Um operante intra / extra-dimensional Set-shift-Tarefa para ratos

Resumo

Attentional set-shifting cognitive abnormalities are a core feature of many psychiatric diseases. Here, we present the development of a novel automatic system for the effective study of attentional set-shifting abilities, executive functions and other cognitive abilities in mice with high translational validity to human studies.

Resumo

Alterations in executive control and cognitive flexibility, such as attentional set-shifting abilities, are core features of several neuropsychiatric diseases. The most widely used neuropsychological tests for the evaluation of attentional set-shifting in human subjects are the Wisconsin Card Sorting Test (WCST) and the CANTAB Intra-/Extra-dimensional set shift task (ID/ED). These tasks have proven clinical relevance and have been modified and successfully adapted for research in animal models. However, currently available tasks for rodents present several limitations, mainly due to their manual-based testing procedures, which are hampering translational advances in psychiatric medicine. To overcome these limitations and to better mimic the original version in primates, we present the development of a novel operant-based two-chamber ID/ED "Operon" task for rodents. We demonstrated the effectiveness of this novel task to measure different facets of cognitive flexibility in mice including attentional set formation and shifting, and reversal learning. Moreover, we show the high flexibility of this task in which three different perceptual dimensions can be manipulated with a high number of stimuli cues for each dimension. This novel ID/ED Operon task can be an effective preclinical tool for drug testing and/or large genetic screening relevant to the study of executive dysfunction and cognitive symptoms found in psychiatric disorders.

Introdução

Attentional set-shifting é uma medida de flexibilidade cognitiva e funções executivas ^1. Refere-se à capacidade de alternar entre normas internas arbitrários ("sets cognitivo-atencional"). As tarefas neuropsicológicas mais utilizados para medir atencional set-shifting e flexibilidade cognitiva em seres humanos são o Wisconsin Card Sorting Test ^(WCST) 2 e uma versão mais recente e mais refinado: o intra e extra-dimensional atencional de mudança de set (ID / ED) da Cambridge neuropsicológica Automated Test Battery (Cantab) ^3,4. Essas tarefas têm sido usados ​​para identificar anormalidades cognitivas específicas em uma ampla gama de distúrbios mentais, incluindo esquizofrenia, autismo ^{5 6,} distúrbios doença de Parkinson ^7, transtorno obsessivo-compulsivo ^{8 e} déficit de atenção / hiperatividade ^9. A relevância clínica e abordagem metodológica sólida do WCST e ID / testes ED têm attracted interesse na implementação de testes semelhantes em investigação pré-clínica ^10,11. Estas tarefas permitem a medição seletiva dentro do mesmo assunto de diferentes habilidades cognitivas, tais como aprendizagem discriminativa, aprendizagem reversa, a formação de um conjunto de atenção, passando de atenção dentro da mesma dimensão (. Ie, mudança intra-dimensional: IDS) e entre diferentes dimensões perceptivas (isto é, mudança extra-dimensional:. EDS). Isto é crucial, pois os circuitos cerebrais distintos, bem como neuropatologia pode alterar estas funções cognitivas distintos de diferentes maneiras. Por exemplo, uma dupla dissociação ou especialização funcional efeito foi demonstrada entre a lateral (em macacos e seres humanos) / medial (em roedores) e regiões orbitais do PFC nas tarefas de deslocamento conjunto de atenção. Enquanto o córtex órbito-frontal está mais envolvido nas fases reversão destas tarefas, a região PFC lateral / medial regula os estágios de mudança de extra-dimensionais^12-14.

Versões de roedores destes testes de mudança de conjunto de atenção para os primatas foram gerados com êxito ^13-16. No entanto, alguns aspectos dessas versões de roedores foram limitando suas aplicações e utilização. Por exemplo, essas tarefas são executadas manualmente e, portanto, altamente e difícil padronização de trabalho intensivo. Além disso, a presença de reforços alimentares dentro dos estímulos pode levar a uma interpretação ambígua de respostas dos animais e potencial viés na escolha de tomada ^10. Essas características têm limitado a rentabilidade dos ensaios e, mais importante, a sua aplicação em estudos genéticos e / ou de despistagem de drogas em grande escala.

Para superar essas limitações e aumentar as aplicações potenciais de paradigmas de mudança de ID / ED em roedores, apresentamos aqui uma tarefa baseada operante de duas câmaras romance para testar a flexibilidade cognitiva em ratos. Esta tarefa romance imita a tarefa ID / ED usada em humanos e não-primatas humanos e contorna os problemas das versões anteriores do roedor.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Ministério da Saúde e do Comité Uso de Animais italiano local e foram conduzidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório das Directivas da Comunidade Europeia.

Nota: A Figura 6 mostra um cronograma de todo o processo do protocolo para testar ID tarefa / ED.

