LC-MS Análise de plaquetas humanas como uma plataforma para estudar mitocondrial Metabolism

Resumo

Aqui mostramos plaquetas humanas isoladas podem ser usadas como uma acessível ex vivo modelo para estudar adaptações metabólicas em resposta ao inibidor do complexo I rotenona. Esta abordagem emprega rastreio isotópica e quantificação relativa por espectrometria de massa de cromatografia de líquido e pode ser aplicado a uma variedade de modelos de estudo.

Resumo

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Introdução

Metabolismo mitocondrial disfuncional tem sido implicada numa ampla variedade de doenças, incluindo a neurodegeneração, cancro, doenças cardiovasculares e ^30. Como tal, um grande esforço foi colocado sobre a caracterização de defeitos metabólicos que contribuem para a patogénese da doença. Espectrometria de massa de cromatografia líquida-tandem (LC-MS / MS) é considerada o padrão-ouro para a quantificação de analitos a partir de matrizes biológicas complexas e muitas vezes é empregada para estudos metabólicos ^8. No entanto, como é frequentemente o caso com estudos biomédicos, atingindo um modelo acessível e bem definida relevantes para doenças humanas é um desafio.

Muitos estudos empregam transformado modelos celulares para sondar o impacto de xenobióticos ou anormalidades genéticas no metabolismo celular ^7,9. A reprogramação metabólica que ocorre em células cancerosas podem introduzir factores de confusão ²¹ e, portanto, não são ideais. Estas questões podem ser circumvented com modelos de células primárias, embora a obtenção de biomassa suficiente para análises metabólicas pode ser um desafio. Além disso, o impacto de elevadas quantidades de antibióticos utilizados na cultura tem sido destacado como estudos mitocondriais potencialmente de confusão ^16.

Plaquetas humanas dar a oportunidade de utilizar um modelo de célula primária com conteúdo mitocondrial suficiente para estudos metabólicos ^5,22,27,32. Em primeiro lugar, as plaquetas podem ser facilmente adquiridos, através de exames de sangue de doadores individuais, ou em grandes volumes de bancos de sangue e, portanto, fornecer um modelo em que fatores externos podem ser facilmente controlado. Em segundo lugar, devido ao seu pequeno tamanho, as plaquetas podem ser facilmente isolados a partir de outros componentes do sangue com o trabalho preparatório mínima em laboratórios mesmo minimamente equipados ^5. Digno de nota, as plaquetas não contêm núcleo e pode, portanto, ser usadas para estudar alterações ao metabolismo independentemente da regulação da transcrição. Aqui nós mostramos queAlém de quantificação relativa de tioésteres de acil-coenzima A (CoA), o sistema de plaquetas isoladas podem ser usadas para analisar o metabolismo de carbono. Especificamente, nós relatamos o uso de marcação metabólica com isótopo estável (não radioativo) marcado ^[13 C _6] -glucose e ^[13 C _16] -palmitato para sondar incorporação da ^[13 C] -label para o importante acetil metabólito CoA através da glicólise ou da oxidação de ácidos gordos. Isto proporciona uma plataforma poderosa, generalizável, e versátil devido ao amplo envolvimento de espécies acil-CoA em vias bioquímicas ^13,24 ea rastreabilidade deste sistema para testar outras variáveis, tais como a inibição do complexo I com rotenona ^3,33. Além das informações fornecidas no protocolo a seguir, uma extensa descrição dos métodos utilizados para a rotulagem isótopo e para as análises baseadas em LC-MS pode ser encontrado em Basu e Blair ^4.

Protocolo

Declaração de Ética: Todos os protocolos relativos ao tratamento de amostras humanas seguir as orientações do comitê de ética em pesquisa humana da Universidade da Pensilvânia.

