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Resumo

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

Resumo

Vírus da Influenza A (IAV) hemaglutininas reconhecem ácidos siálicos na superfície celular como receptores funcionais para ganhar a entrada nas células. aves aquáticas selvagens são o reservatório natural para IAV, mas IAV pode cruzar a barreira das espécies para aves, suínos, cavalos e seres humanos. vírus aviários reconhecer ácido siálico ligado a um penúltimo galactose através de uma ligação α2-3 (receptores do tipo aviário), enquanto que os vírus humanos reconhecem preferencialmente ácido siálico com uma ligação α2-6 (receptores do tipo humano). Para monitorar se os vírus aviários estão a adaptar-se aos receptores do tipo humano, podem ser usados ​​vários métodos. microarrays de glicano com diversas bibliotecas de sialosides sintéticos são cada vez mais utilizadas para avaliar a especificidade do receptor. No entanto, esta técnica não é usada para medir a avidez. Medição de avidez é tipicamente alcançada por avaliação da ligação de hemaglutinina ou de vírus diluído em série a glicanos adsorvidos ao polipropileno placas de 96 poços convencionais. Neste ensaio, os glicanos com α2-3 ou α2-6 ácidos siálicos são acoplados a biotina e adsorvido a placas de estreptavidina, ou são acoplados a poliacrilamida (PAA), que adsorver directamente para o plástico. Temos miniaturizado significativamente este ensaio, imprimindo directamente ligada sialosides-PAA e os seus homólogos não ligada-PAA em lâminas de vidro de micro-poços. Este set-up, com 48 matrizes em um único slide, permite ensaios simultâneos de 6 glicano proteínas de ligação em 8 diluições, interrogando 6 glicanos diferentes, incluindo dois controles não-sialilados. Isto é equivalente a 18x placas de 96 cavidades na placa de ensaio tradicionais. O formato de matriz de glicanos diminui o consumo de compostos e produtos biológicos e, portanto, aumenta muito a eficiência.

Introdução

aves aquáticas selvagens são o reservatório natural para IAV, mas IAV é capaz de atravessar a barreira das espécies para aves e mamíferos, incluindo os humanos. IAVS aviárias reconheçam α2-3 ácidos siálicos ligados (receptores do tipo aviário), enquanto que os vírus humanos se ligam α2-6 ácidos siálicos ligados (receptores do tipo humano). Para ser capaz de se replicar eficientemente e transmitir entre seres humanos uma IAV aviária necessita de se ligar a receptores do tipo 1 humano.

IAVS são divididas com base na serologia que caracteriza a sua antigenicidade de hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) glicoproteínas do envelope. HA se liga a ácidos siálicos, enquanto que NA é a enzima destruidora de receptor na outra extremidade do ciclo de vida viral e cliva o ácido siálico 2. Todos os vírus que infectam humanos, incluindo H1N1, H2N2 e H3N2, têm uma origem aviária 3. Durante as duas últimas décadas vários aviários para os crossovers humanos ocorreu, com o H5N1, H7N7 e H7N9, sendo o mais conhecido; However, outros subtipos de ter infectado seres humanos mais esporadicamente (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Felizmente, parece que nenhum destes vírus têm sido inteiramente capaz de se adaptar aos receptores do ácido siálico ligado a α2-6-tipo humano 5-8. Adaptação do vírus zoonóticos aviária ou de outros para acomodar a replicação e transmissão em hospedeiros humanos poderia ter um efeito devastador sobre a saúde humana. Portanto, o conhecimento prévio de como esses vírus estão evoluindo para se ligar receptores do tipo humano ajudará a vigilância mundial do vírus da gripe emergentes.