1. Aparelho

Figura 1. O aparelho de duas câmaras "Operon". (A) Vista de topo de todo o aparelho e vista (B) a partir da frente de uma única câmara de rato que imita o ponto de vista durante o ensaio. 1: estímulos visuais (LEDs); 2: revista de alimentos; 3: buraco nariz puxão; 4: estímulo tátil (textura); 5: estímulo olfativo; 6: porta de correr automática; 7: casa -claro; 8: photobeam infravermelho para o controle da porta. Secções (16 x 16 x 16 cm ³⁾ estão separados por uma porta de plástico transparente (6). Photobeams infravermelhos (8) acompanhou os movimentos de animais e controlado a abertura / fechamento da porta automática para permitir que o mouse para mudar câmaras. Cada câmara apresenta dois furos nariz puxão (3) com photobeams infravermelhos, e, entre eles, uma revista de alimentos (2) com photobeams onde um distribuidor de pellet entregues o reforço alimentar. Uma casa-luz (7) está localizado por cima de cada um dos dois compartimentos do alimento. Cada buraco nariz puxão está equipado com uma série de estímulos variáveis ​​que podem variar em três dimensões perceptivas diferentes (odor, visão, tato). Originalmente publicado em "The ultimate intra e Task extradimensional Attentional Set-Shifting para Mice ^'19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

conteúdo "> Nota: O aparelho de Operon (Figura 1) consiste em duas câmaras idênticas com paredes de Plexiglas e um andar de alumínio (16 x 16 x 16 cm ^{3 para cada} câmara) câmaras estão separadas por um Plexiglas transparente que dividem porta que pode ser automaticamente. controlados para permitir o mouse para acessar qualquer câmara. Cada câmara tem dois buracos nariz puxão com photobeams infravermelhos, e, entre eles, uma revista de alimentos com photobeams onde um distribuidor de pellet entregues o reforço alimentar. Um ventilador e uma casa de luz estão localizados acima de cada um dos dois compartimentos do alimento.

1. Equipar cada orifício do nariz-puxão com um número de estímulos mutáveis ​​(Tabela 1) que variam em três dimensões perceptuais diferentes (isto é, o odor, visão, tácteis). Nota: Os estímulos sugeridos na tabela 1 foram selecionados a fim de evitar qualquer fator e / ou viés de confusão devido à evasão ou preferência. Cinco pares de exemplares para cada um com dimensão permitirteste em assunto de todos os turnos, com novos estímulos em cada turno.
   1. Para oferecer estímulos olfativos nos orifícios nariz puxão, use um olfatômetro de diluição, que a condição do ar de entrada para os buracos nariz puxão por dessecação automaticamente, filtrando, reidratação e controlar a apresentação de pares de aromas.
      1. Use um olfatômetro para controlar dois buracos nariz puxão. Regular o fluxo de ar por uma bomba de ar e um vácuo para a remoção do aroma nos furos nariz-puxão. Ligar a bomba de ar para a entrada do olfactómetro e o vácuo às saídas montados no dispositivo de nariz-puxão. Em seguida, conecte a saída para a entrega odor a cada entrada nariz puxão. Ajustar a taxa de fluxo de 1,5 litros por minuto.
      2. Diluir 1:20 aromas de odor em óleo mineral e encher as garrafas de olfactómetro.
   2. Para estímulos visuais, lugar diodos emissores de luz (LED) no topo de cada buraco nariz puxão e fixá-los no metal pAnel da câmara (ver detalhes na Figura 1 e Tabela 1). Ligá-los para a interface de saída.
   3. Para estímulos táteis, montar texturas piso mutáveis ​​na frente de cada buraco nariz puxão. Monte as diferentes texturas em apoio deslizante e movê-los usando quadros debaixo do chão, de modo que eles são apresentados em correspondência com uma pequena abertura (3 x 3 cm ²⁾ no chão na frente de cada buraco nariz puxão.
2. Controlar a apresentação de estímulos, usando software de acordo com as instruções do fabricante, a fim de alterar automaticamente a estímulos de diferentes dimensões durante a experiência.
3. Coloque uma câmera na parte superior do aparelho, a fim de registrar a atividade locomotora basal alternância e usando software de monitoramento comportamental (por exemplo., Ethovision, Anymaze), o que pode ajudar a eliminar os animais que têm problemas não relacionados com as funções cognitivas.

ODORES	TEXTURES	LUZES
pêssego v. sage	velcro v. filme	luzes acesas v luzes apagadas.
baunilha v. lavanda	grosseiro lixa v. lixa fina	v vermelho. verde
morango v. canela	suave papelão v. papelão ondulada	v azul. amarelo
grapefruit v. orégano	esponja v. plástico liso	laranja v. branco
limão v. apricot	honeycomb papel v folha de alumínio.	corrigir luzes v. luzes piscando

Tabela 1. Exemplares utilizados na tarefa ID / ED Operon. Discriminações compostos são baseados em combinações fixas de pares de exemplos (ver a figura 2 para um exemplo da sequência de discriminações). Os pares exemplares de dimensões diferentes são apresentados em combinações aleatórias. Estímulos neutros para as diferentes dimensões são: fluxo de ar sem cheiro; papel branco; não há estímulos luminosos. Tabela publicada originalmente em 'The Ultimate intra e Task extradimensional Attentional Set-Shifting para Mice' ^19.

2. Preparação de animal

Nota: Os resultados representativos aqui apresentados foram obtidos a partir de ratos machos C57BL / 6J, 3 a 7 meses de idade, durante a fase de luz.