1. Preparação de tampões e soluções de reserva 100X

1. Prepare 1 litro de solução tampão de Tyrode de base. Combinar 8,123 g de NaCl, 1,428 g _{de NaHCO3,} 0,466 g de CaCl ₂ ∙ 2 H ₂ O, 0,224 g de KCl, e 0,095 g de MgCl _2. Ajustar o volume total a 1 L com ddH ₂ O. Filtro de esterilizar tampão de base de Tyrode.
2. Preparar soluções de concentrado 100X de glicose e de ácido palmítico. Para 100x soluções de glicose, dissolver 100 mg de glicose ou ^[13 C _6] -glucose em 1 ml de DDH ₂ O. Para soluções de palmitato de 100x, dissolve-se 2,56 mg de ácido palmítico ou 2,72 mg de ^[13 C _16] ácido -palmitic em 1 ml de etanol. Filtro de esterilizar 100x soluções estoque.
3. Prepare Buffers é apropriado Enriched Tyrode
   1. Para estudos não-marcação, adicionar 1 ml de 100x solução de glucose e 1 ml de 100x solução de ácido palmítico a 98 ml de tampão de base de Tyrode.
   2. Para os estudos de rotulagem de glicose, adicionar 1 ml de 100x _[6 ¹³ C] -glucose solução estoque e 1 ml de 100x solução mãe de ácido palmítico a 98 ml de tampão de Tyrode de base.
   3. Para os estudos de rotulagem ácido palmítico, adicionar 1 ml de solução de 100x da glucose e 1 ml de ^[13 C _16] da solução de ácido -palmitic a 98 ml de tampão de Tyrode de base.
4. Prepare Soluções para Rotenone Tratamento
   1. Prepara-se uma solução de estoque 10 mM de rotenona em sulfóxido de dimetilo (DMSO).
   2. Para os estudos de dose-resposta não-marcação, passe para 1.4.3. Para os estudos de rotulagem em uma única dose, prossiga para 1.4.5.
   3. Efectuar uma diluição em série do stock de rotenona 10 mM em DMSO, para obter soluções com concentrações que variam de rotenona 1 nM a 100 uM. Estes são 100x estoques.
   4. Adicionar 50 ul de cada unidade de 5 ml de tampão de Tyrode base de glucose + ácido palmítico + a partir de 1.3.1 para preparar soluções com concentrações que variam de rotenona de 10 pM a 1 uM. Alternativamente, adicionar 50 ul de DMSO para servir como um controlo do veículo. Avance para o 2.1.
   5. Dilui-se a solução de stock 10 mM de 1000 vezes em DMSO para se obter uma solução de trabalho a 10 uM.
   6. Adicionar 50 ul deste estoque a 5 ml cada de tampão a base de Tyrode + ^[13 C _6] -glucose + ácido palmítico a partir de 1.3.2 e base de tampão de Tyrode + glucose + ^[13 C _16] ácido -palmitic de 1.3.3. A concentração final é de 100 nM de rotenona. Alternativamente, adicionar 50 ul de DMSO para cada um dos tampões para servir como controlos de veículo.

2. plaquetas Isolamento

Nota: Este método é passível de plaquetas derivadas quer de sangue total ou a partir de sacos de plaquetas. Os dados de exemplo contidas neste documento foi preparadousando plaquetas derivadas a partir de sacos de plaquetas. Por favor, veja Basu et al. ⁵ para obter mais detalhes sobre usando plaquetas isoladas de sangue total.

1. Isolamento de plaquetas a partir de sangue inteiro
   NOTA: Se isolar plaquetas de um saco de plaquetas, prossiga para 2.2.1.
   1. Centrifugar o sangue total a 175 x g durante 15 min sem freios.
   2. Transferir 1 ml do plasma rico em plaquetas superior (PRP) camada para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   3. Centrifuga-se o PRP a 400 x g durante 5 min.
   4. Aspirar o sobrenadante e prossiga para a etapa 3.1 ou 3.2.
2. Isolamento de plaquetas a partir de um saco de plaquetas
   1. Transferir 1 ml da suspensão de plaquetas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   2. Centrifugar a suspensão a 400 xg durante 5 min.
   3. Aspirar o sobrenadante e prossiga para a etapa 3.1. ou 3.2.

