Glicanos Análise Node: uma abordagem de baixo para cima para Glycomics

Resumo

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

Resumo

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides ("glycan nodes") present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

Introdução

Os glicolípidos, glicoproteínas, proteoglicanos e glicosaminoglicanos constituem as quatro classes principais de hidratos de carbono complexos, heterogéneos colectivamente conhecidas como glicanos. Como componentes omnipresentes e integral da membrana do plasma, glicocálice, e a matriz extracelular e fluidos, glicanos participar em tais processos bioquímicos diversos como a endocitose, o tráfico intracelular, motilidade celular, a transdução de sinal, reconhecimento molecular, a activação do receptor, a adesão celular, a interacção hospedeiro-patogénio , intercelular comunicação, vigilância imunológica, e iniciação resposta imune. ¹ Presente em quase todos os domínios da vida, enzimas conhecidas como glicosiltransferases que constroem polímeros glicano agir em conjunto com glicosídeo hidrolases (também conhecido como glicosidases, que quebram glicanos) para a construção, remodelação, e finalmente produzir polímeros finalizado glicano ^2. Embora cada glicosiltransferase pode operar em diferentes glicoconjugados, uma glicosiltransferasegeralmente forja uma ligação glicosídica e linkage--anómero específico através da transferência do radical monossacárido de um determinado nucleótido activado dador de açúcar (por exemplo, GDP-fucose) a uma certa categoria de aceitadores nucleofílicos (por exemplo, um lípido, polipéptido, ácido nucleico, ou o cultivo oligossacárido). Estima-se que mais de 50% de proteínas (especialmente de membrana e proteínas secretoras) são pós-tradução modificada por glicosilação ³ cálculos combinatórios rudimentares fornecer uma apreciação para a variabilidade considerável, versatilidade e especificidade reconhecida às glicoproteínas de glicosilação.; Por exemplo, se um substrato de polipéptido tem apenas 10 locais de glicosilação e de cada local pode formar uma ligação glicosídica com uma das extremidades redutoras apenas 3 de monossacárido diferentes, então, teoricamente, a glicoproteína final pode assumir 3 ¹⁰ = 59049 identidades distintas. Em glicoproteínas, ligações glicosídicas geralmente formar com a cadeia lateral de azoto óf resíduos de asparagina na sequência Asn-X-Ser / Thr (X pode ser qualquer aminoácido excepto prolina) para se obter N-glicanos e ^2-hidroxilos de cadeia lateral de resíduos de serina e treonina para se obter ó-glicanos ^4. A composição da glycome de uma célula (ou seja, o seu complemento de produtos de glicosilação) é único e limitado, porque, com poucas exceções, glicosiltransferases exibem doador estrito, receptor, e especificidade de ligação. ⁵ glicoproteínas importante e abundante no plasma sanguíneo sofre glicosilação aberrante como consequência a jusante de expressão glycosyltransferase anormal e atividade devido a muitas condições patológicas, especialmente câncer e doenças inflamatórias ^6-24.

Principalmente devido a factores epigenética, o glycome é significativamente mais diverso, dinâmico e complexo do que o proteoma e transcriptoma ^25,26. Enquanto cerca de 1% do genoma de mamífero codifica a formação, modificação, emontagem de glicanos, ²⁷ de glicosilação procede de uma forma um contraste marcante-não-modelo orientado para polipéptido e biossíntese do ácido nucleico. A interação entre a quantidade relativa e atividade de enzimas de glicosilação e tais fatores ambientais como a disponibilidade de nutrientes e precursor em última instância, determina a natureza, taxa e extensão da glicosilação. ^5,28 embriogênese (por exemplo, determinação e diferenciação), ativação celular e progressão através a expressão do gene influência do ciclo celular (isto é, transcrição e tradução) e alterar a identidade e quantidade de glicosiltransferases disponíveis, cuja actividade é o determinante a montante imediata do perfil de glicano da célula. Porque (algumas das) a proliferativa, adesivo e propriedades invasivas das células cancerosas se assemelham aos de células embrionárias normais, alterações específicas em vias biossintéticas glicano (por exemplo, a acumulação de precursor, expressão desregulada, aberranmodificação t, truncamento estrutural, ou formação de romance) servem biomarcadores de câncer como universais que indicam várias etapas da formação do tumor, progressão, migração e invasão de ²⁹ Apesar de glicosilação é altamente complexo, é evidente que só algumas alterações na glicosilação pode habilitar carcinogênese e metástase.; Aparentemente, certos "aberrantes" produtos de glicosilação, de facto beneficiar células cancerosas, permitindo-lhes escapar reconhecimento imunológico e sobreviver às demandas de migração em ambientes intravascular e metastáticos inóspitas. ^28,30,31 Não surpreendentemente, os experimentos revelaram que interromper ou prevenir padrões de alteração a expressão do gene e a formação de glicano aberrante pode interromper a tumorigénese. ²⁹ no entanto, os glicanos aberrantes detectados numa amostra biofluid (por exemplo, urina, saliva, e o plasma sanguíneo ou no soro) pode não ser indicadores directos de cancro (ou outra doença), mas sim a jusante resultados de sutil, mas significativaalterações no sistema imunitário ou ramificações quantificáveis ​​de uma condição perniciosa num órgão imprevisível. ³²