1. Pese os ratos, isoladamente-house e depois lidar durante 1 min em trêsdias alternados.
2. Após uma semana de aclimatação para a aquisição de habitação único, ficha peso corporal e 24 horas de ingestão de alimentos por três dias consecutivos para determinar o peso da linha de base e ingestão de alimentos.
3. Aplicar uma ligeira regime de privação de comida para uma semana antes do treinamento para o teste. Verificar o peso dos animais diariamente durante a restrição alimentar ao longo da experiência para manter cerca de 90% do seu peso corporal inicial com alimentação livre. Durante três dias consecutivos antes da fase de treinamento de habituação, dar ratos em sua gaiola também ≈20 pelotas de reforço alimentar. Estas são as pastilhas alimentares que irão ser utilizados em testes subsequentes.
   Nota: A restrição alimentar é usado para aumentar a motivação dos animais para trabalhar na tarefa, no entanto, não exceder 10% da perda de peso durante qualquer fase de todo o procedimento, pois pode levar a comportamentos anormais e estresse excessivo para os ratos, que podem afetar os resultados.
   1. Alternativamente, a fim de evitar o alojamento individual, leav o alojados em grupo ratinhos (2-4 cada gaiola) e dar acesso a comida ad libitum por um período de tempo específico após o teste. Verificar o peso dos animais diariamente durante a restrição alimentar ao longo da experiência para manter cerca de 90% do seu peso corporal inicial com alimentação livre.

3. Habituação

1. Formar os ratos numa sessão de 1 dia de 40 min para se mover no interior do aparelho sem o divisor de porta, onde um nariz-puxão em qualquer resultado furo nariz-puxão num sedimento de entrega no recipiente de alimentos. Durante esta fase, use somente estímulos neutros (Tabela 1) para todas as dimensões diferentes (habituação 1).
2. No dia seguinte, treinar os animais durante 40 min para se deslocar de um compartimento para o outro no final de cada ensaio (habituação 2). Use estímulos neutros única para todas as dimensões diferentes. Também nesta fase, um nariz-picar em qualquer dos furos de nariz-puxão resulta numa entrega de sedimento na revista de alimentos.Quando o mouse recupera a recompensa na revista comida, abaixe a porta divisória para permitir o acesso do mouse para a outra câmara para a próxima prova.
3. No terceiro dia (Habituação 3), treinar os animais para executar duas discriminações simples (SD1 e SD2;. Por exemplo, velcro vs filme;. Cue luz sobre vs sugestão luz desligada; pêssego vs sábio.) Com um critério de 8 respostas corretas de 10 ensaios consecutivos. Não use esses exemplares novamente durante as próximas fases do teste.
   1. Para começar, coloque o mouse em uma câmara com estímulos neutros, enquanto na outra câmara as pistas estímulos estão ligados; em seguida, abaixe a porta para permitir o acesso do mouse para a câmara com as pistas estímulos ativados. O mouse tem que aprender a escolher o buraco nariz puxão onde o estímulo correto é apresentado. Sessões durar 40 min.
   2. Recompense um nariz-puxão no buraco correto com uma entrega de sedimento e quando o mouse entra na revista de alimentos, abaixe a porta divisóriapara dar o acesso do mouse para a outra câmara para a próxima prova. Não recompense um nariz-puxão no buraco incorreto e ligar a luz de casa por 5 s. Em seguida, abaixe a porta para permitir o acesso do mouse para a outra câmara para a próxima prova.
   3. Realizar os dez primeiros ensaios de cada etapa como moldar ensaios: se o mouse seleciona o buraco incorreto, gravar um erro, mas não finalizar o julgamento até que o mouse cutuca também no buraco correto. Em ensaios subseqüentes, se o mouse pica no furo incorreto, registrar um erro e desligue todos os estímulos dimensionais para encerrar o julgamento.
   4. Terminar cada sessão após 40 minutos ou se o mouse não efectuar qualquer resposta por cinco minutos consecutivos, o que viesse primeiro. Se o mouse não atingir o critério em uma sessão, continuar o teste no dia seguinte.
   5. Se um rato não pode alcançar o critério no SD1 ou SD2 da Habituação 3 depois de 5 sessões, interromper o teste do mouse e eliminá-lo a partir do estudo, porquenão é capaz de realizar com fiabilidade discriminações de base que poderia depois afectar os resultados da tarefa ID / ED.

Figura 2. Exemplo da tarefa ID / ED. Um exemplo da ID / ED 'preso-in-set' e paradigmas "de dois dimensão" é mostrado. Adaptado de "The ultimate intra e Task extradimensional Attentional Set-Shifting para Mice ^'19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. «Preso-in-set 'ID / ED Paradigm Procedimento

Nota: Para este procedimento, anteriormente usado em ambos os primatas e roedores ^7,15,16, é necessário para manipular três dimensões perceptivas diferentes paracada único rato testado. Tal como para as fases de habituação, todos os testes de sessões diárias começar por colocar o rato em uma das duas câmaras, onde todos os estímulos são neutras. Antes do início de um julgamento, as pistas do estímulo são ligados na câmara oposta. Então a porta dividindo é reduzida para permitir o acesso do mouse para a outra câmara onde as pistas do estímulo estão ligados.