3. executando uma experiência

1. Para determinar o efeito de xenobióticostratamento (por exemplo, rotenona) sobre os níveis de um metabolito de interesse (por exemplo, acetil-CoA), proceder à 3.1.1. Para determinar o efeito de um xenobióticos (por exemplo., Rotenona) sobre a incorporação de um precursor metabólico para um metabolito de interesse a jusante, proceder à 3.2.1.
   1. Usando nada menos do que três repetições biológicas para cada condição, ressuspender pellet de plaquetas a partir do passo 2.1.4 ou 2.2.3 em 1 ml de cada solução do passo 1.4.4.
   2. Incubar plaquetas ressuspensas em uma incubadora de CO ₂ com camisa de água fixada a 95% de humidade, 5% de CO ₂ e 37 ° C durante 1 h. Avance para o passo 4.1
      Nota: Aqui nós descrevemos um experimento de resposta à dose. Alternativamente, uma experiência ao longo do tempo poderia ser feito, em que a dose foi fixada e a duração da incubação foi variada em vez disso.
2. Para determinar o efeito do tratamento de xenobióticos em incorporação de um precursor metabólico para um metabolito de interesse a jusante.
   1. vocêcantar nada menos que três repetições biológicas para cada condição, ressuspender pellet de plaquetas a partir do passo 2.1.4 ou 2.2.3 em 1 ml de cada formulação do tampão de Tyrode marcado a partir do passo 1.4.6.
   2. Incubar plaquetas ressuspensas em uma incubadora de CO ₂ com camisa de água fixada a 95% de humidade, 5% de CO ₂ e 37 ° C durante 1 h. Avance para o passo 4.1.

4. Têmpera e CoA Extração

1. Sedimentar plaquetas por centrifugação a 3000 xg durante 3 min.
2. Aspirar o sobrenadante.
3. Ressuspender em plaquetas de 750 ul de ácido gelado a 10% tricloroacético (w / v).
4. Adicionar padrão interno marcada com isótopo estável apropriado. Por exemplo, se o objectivo é comparar os níveis das espécies CoA entre amostras, utilizar 100 ul de uma mistura de tioésteres de CoA marcados obtidos a partir de levedura tal como descrito anteriormente com isótopo estável (técnica SILEC) ^29.
5. Pulso-sonicado de cada amostra 30 vezes com impulsos de 0,5 seg.
6. Centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
7. Apor colunas C18 de extracção em fase sólida (SPE) de tubagem de vácuo.
8. Condicionar as colunas com 1 ml de metanol.
9. Equilibrar as colunas com 1 ml DDH ₂ O.
10. Executar sobrenadante derivado de amostra (aproximadamente 850 ul neste caso) através das colunas.
11. Lavar as colunas com água 1 ml.
12. Carga de 10 ml tubos de centrífuga de vidro para o colector de vácuo para recolher fração de eluição.
13. Elui-se as colunas com 1 ml de acetato de amónio 25 mM em metanol.
14. eluato seco sob atmosfera de azoto.
15. Ressuspender resíduos secos em 50 ul de 5% (w / v) de ácido 5-sulfossalicílico e transferir para frascos de HPLC.

Setup 5. HPLC

1. Utilizando o software de controlo para o sistema de HPLC, criar um método de HPLC com as condições optimizadas para os analitos alvo e coluna utilizada, tal como listado na Tabela 1.
   Nota: A coluna temperature usado para a geração de dados foi de 25 ° C, mas os parâmetros específicos variará pelo aparelho e no que diz respeito aos compostos de interesse. Para quantificação de acil-CoA, vários métodos de análise de LC-MS foram relatados, e validado para diferentes analitos em diferentes condições de LC ^14,19,20.
2. Permitir que a HPLC para equilibrar de forma adequada.
   Nota: Isto deve incluir tanto iniciação de solventes antes de anexar uma coluna e equilibração da coluna nas condições iniciais para o método de solvente. O volume de equilíbrio deve seguir as instruções do fabricante, e de efluentes resultante deve ser desviado para o lixo.
   Nota: Consulte Basu e Blair ⁵ para obter mais detalhes sobre as configurações de HPLC.

