Um método rápido para processamento de sangue para aumentar o rendimento dos níveis plasmáticos de peptídeos no sangue humano

Resumo

O método de transformação rápida de sangue pode ser usado em seres humanos e produz níveis mais elevados de péptidos, bem como permite a avaliação da forma molecular correcto. Portanto, este método vai ser uma ferramenta valiosa na investigação peptídeo.

Resumo

A investigação no domínio da regulação da ingestão de alimentos está a ganhar importância. Isso muitas vezes inclui a medição de péptidos que regulam a ingestão de alimentos. Para a determinação correcta da concentração de um péptido, que deve ser estável durante o processamento do sangue. No entanto, este não é o caso de vários péptidos que são rapidamente degradadas por peptidases endógenas. Recentemente, foi desenvolvido um método de processamento de sangue empregando temperaturas R educed, A cidification, P rotease inibição, eu sotopic controles exógenas e D ilution (RAPID) para o uso em ratos. Aqui, nós estabelecemos esta técnica para o uso em humanos e investigados recuperação, forma molecular e circulando concentração de hormônios reguladores ingestão de alimentos. O método rápido melhorou significativamente a recuperação de ¹²⁵ a somatostatina-28 (+ 39%) marcado com I, glucagon-like peptide-1 (+ 35%), grelina acilo e glucagon (+ 32%), a insulina e kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), a leptina(+ 21%) e péptido YY _3-36 (+ 19%) em comparação com o processamento padrão (sangue com EDTA em gelo, p <0,001). cromatografia líquida de alta eficiência mostrou a eluição de grelina acil endógena na posição esperada após o processamento rápido, ao passo que após o processamento padrão de 62% da grelina acil foram degradados, resultando em um pico mais cedo provavelmente representando desacil grelina. Após o processamento RAPID a razão grelina acil / desacil no sangue de indivíduos com peso normal foi de 1: 3 em comparação com 01:23 seguimento de um tratamento padrão (p = 0,03). Também os níveis endógenos kisspeptin foram superiores após RAPID em comparação com o processamento padrão (+ 99%, p = 0,02). O método de transformação rápida de sangue pode ser usado em seres humanos, produz níveis mais elevados de péptidos e permite a avaliação da forma molecular correcto.

Introdução

À luz da crescente prevalência de obesidade em todo o mundo ^1,2, a pesquisa no campo da regulação da ingestão de alimentos está a ganhar importância. Embora até agora apenas um péptido é conhecido que está perifericamente produzido e actuando centralmente para estimular a ingestão de alimentos, ou seja, a grelina ^3, dentro das últimas décadas, uma ampla variedade de péptidos foi identificado e reduzir a ingestão de alimentos, por exemplo. leptina, péptido YY (PYY) e também glucagon-like peptide-1 (GLP-1) e insulina ^4, portanto, em estudos investigando os mecanismos de regulação dos níveis de fome e de péptidos saciedade são frequentemente avaliada e, ao mesmo tempo, é assumido que o péptido estudado seja estável e recuperados em rendimentos elevados durante a formação do plasma. No entanto, muitas vezes não é este o caso, devido à rápida desagregação endógena como mostrado anteriormente por ex. grelina que é degradada a partir de acilo para desacil grelina ^5. Por isso, recentemente descreveu o método rápido para proces sanguecantar em ratos empregando temperaturas R educed, A cidification, P rotease inibição, eu sotopic controles exógenas e D ilution ^6. Este método melhorou a recuperação para 11 dos 12 péptidos testados e permitidos para a determinação da forma molecular circulando correcta em relação ao padrão de processamento de sangue (sangue com EDTA em gelo) ^6. Este método tem sido utilizado em vários estudos subsequentes ^7-12 para a detecção de grelina de circulação, bem como o factor de libertação da corticotropina ^13. Por isso, o método tem-se revelado útil para a pesquisa de péptidos em roedores. No entanto, uma vez que estudos com roedores não são sempre traduzível a outra espécie animal, o método deve ser estabelecida para o uso no sangue humano bem.