Embora eles fornecem informações universal sobre a glycome, muitas técnicas Glycomics baseada em interação molecular (por exemplo, a lectina / matrizes de anticorpos e metabólica / rotulagem covalente) dependem da detecção de estruturas de glicano inteiros e não fornecem informações estruturais detalhadas sobre glicanos individuais. Em contraste acentuado, de espectrometria de massa (MS) pode ajudar a identificar e quantificar as estruturas de glicano individuais e revelar a informação estrutural como os sítios de ligação para núcleos de polipéptido. expressão ou actividade de uma única glicosiltransferase desregulada pode iniciar uma cascata de eventos moleculares prejudiciais em múltiplas vias de glicosilação. Porque cada glicosiltransferase pode operar em mais de um substrato glicoconjugada e em diferentes polímeros glicano crescimento, cascatas biossintéticas desregulados deu disproporcionalmente aumento da quantidade de apenas um produto glicano mas várias classes heterogêneas de glicanos aberrantes em fluidos intra ou extracelulares. ³³ No entanto, tais glicanos aberrantes originais são por vezes considerada impraticável como biomarcadores para o câncer ou outras patologias glicano-afetiva, porque, em comparação com o grande piscina de glicanos bem regulamentado, estes glicanos aberrantes representam uma fração muito pequena que pode muitas vezes permanecem indetectáveis ​​mesmo por técnicas tais altamente sensíveis como espectrometria de massa. Por exemplo, em fluidos corporais intra- e extracelulares, o amplo espectro de proteína de concentração (que abrange as oito ordens de grandeza) pode impedir a detecção de glicoproteínas escassos que são mascarados por as espécies mais abundantes. ³² Além disso, a determinação da actividade de glicosiltransferase continua a ser uma prática considerável e desafio teórico, porque muitas glicosiltransferases estão ausentes em fluidos biológicos clínicos ou se tornam inativos ex vivo. Apesar da dificuldade de consistenTLY detectar e quantificar quantidades ultra-pequenas de glicanos todo único, os praticantes de espectrometria de massa têm feito enormes progressos em direção a empregar glicanos intactas como marcadores clínicos. Desenvolvemos recentemente uma abordagem complementar à análise de glicanos intactos que, empregando GC-MS, facilita a detecção de todas as filiais-ponto constituinte e monossacarídeos específicos de ligação ( "nós glicano") que em conjunto conferem especificidade para cada glicano e em muitos casos servem directamente substitutos como moleculares que quantificam a atividade relativa do glycosyltransferase culpado (s).