1. Para treinar o animal para desenvolver um conjunto, ou viés, em direção a uma dimensão perceptual particular (. Por exemplo, odores, a luz ou textura do chão), expor os ratos aos seguintes discriminações apresentadas por esta ordem (ver também um exemplo na Figura 2):
   1. Para a discriminação simples (SD), introduzir os ratos a uma dimensão (odores, a luz ou textura, ver Figura 2) que é relevante em todas as tarefas até que a EDS. Isto é, a dimensão relevante é a que indica onde a resposta correcta. Seguindo o exemplo da Figura 2, apresentam dois odores, como vanilla (O1) e lavanda (O2), e selecione O1 como a resposta correta.
   2. Para a discriminação Composto (CD), introduzir uma segunda dimensão, por exemplo, a luz, o que é irrelevante (ou seja, não indicando se a resposta correta é). Apresente duas luzes (L1 e L2), em conjunto com os odores (O1 e O2), de modo a ter duas discriminações possíveis (ver exemplo na figura 2). Os exemplares correctas e incorrectas são os mesmos que na DP.
   3. Para a reversão da discriminação Composto (CDRE), deixe os exemplares ea dimensão relevante inalterada, mas têm os animais aprendem que o estímulo correto anteriormente está incorreto. Por exemplo, selecione lavanda como a resposta correta, com baunilha sendo agora a escolha incorreta. Essas mesmas condições serão encontradas para as outras fases de reversão (ie, IDSRe, IDS2Re e EDSRe).
   4. Depois disso, seleccionar um deslocamento intra-dimensional (IDS), na qual novos exemplares são usados ​​tanto para a relevantee as dimensões irrelevantes (um projeto total de mudança). Por exemplo, use morango e canela (O3 e O4) como os odores e azuis e amarelas luzes (L3 e L4), como as luzes. No entanto, garantir que os sujeitos de teste continuar a seguir a mesma dimensão relevante, a fim de encontrar a resposta correta. Estas mesmas condições vai ser encontrado para o outro deslocamento intradimensional (isto é, IDS2).
   5. Como para a discriminação anterior, têm os ratinhos executar a inversão do deslocamento intra-dimensional (IDSRe). Use as mesmas condições que no CDRE.
   6. Para Intra-dimensional mudança 2 (IDS2), use as mesmas condições que no IDS.
   7. Do mesmo modo, utilizar as mesmas condições que no CDRE para a mudança dimensional reversão intra-2 (IDSRe2).
   8. Na mudança Extra-dimensional (EDS), têm os ratos escolher o buraco correto após uma dimensão estímulo recém-apresentado. Apresente um par de estímulos de uma nova dimensão que é a textura. Por exemplo usar lixa grossa (T1) como o res correcçãoponse e lixa fina (T2) como incorreto, e apresentá-los com dois novos odores, por exemplo limão e damasco (O7 e S8). A dimensão anteriormente relevante agora se tornou irrelevante. Não apresente a dimensão anteriormente irrelevante anymore.
   9. Para a inversão extra-dimensional (EDSRe), ​​utilizar as mesmas condições que no CDRE.
2. Medir o desempenho dos ratinhos até atingirem um critério de 8 escolhas correctas de 10 ensaios consecutivos para completar cada fase. Definir o programa (ver a Tabela de Materiais) para mover automaticamente para a próxima fase após o critério é atingido. Pare de uma sessão diária após 40 min, ou se um rato não efectuar qualquer resposta por 5 minutos consecutivos, encerrar a sessão e continuar no dia seguinte com o mouse no mesmo palco onde parou.
   1. Para cada fase, medir o tempo para atingir o critério. Se um rato não atingir o critério em uma única sessão, soma-se o tempo total gasto em sessões consecutivas. Paracada ensaio, medir o tempo de apresentação dos estímulos (odores, luzes, texturas) para uma resposta nariz puxão (latência para responder).
3. No fim de cada sessão, limpar o dispositivo com 70% de álcool.
4. Use sempre a mesma ordem das discriminações. No entanto, aleatoriamente alterar as dimensões de estímulo e os pares de exemplares usados ​​e igualmente representá-los dentro dos grupos experimentais e contrabalançar-los entre os grupos.
5. Certifique-se de contrabalançar igualmente as dimensões perceptivas usados ​​dentro e entre cada grupo experimental para que cada possível mudança ED é representado (ou seja, a luz de odores, a luz de textura, odor à luz, odor a textura, textura de luz, textura de odor) . As combinações de exemplares são numerosos demais para permitir contrabalançar completo; portanto, para reduzir os graus de liberdade, use sempre exemplares em pares; por exemplo, estímulo de baunilha com lavanda, etc. (ver Tabela 1).

5. ID Procedimento / ED Paradigm 'Two-dimensão "

Nota: Outra condição para medir a capacidade de atenção de mudança de set, usado tanto em primatas e roedores ^{12,17 13,} é o paradigma 'de duas dimensões ". Neste caso, apenas duas dimensões perceptuais são usados ​​durante todo o ensaio.