O objetivo do presente estudo foi testar o método rápido para processamento de sangue em seres humanos em comparação com o processamento de sangue padrão, o sangue EDTA em gelo, que é amplamente recomendada ¹⁴ e frequentemente used no, bem como ambiente de pesquisa clínica. Testamos a recuperação de uma selecção de ¹²⁵ péptidos I-rotulados envolvidas na regulação da ingestão de alimentos, incluindo péptidos estabelecidos, bem como novos candidatos recentemente sugerido para desempenhar um papel na alimentação de regulação (efeitos sobre o consumo de alimentos são mostrados na Tabela 1) após tratamento com ambos os métodos. As hormonas também foram escolhidos para representar péptidos de comprimento e carga (Tabela 2) diferente. Além disso, para a grelina foi investigada a forma (s) molecular seguindo o método padrão e RAPID. Por fim, avaliamos grelina endógena (acil e grelina desacil), bem como os níveis de kisspeptin, um peptídeo também sugeriu recentemente a desempenhar um papel na regulação da ingestão de alimentos ^15,16 seguinte processamento rápido ou padrão. Além disso, também foi investigado estes níveis de péptido numa população de indivíduos com uma vasta gama de índice de massa corporal (variando 10,2-67,6 kg / m ²⁾ para estudar podiferenças le relacionados ao peso corporal cronicamente alterado.

Diagnóstico, Avaliação e plano:
Os participantes do estudo
Todos os participantes do estudo foram pacientes recentemente hospitalizados (inclusão estava dentro de dois dias de admissão ao hospital) da Divisão de Medicina Psicossomática na Charité-Universitätsmedizin Berlim e deu consentimento informado por escrito. Para evitar qualquer impacto do gênero só foram incluídos pacientes do sexo feminino. Um total de 42 sujeitos participaram neste estudo e foram divididos em três grupos: peso normal (IMC 18,5-25 kg / m ^2, n = 12), anorexia nervosa (IMC <17,5 kg / m ^2, n = 15) e obesidade (IMC> 30 kg / m ^2, n = 15). Anoréxica e pacientes obesos eramdiagnosticados de acordo com a Classificação Internacional de Doenças-10 e hospitalizado por ganho de peso (anorexia nervosa) ou redução do peso (obesidade), respectivamente. Todos os pacientes com peso normal foram hospitalizados exclusivamente devido a sintomas somatoformes sem perturbações somáticas relevantes. Foram excluídos pacientes com sintomas somatoformes gastrointestinais ou história de cirurgia gastrointestinal. Os critérios de exclusão também engloba uma idade <18 anos, gravidez atual e doenças psicóticas não tratados. A colheita de sangue foi efectuada no dia 2 ou 3 após a admissão hospitalar antes de receber o tratamento dietético, a fim de aumentar ou reduzir o peso corporal, respectivamente. parâmetros antropométricos foram avaliados no mesmo dia.

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo comitê de ética local para a investigação humana (número de protocolo EA1 / 114/10).

Processamento 1. Sangue

1. Coletar sangue venoso 07:00-8h00 após jejum nocturno de uma veia do antebraço e do processo de acordo com o procedimento padrão ou o método RAPID. Instrua os assuntos a não exercer ou fumar antes da retirada de sangue.
2. Para o processamento padrão, recolher o sangue em tubos contendo EDTA e centrífuga refrigerada dentro de 10 min a 3000 xg durante 10 min a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante e guardar a -80 ° C até processamento adicional por meio de radioimunoensaio.
3. Para o processamento rápido, dilui-se imediatamente o sangue (dentro de 1 minuto após a retirada do sangue) a 1:10 em tampão arrefecido com gelo (pH 3,6) contendo acetato de amónio 0,1 M, NaCl 0,5 M e inibidores de enzimas (diprotina A, E-64-d, antipaína , leupeptina, quimostatina, 1 ug / ml). Em seguida, centrifugação dentro de 10 min a 3000 xg durante 10 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante nósing uma pipeta em tubos de polipropileno como descrito antes em ratos ^6.
   1. cartuchos de cromatografia de carga (360 mg, 55-105 um) com 100% de acetonitrilo (taxa de 10 ml / min), equilibrar-se com 0,1% de trifluoroacetato (TFA, taxa de 10 mL / min) e o sobrenadante com carga, a uma taxa constante de 1 ml / min utilizando uma bomba de seringa.
   2. Em seguida, lavar com cartuchos de 3 mL de TFA 0,1% (taxa de 10 ml / min) e, lentamente, eluir com 2 ml de acetonitrilo a 70% contendo 0,1% de TFA (2 ml / min).
   3. As amostras eluidas utilizando a centrifugação a seco a vácuo e armazenar a -80 ° C até processamento adicional por meio de radioimunoensaio.
      NOTA: Realizar todas as etapas em polipropileno (processamento RAPID) e borosilicato (radioimunoensaio) tubos que apresentam significativamente menor propriedades de ligação de superfície e, assim, minimizar a perda de peptídeo para a maioria dos peptídeos estudados antes de ^26.