Desde a sua primeira aplicação directa relatado para análise de glicano, em 1958, a cromatografia gasosa (GC) provou ser uma técnica poderosa para analisar per-metilada mono- e dissacáridos, ³⁴ determinar a sua anomericity e a configuração absoluta, e separá-los por análise de espectrometria de massa subsequente. ³⁵ entre 1984 e 2007, Ciucanu e colegasintroduzida e refinado uma técnica permetilação glicano à fase sólida que empregue o hidróxido de sódio e de iodometano, seguido por extracção líquido / líquido de glicanos permetilado utilizando água e clorofórmio. ^35,36 Entre 2005 e 2008, Kang e co-trabalhadores integrado um spin-horário abordagem -column na etapa permetilação. ^37,38 Em 2008, o grupo de pesquisa Goetz concebeu uma fase sólida quantitativa permetilação método glicano-profiling usando laser assistida por matriz dessorção de ionização (MALDI) espectrometria de massa para comparar e, eventualmente, caracterizar invasiva e não cancro da mama células -invasive; ³⁹ em seguida, em 2009, a equipe Goetz combinada enzimática e técnicas de liberação químicos para clivar o glicanos de glicoproteínas intactas em um esquema de permetilação em fase sólida altamente alcalina ⁴⁰ Embora o procedimento Goetz facilitado permetilação simultânea e liberação química. de glicanos S, foi aplicada apenas a glico pré-isoladoproteínas. Nós modificamos essa técnica em 2013 e adaptou-o para fluidos biológicos não fraccionadas inteiros e amostras de tecidos homogeneizados através da incorporação de ácido trifluoroacético (TFA) a hidrólise, redução e acetilação etapas. ³³ Estes passos adicionais também liberam glicanos de glycolipids e N -ligada glicanos de glicoproteínas e convertê -los em acetatos parcialmente metilados alditol (PMAAs, Figura 1), cujos padrões de metilação-e-acetilação distintivo facilitar a análise por GC-MS e exclusivamente caracterizar os nós de glicano constituintes no polímero glicano intacta inicial ⁴¹ (Figura 2). ³³ por fim, esta procedimento produz um retrato compósito de todos os glicanos de uma biofluid complexo baseado em quantificação directa, relativa de glicano características únicas, tais como "fucosilação núcleo", "6-sialilação", "GlcNAc bissector", e "beta 1-6 ramificação" - cada um derivado a partir de um único chromatograp CG-eMpico hic. Este artigo apresenta uma maior optimização do permetilação, acetilação, isolamento, e fases de limpeza, juntamente com a melhoria do modo de quantificação relativa.

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Protocolo

Atenção: Evite contato com a pele / olho com qualquer um dos reagentes utilizados neste experimento. Após a exposição, lave bem a área afetada com água e procurar assistência médica imediata.