Setup 6. Mass Spectrometer

1. Utilizando o software de controlo para o espectrómetro de massa, criar um método para uma detecção de formas ionizadas dos compostos de interesse. Os parâmetros são apresentadosna Tabela 2.
   Nota: os análogos isótopo estável destes compostos devem ser utilizados para determinar se um modo positivo ou negativo dá sensibilidade superior e para optimizar a fonte óptica e condição para a sua detecção. O tempo total de detecção do método de espectrómetro de massa deverá corresponder ao componente de tempo do método de HPLC associados.
   Observação: Como mencionado anteriormente, vários métodos de análise de acil-CoA têm sido relatados, incluindo positivos ¹⁴ e negativos de ionização ¹⁵ e modos de uso de um espectrómetro de massa de alta resolução ^17, em vez de um instrumento triplo quadrupolo ^28.
2. Limpo e calibrar o instrumento, estabelecer uma pulverização estável no espectrómetro, e permitir tempo para a solução de calibração para dissipar de forma adequada a partir da fonte e a óptica de acordo com as instruções do fabricante.
3. Configurar uma sequência para todas as amostras com o software de controle espectrômetro de massa. includes do nome ou identificadores numéricos e indicar o método de volume de injeção e instrumento adequado. Efectue um branco antes da primeira amostra, e executar outros espaços em branco e lavagens entre as amostras conforme necessário para mitigar reporte ou matriz efeitos.
   Nota: Um método de processamento para a integração de pico dos cromatogramas líquidos "analitos seleccionados muitas vezes pode ser definido dentro desta sequência ou posteriormente aplicado no processamento de dados.
4. Iniciar a sequência e monitorar o sistema espectrômetro e HPLC em massa periodicamente para problemas, incluindo flutuações de pressão ou falhas do sistema e perda de intensidade do sinal durante a corrida.
   Nota: Problemas graves ou falhas de execução persistentes podem exigir parar a corrida e purga e re-equilibrar o sistema HPLC, bem como a limpeza e calibrar o espectrômetro de massa. Consulte Basu e Blair ⁵ para obter mais detalhes sobre as configurações e dados MS processamento.

Resultados

Para demonstrar a utilidade desta metodologia reproduzimos a generalização de adaptação metabólica compensatória descrito anteriormente resultantes da exposição a rotenona. Este achado foi identificado previamente em modelos de cultura de células e esta investigação teve como objetivo testar se essa mudança metabólica também ocorre em plaquetas, que são anuclear e não propenso aos mesmos artefatos experimentais como cultura de células. Este trabalho foi realizado com pla...

Discussão

Aqui temos demonstrado a utilidade de plaquetas isoladas como uma plataforma para o estudo do metabolismo mitocondrial perturbado. Especificamente, temos caracterizado adaptação metabólica em resposta à inibição do complexo I por rotenona.

O presente estudo se estendeu resultados reportados anteriormente sobre o papel da inibição do complexo I por rotenona em linhas celulares para plaquetas humanas. Importante, este revelou que a formação de rotenona também inibida de plaquetas su...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	746398
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O)	Sigma-Aldrich	223506
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	208337
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
13C6-Glucose	Sigma-Aldrich	389374
Palmitic acid	Cayman	10006627
13C16-Palmitic Acid	Sigma-Aldrich	605573
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Trichloro Acetic Acid	Sigma-Aldrich	T6399
5-Sulfosalicylic Acid	Sigma-Aldrich	390275
Acetonitirle	Fischer Scientific	A996-4	(optima)
Water (H2O)	Fischer Scientific	W7-4	(optima)
Formic acid	Fischer Scientific	85171	(optima)
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301
Ethanol	Fischer Scientific	04-355-222
Methanol	Fischer Scientific	A454-4	(optima)
Ammonium Acetate	Fischer Scientific	A639-500
2 ml Eppendorf Tubes	BioExpress	C-3229-1
LC vials (plastic)	Waters	186002640
10 ml Glass Centrifuge Tubes	Kimble Chase	73785-10
Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns	Waters	WAT094225
Pastuer Pipets	Fischer Scientific	13-678-200
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
CO2 Water-Jacketed Incubator	Nuaire	AutoFlow NU-8500
Triple Quadropole Mass Spectrometer	Thermo Scientific	Finnigan TSQ Quantum
HPLC	Thermo Scientific	Dionex Ultimate 3000
Source	Thermo Scientific	HESI II
HPLC Column	Phenomenex	Luna C18	3 μm particle size, 200 mm x 2 mm