1. Para este protocolo, a fim de utilizar as discriminações e o procedimento a seguir descrito para o protocolo 'preso-em-set' até ao estádio de EDS (ver um exemplo na Figura 2):
   1. Para a SD e as etapas seguintes, use os mesmos pares do "stuck-in-set ', até que o IDS2Re. Como mostrado no exemplo da Figura 2, usar dois odores (O1 e O2, O1 usar como estímulo correcto).
   2. Para o CD, como no protocolo 'preso-in-set', introduzir uma nova dimensão (por exemplo, luz, L1 e L2), que é irrelevante e serviria como um fator de confusão.
   3. O CDRE é semelhante ao in o protocolo 'preso-in-set', portanto, deixar os exemplares ea dimensão relevante inalterada, mas têm os animais aprendem que o estímulo correto anteriormente está incorreto (por exemplo, O1).
   4. Nos IDS, use sempre novos pares de estímulos para ambas as dimensões (O3 e O4, L3 e L4, onde O3 é o estímulo correto).
   5. Para o IDSRe, têm os ratinhos executar a inversão do IDS. Selecione o exemplar correto que é o que foi incorrecta durante o IDS (por exemplo, O4).
   6. Para o IDS2, introduzir novos pares de estímulos para ambas as dimensões (O5 e O6, L5 e L6).
   7. Como nas fases anteriores de reversão, na IDS2Re, têm os animais aprendem que o estímulo correcto anteriormente é agora incorrecta (por exemplo, O5).
   8. Para o protocolo 'de duas dimensões ", a EDS, os ratos têm de escolher a resposta correta após a dimensão anteriormente irrelevante agora torna-se a dimensão relevante. Assim, a luz é a nova dimensão relevante, whiCH indica a resposta correcta. Em particular, a luz vermelha (L7), é a resposta correcta. Por outro lado, a dimensão relevante anteriormente (no exemplo, o odor), é agora um irrelevante.
   9. Após a EDS, para a reversão (EDSRe), ​​utilizar mesmas condições que no CDRE. A dimensão relevante é o mesmo que no EDS mas os exemplos correctas e incorrectas são invertidos. Assim, por exemplo, a luz verde (L8) é agora a resposta correta.

Análise 6. Dados

1. Medir o desempenho por: número de tentativas para atingir o critério; tempo para atingir o critério (em minutos); tempo de apresentação dos estímulos para uma resposta nariz puxão (latência para responder).
2. Para a análise estatística, use ANOVAs com os diferentes estágios (SD, CD, CDRE, IDS, IDSRe, IDS2, IDSRe2, EDS, e EDSRe) como fator intra-sujeito para examinar o número de ensaios necessários para atingir os critérios, o tempo necessário para completar cada fase ea latência para responder. Contraduto análises post-hoc utilizando o teste de Newman-Keuls. Nota: O valor aceito para significância é p <0,05.

Resultados

A Figura 2 mostra um exemplo da tarefa ID / ED. Pares de estímulos (ou 'Discriminação 1' ou 'Discriminação 2') são apresentados de forma aleatória em cada etapa, eo rato deve escolher o estímulo correto em cada par. Neste exemplo tabela, o exemplar correto é relatado em negrito. Na primeira fase (SD ou discriminação simples), os estímulos apresentados nos dois buracos nariz puxão diferiam em uma das três dimensões (por exemplo, O1: Vanilla vs. O2: alfazema) eo mouse é recompensado por ter escolhido o exemplar correto (por exemplo, O1). Uma vez que o assunto atinge o critério nesta fase, a próxima etapa (CD ou discriminação composto) começa, onde os mesmos exemplares da dimensão relevante são apresentados sobreposto ao acaso por exemplares de um segundo, mas dimensão irrelevante, introduzido como um fator de confusão ( por exemplo, L1:. luz azul vs.L2: luz amarela). Dois discriminações diferentes são possíveis nesta fase (either 'Discriminação 1' ou 'Discriminação 2'). Na próxima fase (CDRE ou discriminação composto reversão), as contingências de recompensa são invertidos, mas os exemplares ea dimensão relevante mantêm-se inalterados: o rato tem que aprender que o estímulo anteriormente correto agora é incorreta (por exemplo, odor de lavanda é agora recompensado). Na próxima fase (IDS ou mudança intra-dimensional), os novos modelos (ambos os odores e luzes) são introduzidos, mas a dimensão relevante (odor neste exemplo) permanece o mesmo (por exemplo, morango é a escolha correta). Na fase seguinte (IDR ou reversão intra-dimensional), as contingências de recompensa são invertidos. Depois de um segundo deslocamento intra-dimensional (IDS2 e a sua reversão), são introduzidos novos exemplos para testar o deslocamento extra-dimensional (EDS), em que a dimensão relevante é alterada. No 'preso-in-set' EDS, o mouse tem de se concentrar na nova dimensão (por exemplo, a textura, T1: lixa grossa vs. T2: sa finandpaper), enquanto que a dimensão relevante anteriormente (neste caso, o odor), é agora a dimensão irrelevante. No "bidimensional" EDS, a dimensão previamente irrelevante (neste caso, a luz) é agora a dimensão relevante. Na fase final (EDSRe ou extra-dimensional reversão), as contingências de recompensa são invertidos.

A fim de obter resultados fiáveis, as dimensões estímulo utilizado na tarefa deve ser igualmente bem aprendida. Como mostrado na Figura 3, visuais, tácteis e discriminações odor neste novo aparelho necessário um tempo semelhante (F _(2,64) = 0,36; p = 0,69) e semelhante número de ensaios (F _(2,64) = 0,059; p = 0,94) para atingir o critério, o que sugere que os animais são capazes de realizar discriminações simples, independentemente da dimensão apresentada.