1. permetilação e Glycan Extração

1. Preparação coluna
   1. Obter um número de unidades de coluna de microcentrífuga de centrifugação das amostras a ser analisadas. Quebrar e retirar as tampas de tubos de reservatório de plástico. Colocar um filtro de microcentrífuga de mini em cada tubo de reservatório. Colocar as colunas de centrifugação de microcentrífuga montados (contendo o mini-filtros) num suporte de tubos de microcentrífuga.
   2. Obter um stock de hidróxido de sódio (NaOH) esferas (20-40 mesh). Transferir parte NaOH para um pequeno barco de pesagem ou, se a umidade está causando aglomeração, um almofariz de porcelana quente como o estoque de trabalho de NaOH. Evitar o uso de aglomerados de grânulos de NaOH / NaOH ou esmagadas em pó.
      Cuidado: NaOH é uma toxina potente e base corrosivo. Lavar a pele exposta / olhos com água durante 15 min. Thoroughly limpar a bancada de trabalho após a conclusão do experimento.
   3. Usando uma colher pequena ou espátula, transferir contas de NaOH a partir do estoque trabalhando para preencher as microcentr�ugos mini-filtros com NaOH até o primeiro bisel exterior (~ 5 mm abaixo da borda). Toque os filtros de microcentrífuga cheias na bancada para embalar / condensar as contas de NaOH.
      Nota: Durante esta experiência, para minimizar a adsorção de água em excesso por grânulos de NaOH higroscópicos, manter o nível de todos os líquidos adicionados (por exemplo, acetonitrilo, sulfóxido de dimetilo, a solução de analito) acima da superfície do empacotamento de coluna de NaOH e limitar o contacto directo com o ar.
   4. Obter um estoque de acetonitrilo (ACN). Transferência de ~ 350 mL ACN para cada mini-filtro microcentrífuga NaOH-embalados. Mantenha o NaOH submerso em ACN e remover grandes bolhas de ar por agitação com um gel de carregamento de ponta da pipeta ponta revirada.
      Cuidado: Acetonitrilo é um irritante inflamável.
   5. A centrifugação coluna
      1. Organizar as colunas de microcentrífuga simetricamente dentro de uma centrífuga; utilizar um tubo de equilíbrio se necessário. Evite derramar grânulos de NaOH dentro da centrífuga. Fechar a tampa do centrifugador.
      2. Centrífuga as colunas (contendo NaOH e ACN) para ~ 15 segundos a 2.400 × g.
      3. Após a conclusão da centrifugação, remover colunas de microcentrífuga da centrífuga, e descartar a ACN em um recipiente de resíduos perigosos. Manter a coluna de NaOH a embalagem intacta.
   6. Adicionar ~ 350 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada mini-filtro de microcentrífuga NaOH-embalado. Mantenha o NaOH submerso em DMSO e remover quaisquer bolhas de ar grandes, com uma ponta de pipeta. Como descrito anteriormente, as colunas de centrifugação para ~ 15 segundos a 2400 x g, e o descarte de DMSO, mantendo a NaOH a embalagem intacta.
      Cuidado: DMSO é um mutagéneo e de irritabilidade e é facilmente absorvida através da pele.
   7. Ligue todos os mini filtros de microcentrífuga com as fichas incluídas no filtro de spinkit. Transferir ~ 350 ul de DMSO para cada mini filtro de microcentrífuga de NaOH embalado e utilizar uma ponta de pipeta de 200 uL para remover as bolhas de ar na embalagem de NaOH de modo que o DMSO atinge todas as regiões dentro da embalagem, em seguida, NaOH. Evitar o esmagamento ou excessivamente raspando as contas NaOH; De NaOH em pó é indesejável. Terminar este passo tão rapidamente quanto possível.
2. Preparação de Plasma de Controlo de Qualidade (QC) amostra (s)
   Nota: Para garantir resultados consistentes em lotes experimentais, considerar o uso de pelo menos uma alíquota de uma amostra retirada de uma coleção em massa grande e homogênea do material biológico de interesse para ser analisado em cada lote. Por exemplo, se a análise do plasma sanguíneo, usar alíquota (s) de um conjunto de grandes quantidades de plasma sanguíneo do que a amostra (s) de CQ em cada lote. Processo de amostras QC na mesma maneira que as amostras desconhecidas.
   1. Centrífuga uma amostra de estoque de plasma QC durante 4 min a ~ 10.000 × g. Durante a centrifugação, alguns precipitado de alta densidade pode resolver a the inferior e algum precipitado de baixa densidade pode flutuar para o topo do plasma. Evitar tanto ao retirar alíquota (s) de plasma.
   2. Passe para "1.3) Preparação de Amostras" abaixo. Em seguida, retornar a esta etapa após a centrifugação de plasma está completa.