2. medições

NOTA: As etapas nesta seção devem ser realizados em um laboratóriocertificada para o trabalho com material radioativo. As precauções padrão para o trabalho com ¹²⁵ I devem ser tomadas.

1. Recuperação de péptidos radiomarcados
   1. Obter ^I-125 radiomarcadas péptidos humanos (por exemplo. Acil-grelina, o GLP-1, glucagon, insulina, kisspeptin, leptina, nesfatin-1, PYY _3-36 e somatostatina-28).
   2. Manter péptidos em forma de pó até a experiência, depois acabado de diluir em 0,1% de ácido acético (~ 100.000 cpm por ml).
   3. Para o processamento de sangue padrão, diretamente após a retirada de sangue para EDTA refrigerados contendo tubos, de transferência de 1 ml de sangue para um tubo com 50 ul de marcador radioactivo contendo 3,000-6,000 cpm (contados diretamente antes do experimento começa).
   4. Para o processamento rápido, transferência de 1 ml de sangue de EDTA contendo sangue para um tubo contendo 9 ml de tampão RAPID (para a composição ver 1.3) e 500 ul marcador radioactivo contendo 30,000-60,000 cpm. Devido ao uso 1:10 10 vezes maior volume de radiolabel para o processamento rápido.
   5. Em seguida, amostras do processo, tal como descrito nas etapas 1.2 a 1.3.2.
   6. Para os experimentos de recuperação, faça amostras não secas por centrifugação a vácuo e não armazenar a -80 ° C. Em vez disso, avaliar a recuperação dos péptidos marcados radioactivamente directamente depois utilizando um contador gama.
   7. Medir todo o sobrenadante em amostras padrão, enquanto que no RAPID analisar amostras de 1/10 do volume total para se obter a comparabilidade da quantidade de radiomarcador utilizado. Para a medição, transferir o sobrenadante em tubos de montagem para o contador gama e avaliar as contagens por minuto
   8. Como um padrão de 100%, utilizar duas amostras com 50 ul de ¹²⁵ I-péptido radiomarcado que não sofrem processamento. Medida ao mesmo tempo com outras amostras, tal como descrito em 2.1.7.
   9. Realiza a experiência de cinco a seis vezes para cada péptido.
2. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência de Radiolabeled Grelina
   1. Retirar sangue no cEDTA hilled contendo tubos e transferência de 1 ml para tubos contendo 200 ul grelina radiomarcado-acil contendo 15.000-20.000 cpm (contados diretamente antes do experimento começa).
   2. Para o processamento rápido, transferência de 1 ml de sangue para um tubo contendo 9 ml de tampão RAPID (para a composição ver 1.3) e 200 ul acil radiomarcado grelina contendo 15.000-20.000 cpm.
   3. Em seguida, amostras do processo, tal como descrito nas etapas 1.2 a 1.3.2.
   4. Para análise posterior por HPLC de fase reversa, carregar directamente numa coluna de amostras estáveis ​​ligação C18 (2,1 mm x 50 mm, 1,8 um) equilibrada em 17% de acetonitrilo em água (ambos suplementados com 0,1% de TFA).
   5. Após 5 minutos de equilíbrio, usar um gradiente de 17-40% de acetonitrilo a eluir a amostra em 40 min (taxa de 1 ml / min de fluxo).
   6. Recolher fracções de 1 ml por minuto e analisar a radioactividade utilizando um contador gama.
   7. Em uma experiência separada, a carga 200 mL acil radiomarcado grelina contendo 15.000-20.000cpm sobre a coluna directamente e realizar HPLC, como descrito nos passos 2.2.4 a 2.2.6.
3. radioimunoensaio
   1. Para radioimunoensaio, descongelar sobrenadantes congelados (Processing Standard) e aspirador de pó seco (método rápido) à temperatura ambiente.
   2. Imediatamente antes de radioimunoensaio, re-suspender as amostras RAPID secos em dobro _H2O destilada de acordo com o volume original de plasma (500 mL).
   3. Avaliar kisspeptin e total (incluindo tanto desacil e grelina de acilo), bem como a grelina acilo como descrito antes utilizando radioimunoensaios ^12,27 comerciais de acordo com os protocolos dos fabricantes. Utilize tubos de borossilicato que permitem a formação de sedimento estável.
      1. No dia um, incubar as amostras com tampão de ensaio e o anticorpo primário (por ex. Anti-grelina) na diluição fornecida pelo fabricante durante um período de 24 h.
      2. No dia dois, adicionar o marcador ^125I (por exemplo, ^{125I-grelina),} VORTEX e incubar durante um período de 24 h.
      3. No terceiro dia, adicionar o reagente de precipitação, vortex e incubar, tal como recomendado pelo fabricante. Em seguida, os tubos de centrifugação a 3000 xg durante 20 min a 4 ° C. Remove-se os sobrenadantes e contar a radioactividade nos peletes usando um contador gama
   4. Calcule desacil grelina como a diferença de um total de grelina menos acilo. Avaliar a relação de grelina acil / desacil pela divisão de acilo por desacil grelina para cada amostra individual.
   5. Processar todas as amostras - se possível - em um lote de evitar a variabilidade inter-ensaio. A variabilidade intra-ensaio no presente experimento foi <8% para kisspeptin, <7% para o total e <9% para a grelina acilo.