Determinação da preferência receptor foi elucidada primeiro usando eritrócitos de diferentes espécies e continua a ser um ensaio favorecida entre os pesquisadores da gripe 9-12. A demonstração de que os vírus aviários reconhecer ácido siálico α2-3 e vírus humanos α2-6 ligados ácido siálico foi originalmente baseado em um ensaio utilizando hemaglutinação de eritrócitos enzimaticamente modificados para conter cada uma das linkages 13,14. Embora a leitura é hemaglutinação, um ensaio padrão para virologistas, as estruturas de glicano subjacentes não são definidos, a única ligação terminal. Além disso, a disponibilidade limitada das sialiltransferases, utilizados para re-sialilar as células, têm limitado a utilização deste ensaio 15-18. Subsequentemente, outros métodos de determinação das preferências de ligação ao receptor foram introduzidos usando estruturas de glicanos sialilados, ligado a poli-acrilamida (PAA) ou estruturas poli-glutamato (PGA) nos ensaios baseados em placa 19,20. Diversas variações são possíveis tanto no revestimento os glicanos vírus ou a placas de microtitulação, cada um dos quais resulta em um ensaio de ELISA de tipo robusto, fiável e muito sensível 21-23. Alternativamente, glicanos ligados em biotina pode substituir PAA / PGA e podem ser conjugados com placas revestidas com estreptavidina 2,24. Embora alguns soros específicos podem ser necessários, ELISAs estão glicanos padrão e vários ligados ao PAA são prontamente commercially e não comercialmente disponível (Consórcio para Glycomics Funcionais (http://www.functionalglycomics.org)).

Tecnologias de microarray glicano surgiram como uma ferramenta valiosa para determinar a especificidade de receptor, como vários glicanos diferentes são vistos, e ligação a uma grande variedade de estruturas diferentes pode ser avaliada dentro de um único ensaio 25-29. A ligação dos IAV para estas estruturas fornece uma melhor compreensão das estruturas de glicano que IAV reconhece preferencialmente 30-33. microarrays de glicano requerem pequenas quantidades de volume de amostra para efectuar um ensaio de ligação e utiliza apenas quantidades diminutas de glicano por ponto (2 nl). No entanto, estas matrizes são normalmente utilizados apenas para avaliar a especificidade dos receptores de glicanos. Análise de vários vírus, ou proteínas de hemaglutinina, em vários intervalos de concentração pode ser proibitivo devido ao número de lâminas necessárias. Além disso, até à data, nenhum ensaio de avidez relativa foi desenvolvido usando ar glicanotécnicas de raios.

Para combinar a exigência de baixo amostra proporcionada por técnicas de microarray de glicano e a sensibilidade dos glicanos ligados em PAA em ensaios baseados em ELISA, procurou-se desenvolver uma matriz de glicanos multi-bem que iria permitir a análise de alto rendimento com resolução semelhante ou melhor, em comparação para o ensaio tradicional baseado em ELISA. Simultaneamente, queríamos minimizar a quantidade de produtos biológicos e químicos repórter consumidos. O resultado final é um ensaio de avidez miniaturizado, desenvolvido especificamente para o controlo e especificidade IAV é igualmente aplicável à avaliação de outras proteínas de ligação de glicano. Usando uma lâmina de vidro separada em 48 micro-poços por uma máscara de Teflon, 6 glicanos diferentes são vistos em 6 réplicas por poço. A plataforma de microarray ofereça as mesmas tendências na ligação ao receptor visto no formato macro ELISA com várias vantagens. Estas incluem: (I) a impressão de composto em 6 repetições, utilizando amostra mínima, contra o revestimento de várias linhas iplaca na, usando 100 ul por poço; (II) vários compostos diferentes analisados ​​simultaneamente num único poço, incluindo os controlos; (III) a uma redução maciça no volume de incubação e; (Iv) uma gama dinâmica maior utilizando uma leitura fluorescente. Uma única lâmina pode ser calculada como sendo equivalente a 18x placas de 96 poços.

Com o protocolo seguinte, qualquer laboratório capaz de fabricar e análise manchada microarrays deve ser capaz de fabricar este formato de ELISA miniaturizado.

Protocolo

NOTA: Todos os passos são realizados à temperatura ambiente a menos que indicado de outra forma.