Se um conjunto de atenção confiável tem sido desenvolvido ao longo dos fases de testes da tarefa, o performance de um rato normal, do tipo selvagem deve ser mais pobres em fase de EDS em comparação com as fases anteriores e seguintes, conforme relatado em estudos anteriores em roedores e primatas ^12,13. Em particular, um aumento do tempo robusto e ensaios necessários para alcançar os critérios devem ser encontrados na EDS em comparação com as fases IDS. Tal como ilustrado na Figura 4, na nossa experiência com o protocolo 'preso-em-set ", a análise de desempenho dos ratos revelou um efeito de discriminação para o número de ensaios (F _(8,168) = 9,23; p <0,0001) e tempo ( F _(8,168) = 8,62; p <0,0001) necessária para alcançar os critérios. De fato, os camundongos necessários mais testes e mais tempo para resolver o estágio EDS em comparação com os estágios de CD, IDS, IDS2 e EDSRe (p <0,05; Figura 4A-B). Da mesma forma, a análise de desempenho testados com o protocolo de "dois-dimensão '(Figura 5) demonstraram um efeito significativo para a discriminação do número de ensaios (F _(8,72) = 30,66; p <0,005) e tempo (F _(8,72) = 4,65; p <0,0005) para alcançar os critérios necessários. Com efeito, mostra-se que os ratinhos necessários mais ensaios (p <0,05) e mais tempo (P <0,05) para resolver o EDS comparada com CD, IDS, IDS2 e EDSRe (Figura 5A-B). Não houve diferença na capacidade de mudança deve ser observadas entre ratos testados com diferentes dimensões.

Em um ratinho normal de tipo selvagem, a primeira inversão da aprendizagem (isto é., CDRE) é mais difícil do que a discriminação inicial (isto é, CD). Em acordo, como é evidente a partir das Figuras 4 e 5, os ratos necessários mais ensaios (p <0,05; Figura 4-5A) e mais tempo (p <0,05; Figura 4-5B) para completar esta fase. Além disso, o desempenho deve melhorar a partir de reversão CDRE para IDSRe para IDS2Re, como mostramos em nosso experimento com ambos os protocolos 'preso-in-set "e" bidimensional ". Estes resulTS reforçar ainda mais a evidência da formação de um conjunto atencional através da tarefa.

Ao longo da tarefa, os ratos devem melhorar a sua velocidade de resposta mais fases consecutivas. Por conseguinte, a análise do tempo de latência para responder mostrou um efeito significativo discriminação (F _(8,200) = 42,59, p <0,0001). Em particular, tal como demonstrado pelos resultados representativos na Figura 4C a latência para picar na fase IDS2 é diminuída em comparação com as fases que, no IDS, CD e SD (p <0,0005). Além disso, o aumento da latência para respondem durante a fase de EDS em comparação com o anterior e IDS2Re IDS2 e EDSRe fases sucessivas (p <0,05). De acordo com estes resultados, a análise do tempo de latência para responder durante a tarefa "bidimensional" também mostraram um efeito significativo de discriminação (F _(7,63) = 9,98; p <0,0005). Como mostrado na Figura 5C, a latência para fazer uma escolha wcomo aumentada durante o EDS comparação com IDS2 anterior e IDS2Re e EDSRe sucessivas (p <0,05). Uma vez que o tempo de latência para responder tem sido considerado um índice de processamento de decisão ^18, estes resultados sugerem também que os ratos encontrados alguns problemas de processamento na nova regra discriminativo durante o EDS. Com base na performance comportamental de ratinhos do tipo selvagem (Figura 4-5), determinou-se que o número mínimo de tamanho da amostra (por análise do poder R) para cada grupo experimental deve ser 8.

Figura 3. discriminações simples de luz, odor e textura são equivalentes. (A) Número de ensaios e (B) o tempo necessário para atingir o critério de discriminações simples, com apenas ligeiras, odor ou textura estímulos. Os valores representam a média ± SEM durante todo Figuras 2-4. Ori dadosginally publicado em 'The ultimate intra e Task extradimensional Attentional Set-Shifting para Mice' ^19.

Figura 4. do tipo selvagem C57BL6J desempenho ratos machos no tempo 'preso-in-set' ID / ED Operon tarefa. (A) Trials, (B) (em minutos) e dias necessários para atingir o critério nas diferentes fases de o ID de tarefa / ED Operon usando um paradigma ID / ED 'preso-in-set'. (C) Tempo (em segundos) decorrido entre a abertura da porta e um divisor de resposta nariz-puxão (latência de resposta) durante as diferentes etapas da tarefa. Um total de 26 ratos foram testados; 4 ratinhos foram excluídos porque não foram cutucando de forma confiável para recuperar o reforço alimentar durante o treinamento ou não foram capazes de terminar o entire procedimento. Uma: * P <0,05 contra CD, IDS, IDS2, IDS2Re e EDSRe; B: * P <0,05 contra CD, IDS2, IDS2Re e EDSRe. A e B: #p <0,05, ## P <0,005 em relação CD, IDSRe e IDS2Re. C: * p <0,05 em relação IDS2, IDS2Re e EDSRe. Note-se que os ratinhos foram capazes de completar toda a tarefa de 5-9 dias em todas as experiências relatadas nas Figuras 3-4. Dados publicados originalmente em 'The ultimate intra e Task extradimensional Attentional Set-Shifting para Mice' ^19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Do tipo selvagem C57BL6J desempenho ratos machos no "dois-dimensão 'ID / EDTarefa Operon. (A) Trials, (B) tempo (em minutos) e dias necessários para atingir o critério nas diferentes fases da tarefa ID / ED Operon usando um paradigma de duas dimensões. (C) Tempo (em segundos) decorrido entre a abertura da porta e um divisor de resposta nariz-puxão (latência de resposta) durante as diferentes etapas da tarefa. Um total de 13 ratinhos foram testados; 3 ratos foram excluídos porque não foram cutucando de forma confiável para recuperar o reforço alimentar durante o treinamento ou não foram capazes de concluir todo o procedimento. A e B: #p <0,05 contra CD e IDS2Re, * P <0,05 contra CD, IDS, IDS2, EDSRe. C: * p <0,05 em relação IDS2, IDS2Re e EDSRe. Dados publicados originalmente em 'The ultimate intra e Task extradimensional Attentional Set-Shifting para Mice' ^19. Por favor clique aqui paraver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Linha de tempo de todo o procedimento do protocolo para testar ID tarefa / ED.