3. Análise Estatística

1. Determinar a distribuição dos dados, utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov. Expresso de dados como média ± erro padrão da média (SEM).
2. Avaliar as diferenças entre doisgrupos pelo teste t. Avaliar as diferenças entre vários grupos de todos os procedimentos múltiplos de pares de comparação (teste de Tukey post hoc) ou two-way ANOVA seguido pelo método de Holm-Sidak.
3. Considere p <0,05 significativo e realizar análises utilizando um programa de estatísticas.

Resultados

Processamento de sangue RAPID aumenta o rendimento de ¹²⁵ peptídeos I-radiomarcados no sangue humano em relação ao processamento de sangue padrão.
Após o processamento padrão de sangue (sangue com EDTA em gelo), a recuperação dos péptidos radiomarcados foi de ~ 60% em 9/9 péptidos (variando 48-68%, Figura 1A - K). Um rápido processamento melhorado o rendimento em todos os ¹²⁵ péptidos I-rotulados, nomeadamente na ...

Discussão

Nós relatado anteriormente que o método rápido para processamento de sangue melhorou a recuperação para 11/12 peptídeos em comparação com o processamento de sangue padrão em ratos ^6. No presente estudo demonstrámos que este método é também adequado para a utilização em seres humanos. Na sequência de um tratamento rápido, a recuperação para 9 de 9 ¹²⁵ peptídeos I-rotulados testado foi melhorado em comparação com o processamento de sangue padrão (sangue EDTA em gelo). A melhori...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diprotin A	Peptides International, Louisville, KY, USA	IDP-4132
E-64-d	Peptides International, Louisville, KY, USA	IED-4321-v
Antipain	Peptides International, Louisville, KY, USA	IAP-4062
Leupeptin	Peptides International, Louisville, KY, USA	ILP-4041
Chymostatin	Peptides International, Louisville, KY, USA	ICY-4063
Sep-Pak C18 cartridges	Waters Corporation, Milford, MA, USA	WAT051910	360 mg, 55-105 µm
Acyl-ghrelin	Millipore, Billerica, MA, USA	9088-HK	Radioactive
GLP-1	Millipore, Billerica, MA, USA	9035-HK	Radioactive
Glucagon	Millipore, Billerica, MA, USA	9030	Radioactive
Insulin	Millipore, Billerica, MA, USA	9011S	Radioactive
Leptin	Millipore, Billerica, MA, USA	9081-HK	Radioactive
Kisspeptin-10	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-048-56	Radioactive
Nesfatin-1	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-003-26	Radioactive
PYY3-36	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-059-02	Radioactive
Somatostatin-28	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	T-060-16	Radioactive
ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	822700-902	2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm
Agilent 1200 LC	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA		HPLC, several components, therefore no single catalog number
Kisspeptin  RIA	Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA	# RK-048-56	Radioactive
Total ghrelin RIA	Millipore, Billerica, MA, USA	# GHRT-89HK	Radioactive
Active ghrelin RIA	Millipore, Billerica, MA, USA	# GHRA-88HK	Radioactive
SigmaStat 3.1	Systat Software, San Jose, CA, USA	online download