1. Disposição Construção

  1. Glicanos Preparação e configuração da placa
    1. Prepare um estoque de tampão impressão. Em primeiro lugar fazer 500 ml de uma solução de estoque de 150 mM de fosfato de sódio dibásico. Também fazem 50 ml de uma solução de estoque de 150 mM de solução de fosfato de sódio monobásico. Num balão, utilizando uma barra de agitação magnética e um medidor de pH, lentamente titule a solução de fosfato de sódio dibásico com a solução monobásico até um pH de 8,5 seja alcançado. Adicionar Tween-20 a 0,005%.
    2. Prepare as amostras de glicano. Diluir PAA glicanos conjugados, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) e 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (Figura 1A )) são para ser diluída para 100 ug / ml em tampão de impressão. step1.1.1 monovalentes glicanos,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) e 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) para 100 uM em tampão de impressão a partir do passo 1.1.1. Finalmente, preparar as tinturas funcionalizado com amina, para usar como marcadores de grade / luzes de pouso. manchas de marcador corante são impressos em 1? M.
      NOTA: Atto488-NHS corante é usado em nossas impressões. No entanto, qualquer corante funcionalizado com amina, legível pelo scanner de slides é apropriado para esta finalidade.
    3. Transferir 10 uL de cada amostra de glicano para placas de microtitulação de 384 poços, utilizados para o robô de impressão. Armazene glicanos não utilizados em solução tampão de impressão a -20 ° C em tubos selados. Tansfer 10 uL do marcador de corante para a placa de impressão.
  2. Impressão
    NOTA: Todos steps que a preocupação de tocar ou mover os slides devem ser feitas com luvas.
    1. Coloque arrayer pins na cabeça de impressão de acordo com a configuração correta do layout. Para este layout usar um pin para imprimir todas as amostras e matrizes. Imprimir os glicanos em blocos de seis, saltando um recurso (uma característica é definida como único local de um determinado composto), de cada lado, de tal modo que os pontos de uma mesma amostra não são impressos exactamente ao lado do outro.
      NOTA: O usuário final deve decidir a configuração.
    2. Retirar as lâminas de sacos, caixas abertas, e remover quaisquer partículas de poeira ou pequenos pedaços de plástico que podem ser em suas superfícies por gás nitrogénio ultra-alta pureza em cada slide. Coloque o número desejado de slides, o lado revestido para cima, no palco arrayer.
    3. Programa do arrayer, usar os parâmetros de 27 pontos por visita para a placa de fonte, usando 3 "pré-spots" em lâminas revestidas com poli-L-lisina, para remover o excesso de líquido na ponta dos pinos de impressão
      1. Ligue MPU (Unidade de Alimentação Principal) e Unidade de Controle do Clima. O software de análise Tiling aberto no computador.
      2. Escolha um layout para a impressão. Selecione Opções → Ferramenta Pin para ser usado para imprimir a matriz 1 x 1 ferramenta de impressão - 1 único pino. Selecione a guia de destino → Matriz Ferramenta Definição → Print Pattern e adicione o pitch (ponto-a-ponto à distância), o número de linhas e colunas para acomodar as amostras a ser impresso, e o padrão de impressão das amostras (para essa matriz de 8 x 8 padrão de impressão é usado em 340 relvado mm para 7 amostras totais).
      3. Selecione Alvo → Layout de slide e programar a distância de bloco-a-bloco para permitir a impressão de cada matriz replicar para o modelo de slide de 48 poços (4 x 12). Selecione Fonte e adicione o número de captadores de origem (1 para cada amostra quando se usa um pin) (para esta cópia 7 captadores de origem será usado para acomodar 6 poços de amostra e um marcador de corante bem).
        NOTA: O diálogo fonte deve ficar verde para mostrar que o númerodas visitas de origem coincide com as amostras a serem impressas no padrão de impressão.
      4. Selecione Alvo → Adaptador de Placa e Layout de slides e ajustar o número de slides (5 slides são impressos em uma hora para esta cópia com 1 slide pré-manchas).
      5. Solte a bandeja clicando no botão T1 para ativar a bandeja e adicionar o número desejado de lâminas para a bandeja, prestando muita atenção aos locais de slide pré-spotting (azul) e lâminas "reais".
      6. Coloque lâminas de vidro lisos em todas as portas de vácuo restantes para bloquear a vácuo e clique em OK para ativar o vácuo. Verifique se todos os slides são mantidos no lugar e clique em OK para retornar a bandeja para a posição inicial.
      7. Coloque a chapa de impressão no suporte da placa e garantir a cremalheira está definido corretamente no lugar. Clique GO e permitir que o processo de impressão para continuar.
    4. Imprimir os restantes 24 pontos em repetições de 6 pontos por matriz (4 matrizes / visit Fonte).
    5. Carregar as placas de 384 poçosna impressora e começar a imprimir. Manter a humidade relativa, durante a impressão, em toda a impressão entre 55 e 65%. A impressora pára após a impressão 5 slides.
      NOTA: Enquanto o microarray neste ensaio é impresso em um 8 x 8 padrão específico, os robôs impressão microarray diferentes exigirá equipamento de programação específica para atingir o layout desejado. Cabe ao usuário final para determinar o padrão mais adequado tendo em conta as especificações dos seus equipamentos.
  3. Umidificação / Imobilização
    NOTA: Uma vez que as lâminas de terminar a impressão, eles passam por uma etapa de imobilização temporária, também chamado de umidificação. Umidificação pós-impressão ajuda a homogeneizar o anexo amostra por re-molhar as manchas e garantir bloqueio completo.
    1. Colocar as lâminas em uma câmara de humidade a 100% imediatamente após a impressão durante um período de 30 min. Construir a câmara de colocação por toalhas de papel molhado muito plana no fundo de um prato de vidro grande, colocando os diapositivosem algum tipo de rack, tal como um suporte de tubos de ensaio, de impressão voltada para cima, e selagem com filme plástico para prender a umidade.
    2. Número desliza com um / pen álcool resistentes a solventes marcação e armazenar em uma caixa de dessecação. Desidratar durante a noite.
  4. Numeração, bloqueio e armazenamento
    1. Prepara-se o tampão de bloqueio - etanolamina 50 mM em 50 mM de tampão de borato. Primeiro, dissolver o ácido bórico, em ddH2O, a uma concentração final de 50 mM num frasco contendo uma barra de agitação magnética. Agita-se a solução vigorosamente numa placa de agitação até todo o sólido se ter dissolvido. Enquanto agitação constante, adicionar a quantidade apropriada de etanolamina a partir de uma solução estoque de 16,54 H até atingir a concentração de 50 mM desejado. Adiciona-se hidróxido de sódio concentrado para ajustar para um pH final de 9,2.
    2. Mergulhar os slides impressos na solução tampão de bloqueio durante 1 h.
    3. Seguindo 1 hora, lavar as lâminas em ddH2O para remover qualquer vestígio de excesso de tampão de bloqueio.Descarte tampão de bloqueio em um recipiente adequado de lixo.
    4. Transferir as lâminas para suportes de vidro para coloração e spin seco. matrizes secas, colocando-os numa centrífuga equipada com suportes de placa oscilante, a uma velocidade de 10 xg durante 5 min.
    5. Uma vez que as lâminas são secas, elas podem ser incubadas imediatamente ou armazenado. condições de armazenamento: -20 ° C em um saco plástico selado.