   3. Retirar 9 ul de plasma QC centrifugado e transferir para um tubo de ensaio de 1,5 ml de polipropileno devidamente rotulados equipado com uma cápsula snap-fechada (doravante referida como "de 1,5 ml tubo de ensaio de plástico"). Adicionar 1 ml de água deionizada para cada alíquota; Se desejado, usar isto como um portador para o padrão interno (s).
   4. Adicionar 270 mL de DMSO a este controle plasma. Vortex para assegurar a dissolução completa.
3. Preparação de amostra
   1. Obter tantos tubos de ensaio de plástico de 1,5 ml, como o número de amostras biológicas (analito).
   2. Transferência de 9 ul de cada (analito) para a sua amostra biológica 1,5 ml tubo de ensaio de plástico correspondente. Transferir 1 ml de água desionizada e 270 uL de DMSO a cada tubo de amostra.
   3. Misturar vigorosamente (por exemplo, vortex e / ou várias vezes pipeta cima e para baixo) as amostras para assegurar a completa dissolução em DMSO.
      Atenção: Execute as seguintes etapas dentro de um exaustor. Utilizado nas etapas seguintes, adicionou-se iodometano _(CH3 I), diclorometano (CH ₂ Cl _2, também conhecido como cloreto de metileno), e clorofórmio (CHCl _3, triclorometano), são líquidos voláteis, capazes de dissolver determinados tipos de plástico (por exemplo, luvas de borracha nitrílica) . Certifique-se de usar luvas resistentes a solventes. Devido à sua baixa viscosidade, e alta pressão de vapor, estes reagentes podem escorrer a partir de uma ponta da pipeta durante a transferência. Minimizar a perda de reagente e exposição potencial, mantendo a solução estoque ao lado do navio receptor.
   4. Transferir um volume total suficiente de iodometano para um pequeno tubo, limpo. Cada amostra de analito exigirá 105 ul de iodometano. Transferência de ~ 500 mL de diclorometano em another tubo limpo. Para evitar o entupimento da seringa, lavar a seringa com diclorometano imediatamente após a transferência de iodometano.
      Cuidado: iodometano é fotossensível, volátil e potente toxina capaz de danificar o sistema nervoso central ou causar a morte se inalado ou ingerido. Diclorometano é um potencial cancerígeno, mutagênico reprodutiva e potente capaz de irritabilidade de danificar vários órgãos ou causar a morte.
   5. Use uma seringa de analítica para adicionar 105 ul iodometano a cada amostra de analito. Cap tubos de analitos imediatamente para minimizar a evaporação iodometano. Agitar bem em vórtice e, se necessário, Centrifugar brevemente todas as amostras para assegurar que nenhum líquido permanece na tampa. Qualquer mudança de cor (por exemplo, ao marrom, roxo ou amarelo) sinaliza degradação iodometano, o que pode comprometer a seguinte reação permetilação.
   6. Lavar a seringa analítica utilizada para transferir iodometano com diclorometano, pelo menos, 3 vezes. Isto irá impedi-lo from entupimento. Eliminar este lavagem, juntamente com iodometano extra e diclorometano em um vaso de resíduos perigosos orgânica. Coloque tubos de ensaio utilizados em um recipiente de resíduos perigosos.
   7. Obter um novo conjunto de 2 ml tubos de reservatório de plástico. Remover snap-caps, se desejar.
   8. Desligue os filtros microcentrífuga Mini. Centrífuga as colunas desligado por 15 segundos a 2.400 × g, e em seguida, descartar os tubos do reservatório juntamente com o efluente DMSO.
   9. Re-ligar as colunas de spin centrifugadas, e colocá-los dentro dos tubos novos reservatórios. Número cada coluna de rotação e a sua correspondente tubo-reservatório com o mesmo número de amostra. Certifique-se que os mini tampões de filtro são apertados; potencial fuga pode ter impacto no passo seguinte. Minimizar o tempo entre a remoção de DMSO a partir das colunas de centrifugação e transferência das amostras de analito para as colunas de centrifugação.
   10. permetilação
       1. Transferir quantitativamente cada solução de amostra para seu correspondente NaOH-bead-cheia co microcentrífuga de spinlumn. Utilizar uma ponta de pipeta de 1.000 ul para este passo. Após transferência, friso aproximadamente 2 mm da extremidade de uma ponta de 200 ul e deixá-lo em o conteúdo da coluna para usar como um agitador. Repita o procedimento para todas as amostras.
          Nota: A baixa viscosidade de iodometano pode causar a perda de amostra, porque a solução de analito pode escorrer a partir da ponta da pipeta durante a transferência. Segurar o tubo de amostra e a coluna de spin adjacentes uns aos outros com uma mão, e rapidamente transferir a solução de amostra, com a outra mão.
