ou técnica de secagem ao ar. Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação rápida do cromossomo mitótico espalha adequado para a detecção de sondas de DNA FISH individuais e elevado número de cópias. Este método é uma variante melhorada do método de gota, seca ao ar realizada sob uma humidade relativa de 50% -55%. Este protocolo compreende um número reduzido de etapas de lavagem fazendo sua fácil aplicação, eficiente e reprodutível. Óbvios benefícios desta abordagem são bem-propagação, cromossomos metafásicos não danificadas e numerosos que servem como pré-requisito perfeito para análise FISH bem sucedido. Usando este protocolo obtivemos chrom de alta qualidadeosome spreads e resultados PEIXES reprodutíveis para Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum e Secale cereale.

Introdução

Hibridização fluorescente in situ (FISH) é uma ferramenta eficaz para o mapeamento físico de sequências de cópia única e de alta no nível cromossômico. Pré-requisito é a preparação dos spreads de cromossomos de alta qualidade. Não existe um protocolo de preparação geral descrito cromossoma que seriam igualmente adequados para células animais e vegetais. Preparação dos cromossomas de plantas é particularmente difícil devido à rígida parede celular e vários consistência citoplasma dentro de espécies diferentes. Um dos métodos mais favoráveis ​​para a preparação dos cromossomas de plantas é uma assim chamada técnica de gota também conhecida como técnica de espalhamento gota e a técnica de secagem ao ar ^1,2. Este método foi introduzido pela primeira vez em 1958 por Rothfels e Siminovitch in vitro para células de mamíferos cultivadas ^3. Mais tarde, Martin et al. ⁴ e Kato et al. ⁵ este método adaptado para plantas.

Mais recentemente, um método chamado '& SteamDrop# 39; foi desenvolvido o qual utilizado vapor de água para a preparação de cromossomas que não se sobrepõem ^6. Embora, a influência positiva da alta umidade foi observado anteriormente ^7, 'SteamDrop' oferece um fluxo de trabalho controlado de preparações cromossômicas de alta qualidade ^6. O tratamento de vapor faz com que o alongamento de cromossomas, provavelmente ligados a algumas modificações de proteínas cromossómicas. A qualidade dos resultando metáfase é muito elevado, apesar de retenção de número suficiente de metaphase completa espalha para experimentos FISH subsequentes exige conhecimentos técnicos.

Aqui é apresentado um protocolo para a preparação dos cromossomas de cereais mitóticas adequados para a detecção de sondas FISH individuais e elevado número de cópias ^5,8. Este método é uma variante melhorada do método de gotejamento, seca ao ar descrito por Kato ⁹ realizada sob uma humidade relativa de 50% -55% (Figura 1). Este protocolo compreende um número reduzidode etapas de lavagem fazendo sua fácil aplicação, eficiente e reprodutível. Usando este protocolo obtivemos os spreads de cromossomos de alta qualidade e os resultados peixe para Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum e Secale cereale.

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Protocolo

1. Preparação Chromosome

1. A germinação das sementes e fixação de pontas de raiz
   1. 10-20 germinar sementes de cevada em duas camadas de papel de filtro húmido numa placa de Petri em condições escuras durante 2 dias a 22-24 ° C. Cortar raízes vigorosos com o comprimento de 1-2 cm a partir da semente, utilizando uma lâmina de barbear.
   2. Prepare água gelada, colocando uma garrafa de vidro de 500 ml contendo água fria da torneira em esmagado gelo-água. Arejar a água gelada e mergulhe dicas de raiz durante 20 horas para aumentar a freqüência de células em metafase.
   3. Transferir raízes a partir de água a 50 ml de etanol: ácido acético (3: 1) fixador para fixá-los à temperatura ambiente durante 2 dias. Armazenar em raízes recentemente preparada etanol: ácido acético (3: 1) fixador, a 4 ° C até à sua utilização até um ano.
2. Lavar e tratamento enzima
   1. Lavam-se as raízes 10-20 com 30 ml de gelo-água fria da torneira durante 5 minutos duas vezes, utilizando uma proveta de vidro de 50 ml. Use microscópio binocular. Transferir raízes, um por um em30 ml de tampão 0,01 M de citrato (0,01 M de ácido cítrico + citrato de sódio 0,01 M, pH 4,8) usando uma pinça e lavar por agitação da proveta de vidro durante 5 min, duas vezes. Coloque raízes em papel de filtro para remover completamente o líquido e de corte do tecido meristemático não indesejada utilizando uma lâmina de barbear.
   2. Incubar até 20 pontas de raízes em 1 ml de mistura de enzima a 37 ° C durante cerca de 50 minutos para amaciar o tecido da planta (Tabela 1) em um vidro de relógio. Mistura enzimática contém 0.7% celulase R10, 0.7% celulase, 1% e 1% pectolyase cytohelicase diluída em tampão de citrato 0,01 M. Armazenar a mistura da enzima, a -20 ° C e reutilizado até cinco vezes.
   3. Remover a enzima por pipetagem e lavar as pontas de raiz em gelo com 5 ml de tampão de citrato 0,01 M, duas vezes para substituir a enzima residual.
3. Maceração Root
   1. Pontas de raiz de lavagem com 1 ml de etanol a 96%, duas vezes cuidadosamente no mesmo vidro de relógio. Substituir etanol com fixador preparado de fresco (75% de ácido acético: etanol a 25%). Use 10-15fixador ul por ponta da raiz.
   2. Pontas de raiz de transferência juntamente com o fixador para um tubo de 2 mL e se desintegram meristemas da raiz com uma agulha de dissecação ou fórceps. Toque o tubo 20 vezes para as células re-suspensão para se obter uma suspensão de células. Armazenar a suspensão de células a -20 ° C até dois meses.
4. Deixando cair da suspensão de células
   1. Coloque 2-3 camadas de tecido de papel embebido em água em uma placa quente a 50 ° C. Imergir as lâminas microscópicas na água gelada da torneira na geladeira por 30 minutos. E lugar desliza em cima do lenço de papel úmido.
   2. Pipeta 7-10 ul de suspensão celular e solte-o a uma distância de 20 cm para o slide arrefecida colocada sobre a placa quente. Pipeta 10 ml de mistura de ácido acético-etanol no mesmo lugar como suspensão de células no slide e manter a lâmina sobre a placa quente durante mais 2 min. Coloque o slide no prato quente sem o tecido molhado e deixe secar por 1 min.
5. Controle de qualidade e de armazE de lâminas
   1. Verificar lâminas através de um microscópio de contraste de fase para controlar a qualidade da propagação cromossoma. Utilizar lâminas, quer no mesmo dia ou da loja por imersão em etanol a 96% em um frasco Coplin a -20 ° C.
6. O pré-tratamento das lâminas antes FISH; todos os passos são realizados à TA
   1. Colocar as lâminas em um frasco Coplin contendo 50 ml de 2x SSC (20x SSC contém 3 M NaCl e 300 mM de citrato trissódico) por 5 min. Utilizando uma pinça, slides de transferência para uma jarra de Coplin contendo 50 ml de ácido acético 45% para 3-10 min.
   2. Transferir as lâminas para um frasco Coplin contendo 50 ml de SSC 2x durante 10 min. Lâminas de transferência para uma jarra de Coplin contendo 50 ml de formaldeído 4% (em 2x SSC) e mergulhe as lâminas por 10 min para corrigir cromossomos.
   3. Remover o formaldeído por lavagem das lâminas 3 vezes durante 4 min cada, num frasco Coplin contendo 50 ml de SSC 2X. Desidratar slides em uma jarra de Coplin por 2 min em séries de 70%, 90% e 100% de etanol, respectivamente, e lâminas secas no plano verticalposição.