2. Analisando glicano Proteínas de Ligação

  1. Preparar uma câmara umidificado em que as matrizes para ser hibridizado vai caber. Uma câmara simples consiste em um pirex, mergulhado no fundo com toalhas de papel umedecido e um rack, sobre a qual os slides vai descansar.
  2. Use lectinas biotiniladas SNA (Sambuca nigra aglutinina) e CEA (Erythrina aglutinina cristagalli) a 10 ug / ml + 2 ug / ml de estreptavidina-555 de corante, em sondagem de tampão (PBS + 0,01% Tween-20). Para HA (A / Vietnam / 1203-1204 H5N1 e A / KY / 07 H1N1, neste exemplo), o usouma concentração de partida de 20? g / ml pré-complexada, como previamente descrito 34. Resumidamente, fazer uma HA: Rato-α-Strep: mistura cabra-α-murganho Alexa647 em tampão de bloqueio (PBS + BSA a 3% + 0,01% de Tween-20), numa proporção de 4: molar de 1: 2.
    NOTA: O array é sondado com lectinas para verificar que glicanos são imobilizados e detectável (Figura 1B).
  3. Transferir a solução de proteína-anticorpo de ligação de glicano mistura de 20 ul de uma placa de 384 poços e incubar em gelo durante 30 min. Seriadamente diluídas amostras de lectina e HA 1: 1, na sua tampão apropriado, 8 vezes, por mistura de 10 ul de amostra com 10 ul de tampão.
  4. Pipeta 8 ul da amostra para a superfície de micro-poços e incubar na câmara de humidificação selada (100% de HR) durante 90 min.
  5. Lavam-se as lâminas de um de cada vez, mantendo as bordas e mergulhando-os quatro vezes em uma mistura de PBS e Tween a 0,05%, em seguida, quatro vezes em PBS, e, finalmente, quatro vezes em H 2 O. desionizada utilizaçãoo mesmo protocolo de secagem descrito no passo de bloqueio, as matrizes girar secar numa centrífuga durante 5 min a 10 x g.