Etapa	Descrição	Notas Adicionais	Referências
Discriminação Simples (SD)
Composto Discriminação (CD)	Estímulos variam em duas dimensões perceptivas, tais como cor e forma para estímulos visuais na tarefa humana, ou entre textura e odor estímulos para roedores
Reversão aprendizagem (CDRE - IDSRe - IDS2Re - EDSRe)	Dois exemplars dentro de uma dimensão perceptiva têm suas contingências de reforçamento revertida de modo que o que antes era correto é então incorreta e vice-versa)	Na aprendizagem reversão de série, o desempenho melhora com reversões consecutivas dentro de-jogo. Assim, etapas de reversão (ie., CDRE, IDSRe, IDS2Re) não só avaliar a função de diferentes áreas corticais, mas também servem 1) para formar o conjunto atencional cognitivo contestada pela fase EDS, e 2) para impedir condicionado supersticioso não intencional aspectos do estímulo	- Lesões do córtex orbitofrontal em ratinhos (Bissonette et al., 2008) e monkyes prejudicada aprendizagem reversa (Dias et al., 1996) - FMRI durante o desempenho na aprendizagem Reversão mostraram ativação do córtex orbitofrontal (Hampshire e Owen, 2006)
Intradimensional shift (IDS - IDS2)	Novos exemplos são apresentados, mas a mesma dimensão é reforçada	IDS palcos serve como um controlo interno fundamental (ie., EDS devem ser mais difícil do que o IDS), e também contribuem para formar o conjunto cognitivo-atencional	Depleção de dopamina no PFC prejudicada formação set atencional (Robbins e Roberts, 2007). 6-OHDA lesionados macacos não mostraram a redução clássica a redução de erros a partir da primeira (IDS1) ao último (IDS5) discriminação, que deverá reflectir a aquisição de um conjunto de atenção
Mudança extradimensional (EDS)	"stuck-set-in" protocolo: anteriormente dimensão estímulo irrelevante é substituída por uma nova dimensão estímulo que imediatamente se torna relevante	falha de mudança para a nova dimensão relevante não pode ser atribuída a qualquer aprendizagem anterior sobre esta dimensão, uma vez que não tinha sido experimentado anteriormente. A falha, portanto, reflecte perseveration para a dimensão relevante anteriormente	- As lesões do hav mPFCe sido show para prejudicar a EDS em camundongos (Bissonette et al., 2008), e mokeys (Dias et al., 1996) - Pacientes com lesões frontais são prejudicados na condição de preso-in-set 'perseveração ", mas não na condição de" duas dimensões "(. Owen et al, 1993) - Dopamina no mPFC modulado desempenho EDS em ratinhos (Papaleo et ai, 2008;.. Scheggia et ai, 2014) e ratos (Tunbridge et al., 2004)
	protocolo "duas dimensões": a dimensão anteriormente irrelevante é reforçada	um aparente fracasso de mudar set atencional pode surgir quando um indivíduo é capaz de desviar a atenção de uma dimensão relevante anteriormente (quando se torna irrelevante), mas é, no entanto, incapaz de reorientar a atenção sobre a dimensão relevante recém-	- Lesão do mPFC em ratos (Birrell e Brown, 2000) prejudicada EDS turno Ativação fMRI durante o desempenho na EDS foi mostrado do ventro-lateral PFC (Hampshire e Owen, 2006) -60;

Tabela 2: Etapas do ID / ED O Peron tarefa Descrição das etapas da tarefa, incluindo referências a lesão e estudos farmacológicos abordando o papel das áreas do cérebro envolvidas nas diferentes construções testadas durante a tarefa..

Discussão

Neste estudo apresentamos um romance automatizado de duas câmaras ID ED tarefa / "Operon" para camundongos que é capaz de medir de forma confiável flexibilidade cognitiva através da aprendizagem reversão, formação de set atencional e deslocamento. Este paradigma é análogo ao WCST e ID tarefas / ED comumente usados ​​em primatas humanos e não humanos e supera as maiores limitações das versões anteriores para roedores. Este paradigma Operon pode ser usado como uma nova ferramenta eficaz para a grande droga e / ou exames genéticos relevantes para cognitivas (dis) funções em camundongos com alta relevância para a medicina translacional.

Esta tarefa automática têm as seguintes vantagens sobre tarefas / ED ID anteriormente utilizado para roedores: (1) dispõe de procedimentos de trabalho intensivo menos do que as versões manuais (por exemplo, o software regula todas as fases da tarefa, diminuindo consideravelmente as intervenções do. experimentador); (2) que elimina qualquer fonte de subjetividade na medida Parameres (por exemplo, o experimentador não é necessária para julgar se ou não o animal tenha realmente feita uma escolha de resposta); (3) que elimina qualquer possibilidade de que os ratos poderiam seguir pistas relacionadas com o reforço, a fim de dar uma resposta (ou seja, a recompensa é sempre entregue automaticamente na revista centro); (4) evita condições ambientais arbitrárias (por exemplo, o uso de labirintos e aparelhos de diferentes tamanhos / materiais, uso de estímulos sinalização preparados manualmente); (5) que permite a manipulação de três dimensões distintas com uma grande variedade de estímulos diferentes, de acordo com as tarefas humanas equivalentes utilizados na prática clínica. Aqui apresentamos dados apenas de camundongos, mas vantagens semelhantes pode ser esperado também para os ratos.