2. fluorescente hibridação in situ (FISH)

1. Para cada lâmina, preparar uma solução de hibridação de 20 ul, no total, utilizando 10 ul de formamida desionizada, 5 uL de tampão de 4x hibridação (ul de tampão 200 contém 80 ul de SSC 20x, 8 ul de 1 M de Tris-HCl pH 8,0, 1,6 mL de 0,5 M EDTA, 11,2 ul 10 mg / mL de esperma de salmão e 99,2 ul DNase-livre água), 3 ul da sonda e 2 mL de água livre de DNase.
2. Adicionar 20 ml de solução de hibridação por lâmina e cobrir com uma lamela de 24 x 32 mm e prender a lamínula com cimento de borracha. Desnaturar lâminas com sondas simultaneamente a 80 ° C durante 2 minutos numa placa de aquecimento.
3. Transferir as lâminas para uma câmara húmida e incubar a 37 ° CO / N evitando a luz. Remover lamelas enxaguando os slides em uma jarra de Coplin com 2x SSC. Colocar as lâminas em um frasco Coplin contendo 55-60 ° C 2x SSC e incubar por 20 min.
4. Colocar as lâminas 2x SSC em um frasco Coplin durante 2 min à temperatura ambiente. Desidratar lâminas em um frasco Coplin durante 2 min em série de 70%, 90% e etanol a 100%, respectivamente.
5. Secar as lâminas e contrastante com 1 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) em antifade meio de montagem, evitar a luz intensa.

3. A análise microscópica e armazenamento

1. Analisar os slides usando um microscópio de epifluorescência. A seleção do filtro depende do fluorocromo utilizado para a rotulagem sonda. Se necessário, armazenar as lâminas a 4 ° C, no escuro, até um ano.

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Resultados

Lâminas microscópicas com os diferenciais de mitose em metafase foram preparados pelo método de preparação rápida, seca ao ar de gotejamento cromossoma descrito acima (Supl. Figura 1). Análise dos peixes foi realizada utilizando ambos, seqüências repetitivas e de cópia única. As imagens foram obtidas através de um microscópio de epifluorescência, com um conjunto de filtros que permitem excitação de fluoróforos correspondentes e captada por uma câmara CCD monocromática de alta sensibil...

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Discussão

O experimento cromossoma preparação foi levada a cabo usando raízes novas de cereais pertencentes à família das gramíneas (Poaceae). Todas as espécies analisadas têm 14 relativamente longo mitóticas cromossomos metafásicos (11-15 um) no conjunto de genoma diplóide e pertencem a espécies de grande genoma (5,1-7,9 GBP).

Comprimento de raízes germinadas não era mais do que 2 cm, para se obter um máximo de tecido meristemático. Sincronização de células em divisão foi atingido...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hot Plate	MEDAX GmbH	12603
Cellulase R10	Duchefa	C8001
Cellulase	CalBioChem	219466
Pectolyase	Sigma	P3026
Cytohelicase	Sigma	C8274
Texas Red-12-dUTP	Invitrogen	C3176	direct fluorochrome
Fluor488-5-dUTP	Invitrogen	C11397	direct fluorochrome
Fluorecsence microscope	Olympus BX61	BX61
CCD camera	Orca ER, Hamamatsu	C10600
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	fluorecsent dye