3. Análises de digitalização e de dados

NOTA: Os microarrays de glicano podem ser digitalizados em configurações diferentes, dependendo do fabricante do scanner microarray. Ao variar a potência do laser e da resolução, o instrumento pode produzir uma imagem com tantos sinais quanto possível dentro de sua faixa dinâmica (Figura 1C).

  1. Use um scanner de slides fluorescente e digitalizar as matrizes imediatamente após a incubação com as proteínas de ligação de glicano. Tome cuidado para garantir a lâmina está correctamente inserida no instrumento de varredura.
    1. software de digitalização aberta. Clique em Iniciar para abrir o programa. Conectar-se a scanner: Scanner → Connect ou botão verde no menu do painel de navegação Scanner.
    2. porta autoloader aberta do scanner. Colocar as lâminas em ranhuras no carregador automático, a fim específico. Feche a porta carregador automático. Click "ler loader" no painel Ferramentas de navegação para detectar automaticamente os slides no scanner.
    3. Ajuste o parâmetro de verificação: parâmetros Scanner → digitalização apropriadas para o experimento (por exemplo, 635 potência do laser de alta, o ganho de detecção de 50%). Digitalizar slides: Scanner → digitalização. Selecione caminho, criando uma pasta para guardar as imagens de varredura e nome scans individuais. Faça isso antes da digitalização real. Repita para cada slide individual. Clique em OK para iniciar a digitalização.
  2. Use o software do scanner para configurar o instrumento e digitalizar os slides. Definir scanner para digitalizar de forma iterativa em baixa potência laser (5 mW) com o aumento ajustes de ganho de 25%, 50% e 75%.
    NOTA: As configurações podem ser testadas e otimizadas, mas tenha em mente que cada varredura pode eventualmente diminuir a saída de fluorescência dos corantes devido à fotodegradação.
    1. aquisição de dados aberto e software de análise, tais como software Mapix. Clique em Iniciar para abrir o programa. Abrir varredura imagem: Arquivo → im abertoidade. Abrir arquivo GAL: Analisar → grade aberta e selecione o arquivo GAL apropriado.
    2. Entre no modo de blocos: Modo de imagem → blocos para mover o grid. Use os marcadores de grade para definir a rede para o local apropriado no slide. Ajustar os blocos individuais conforme necessário para coincidir com a matriz impressa.
    3. Entre no modo de pontos: Imagem → Modo de pontos para ajustar localização eo tamanho de pontos individuais dentro do bloco. Uma vez que todos os blocos e os pontos são ajustados e no lugar, intensidades de sinal medida pelo Analisar cálculos fotométricos →. Salve o arquivo de saída.
  3. Uma vez que os slides a digitalização é concluída, as imagens são analisadas para sinais de ligação com o programa de processamento de imagem instalado (Figura 1D - G). Para análise de imagem, carregar um arquivo GAL (Lista Array) sobre a imagem TIFF digitalizada.
    NOTA: O arquivo GAL contém o padrão de layout de local e as identidades de cada local local. arquivos GAL para matrizes são created pelo software da impressora usando um arquivo de texto delimitado por guia que contém a identidade das amostras e sua localização na placa de fonte de 384 poços.
  4. Use a grade luzes marcador / desembarque impressas nas microarrays para colocar adequadamente a grade GAL. pontos individuais podem precisar de ser movido de forma individual, mas uma matriz bem impresso será geralmente permitir que os blocos dentro da grade para ser colocado com facilidade. Após a colocação do grid, recolher intensidades local pelo software e salva como um arquivo de texto delimitado por tabulação (.txt).
    1. Usando programa de planilha, abra o arquivo a partir do scanner de saída. Abra o arquivo de macro apropriado a partir da localização da pasta. Clique em Exibir → Macro → RunMacro.
      NOTA: A pré-escrito irá copiar os dados de saída matérias, remover linhas e colunas desnecessárias, classificar os dados por amostra, calcular os valores médios média de fundo menos sinal e traçar os valores resultantes para uma planilha do spread-folha que contém os gráficos para cada dos seis SAMPles testado na matriz.