Não há passos críticos na tarefa, que são parâmetros de construção-de validade internos que podem ser usados ​​para identificar de mudança de set atencional desempenho areliable: i) pior desempenho no compar EDSed para estágios anteriores ii) uma melhoria geral do IDS para IDS2; iii) uma melhoria específica em etapas de reversão consecutivos, como a mais um animal é treinado em dentro-definidos reversões, melhor ele deve executar em subseqüente dentro-set reversões ^20; iv) melhor desempenho no EDSRe em comparação com a EDS. Esta tarefa operon ID / ED romance apresenta todas estas características, consistentes com estudos anteriores em primatas, utilizando a tarefa Cantab ID / ED e em roedores usando o manual "cavando" a versão ^12,13. Além disso, cada etapa desta tarefa automatizada foi instruído em um número equivalente de ensaios, independentemente da dimensão relevante / irrelevante usado (ie, odor, textura e luz) ^19. Isto demonstrou que todos os estímulos utilizados têm saliência semelhante e são adequados para o conjunto de formação de e / ou mudança de atenção. Nossos experimentos demonstram que a dificuldade em resolver o EDS também é destacado pelo aumento da latência de resposta. Tempo de processamentoaumenta para manter a precisão ideal durante discriminações mais difíceis ^21. Assim, considerando a latência para responder como um índice de velocidade de processamento de informação, tomada de decisão e resolução de problemas ^18, as latências mais lentos durante a EDS pode refletir uma estratégia adotada para enfrentar a dificuldade em resolver o set-shifting.

Mostrámos que a nossa novo aparelho pode ser usado eficazmente com a mais-deslocamento conjunto paradigma de atenção "clássica" empregando apenas duas dimensões ao longo do teste (isto é, os dois-dimensão) ou com um preso-em-definido paradigma, o que implica a utilização de três dimensões. Dependendo do domínio cognitivo de interesse, é possível escolher o protocolo mais apropriado. Ambos os paradigmas foram anteriormente utilizados em seres humanos, primatas e roedores ^7,12-17. No entanto, o procedimento preso-in-definido é capaz de distinguir entre diferentes componentes do set-shifting e é amminério medida selectiva de funcionamento do lobo frontal em pacientes humanos ^7,22. Além disso, um problema que pode ocorrer no paradigma de duas dimensões é a irrelevância aprendeu que poderia influenciar os resultados. Aprendido perseveration irrelevância refere-se à incapacidade de prestar atenção e aprender sobre informações que anteriormente era irrelevante ^7. Esta situação pode ocorrer na fase de EDS do paradigma de duas dimensões, como o sujeito é obrigado a deslocar a atenção para a dimensão previamente irrelevante. Neste caso, é basicamente possível discernir se um défice de EDS é devido à incapacidade para desviar a atenção uma dimensão previamente relevante e / ou a incapacidade para deslocar agora a atenção para uma dimensão previamente irrelevante. Imparidade pode, em seguida, apenas refletem a inibição ativa de responder a uma dimensão anteriormente tornada irrelevante por sua associação aleatória com feedback de reforço. Em contraste, no con preso-em-definidacondição, a incapacidade de mudar para a nova dimensão relevante não pode ser atribuída a qualquer aprendizagem anterior sobre esta dimensão, uma vez que não tinha sido experimentado anteriormente. A falha, portanto, reflecte perseveration para a dimensão relevante anteriormente. Em conclusão, mesmo que em ratos normais do tipo selvagem a 'stuck-in-set "e do" dois-dimensão "atencional paradigmas pode produzir resultados semelhantes de mudança de jogo, nós expressamente preferem o preso-in-set perseveration pelas razões discutidas acima.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plexiglas walls and aluminum floor	Custom made		(16 x 16 x 16 cm for each chamber)
Plexiglas door	Custom made
PC	Dell Inc.
MED-PC IV software	(Med Associates, St. Albans, VT, USA)	custom made	Use an operant code in order to automatically control the presentation of the stimuli and the sequence of the stages
Nose-poke hole	Med Associates, St. Albans, VT, USA)	ENV-314M
Food magazine	Med Associates, St. Albans, VT, USA)	ENV-303M
Pellet dispenser for food reinforcement	Med Associates, St. Albans, VT, USA)	ENV-203-14P
Houselight	Med Associates, St. Albans, VT, USA)	ENV-315M
Dilution olfactometer	(Med Associates, St. Albans, VT, USA)	PHM-275
Liquid odorants	(Sigma Aldrich, Dorset, UK)		(see Table 1)
Mineral oil	(Sigma Aldrich, Dorset, UK)	M5904
Air pump and vacuum	(Med Associates, St. Albans, VT, USA)	PHM-280	Vacuum is recommended for scents removal at the end of each trial
Light-emitting diodes (LED)			High-intensity, transparent gem, 3 mm
Floor textures			3x3 cm
Reinforcement pellets	TestDiet	5TUL 14mg	For mice