Resultados

Impressão, digitalização e análise de dados

Para garantir a impressão correta, é vital ter o alinhamento correto da grade manchado dentro da máscara de teflon, que delineia cada matriz no slide. Durante a impressão, devido à natureza do revestimento de Teflon, as manchas não podem ser vistos a olho nu nas lâminas MPX. Dá-se atenção, em seguida, para o aparecimento dos pré-manchas sobre as lâminas de poli-L-lisi...

Discussão

Avaliando especificidade de receptor IAV é um passo importante na análise do potencial pandemia de vírus aviários. reconhecimento de ácido siálico por o vírus está ligada a várias propriedades biológicas, tais como ligação e libertação a partir da célula. O conhecimento de que mutações de aminoácidos são necessários para vírus aviários para alcançar α2-6 vinculativo e cruzar a barreira das espécies permite preparação para uma pandemia. Vários ensaios são utilizados para determinar a especifi...

Divulgações

The authors have nothing to disclose

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte pela facilidade Scripps Microarray Core, e um contrato a partir dos Centros de Controle de Doenças (JCP). RPdV é um beneficiário de uma doação Rubicon e VENI da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO). O Consórcio para Glycomics Funcionais (http://www.functionalglycomics.org/) financiado pela concessão NIGMS GM62116 (JCP) forneceu vários glicanos utilizados neste estudo. Esta é a publicação 29113 do The Scripps Research Institute.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
NEXTERION® Slide H MPX-48 Schott1091525Microwell slides
ProScanArray Plus PerkinElmerdiscontinuedconfocal microarray scanner
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix SoftwareInnopsys-confocal microarray scanner
MicroGrid II Digilab-microaray printer
SNAVector LabsB-1305 Plant Lectin
ECAVector LabsB-1145 Plant Lectin
Anti-Strep AntibodyIBA2-1509-001 Anitbody for HA binding
Anti-Mouse Alexa-647LifeA-21235Anitbody for HA binding
Tween-20SigmaP2287 detergent
di-basic Sodium PhosphateSigma255793printing buffer component
mono-basic Sodium phosphateSigma229903 printing buffer component
poly-l-lysine solutionSigmaP8920 pre-spotting slide component
sodium hydroxideSigma221465pre-spotting slide component
ethanolSigma493546pre-spotting slide component
phosphate buffered salineCorning46-013-CMincubation/washing buffer
SMP4B pinsTelechemSMP4Bprinting pin
Compressed Nitrogen (Grade5)PraxairUN1066general dusting/drying tool
Boric AcidSigmaB6768-500GSlide blocking reagent
ethanolamineSigmaE9508-500MLSlide blocking reagent
Atto 488AttoTecAD 488-91Gridmarker on array
PAA-LNLNConsortium for Functional GlycomicsPA368Spotted glycans
PAA-3SLNLNConsortium for Functional GlycomicsPA362Spotted glycans
PAA-6SLNLNConsortium for Functional GlycomicsPA343Spotted glycans
LNLNConsortium for Functional GlycomicsTe98Spotted glycans
3SLNLNConsortium for Functional GlycomicsTe175Spotted glycans
6SLNLNConsortium for Functional GlycomicsTe176Spotted glycans
384-well microtiter plateMatrix TechCorp4361Printing plate
VWR lab markerVWR52877-150Slide Numbering
Wheaton slide staining dishSigmaZ103969-1EABlocking and Drying

Referências

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