       2. Permitir que a reacção permetilação prosseguir durante 11 min. Agita-se cada uma das amostras, pelo menos, 4-5 vezes durante este período. Para facilitar a permetilação eficiente, que ocorre na superfície dos grânulos de NaOH, utilizar pontas de carregamento de gel de ponta de pipeta-frisado como agitadores para misturar suavemente o conteúdo da coluna. mistura agressivo pode perfurar o filtro de rotação, pulverizar e suspender grânulos de NaOH (que podem reduzir a eficácia da subsequente extracção líquido / líquido), e / ou causar perda de amostra (como o SAmple-embebido grânulos de NaOH pode transbordar a partir da coluna).
       3. Na preparação para a etapa de extracção líquido / líquido subsequente, preparar uma quantidade suficiente de M de cloreto de sódio (NaCl) solução de 0,5 num tampão de fosfato de sódio 0,2 M (pH 7,0), para ser armazenada à temperatura ambiente. Cada amostra requererá um total de ~ 12 ml de solução de NaCl para todos os três ciclos de extracção líquido / líquido.
       4. Após a conclusão do período de permetilação 11 min, imediatamente ainda retire cuidadosamente as colunas e centrifugar-los por 15 segundos a 2.400 × g. Descarte as fichas.
   11. Remover imediatamente colunas de rotação da centrífuga e colocá-los em um novo conjunto de tubos de centrifugação reservatórios vazios, deixando a solução de fluxo contendo glicanos recém-permetilado trás. Não descartar nada.
   12. Logo que possível, adicione 300 mL de acetonitrilo (ACN) para os filtros, rotação NaOH-cheias secas. Centrifugar os filtros de spin durante 30 segundos a 9600 × g.
   13. immediatelY depois, transferir a solução permetilação principal (ou seja, a solução que foi incubada com as pérolas de NaOH para 11 min, em seguida, girado por meio do filtro de rotação para um tubo de centrífuga antes da adição de 300 ul de ACN na etapa anterior) para silanizada 13 x 100 mm tubos de ensaio de vidro de ⁴² contendo 3,5 ml de tampão 0,2 M de fosfato de sódio contendo 0,5 M de NaCl, pH 7,0 e misturar (vórtice) imediatamente. Evitar transferir qualquer resíduo sólido branco durante este passo. Faça isso para cada amostra antes de prosseguir para a próxima etapa.
   14. Sem demora, a transferência (combinar) do ACN-rotação através de cada tubo reservatório de (com) o resto da amostra de líquido no seu respectivo tubo de vidro silanizada e misturar (vórtice) imediatamente. Mais uma vez, evitar a transferência de qualquer resíduo sólido branco durante este passo. Cap, shake, e vortex o tubo de vidro. Repita o procedimento para cada amostra. Descartar as colunas NaOH e pipetas Pasteur em lixeiras apropriadas.
4. Líquido / líquido extraction e Glycan Purificação
   1. No interior do exaustor de fumos, adicionar 1,2 ml de clorofórmio para cada amostra. Imediatamente depois disso, a tampa os tubos de vidro silanizadas e misturar vigorosamente o conteúdo.
   2. Pré-aquecer blocos de metal a cerca de 75 ° C num colector de evaporação. Use blocos de aquecimento com poços que podem acomodar os 13 mm × 100 mm tubos de vidro.
   3. Obter um novo conjunto de pipetas silanizadas Pasteur, pipetas Pasteur não-silanizadas, e tubos de ensaio de vidro silanizadas com tampas.
      Cuidado: clorofórmio _(CHCl3) é um irritante, mutagênico e carcinogênico potencial capaz de permear através de alguns tipos de luvas.
   4. Centrifugar brevemente (~ 3000 x g) tubos de vidro contendo a amostra para separar as camadas aquosa e orgânica.
   5. Usar uma pipeta de Pasteur silanizada não o suficiente para extrair a camada aquosa de topo de tal modo que ~ 3 mm a camada aquosa permanece acima da camada orgânica inferior.
   6. Adicionar 3,5 ml de Na a 0,5 MCl solução num tampão de fosfato de sódio 0,2 M (pH 7) a cada tubo de vidro, misturar vigorosamente, e centrifuga-se brevemente (~ 3000 x g). Tal como na etapa anterior (1.4.3), utilizar uma pipeta de Pasteur silanizada não-extrair a camada aquosa.
   7. Repetir o passo anterior (1.4.4), mas deixe ~ 1 ml da camada aquosa.
   8. Usar uma pipeta de Pasteur silanizada limpa para transferir a camada orgânica para um tubo de ensaio de vidro silanizada mm limpa e adequadamente rotulada 13 × 100. Evitar contaminação aquosa extraindo-se da seguinte forma:
      1. Segurar ambos os tubos de ensaio de vidro silanizada e actuais novos adjacentes uns aos outros numa das mãos. Com a outra mão, pressione o bolbo de pipeta para criar bolhas durante a inserção da pipeta para baixo através da camada aquosa.
      2. Uma vez dentro da camada orgânica, parar de criar bolhas, e mantenha a lâmpada pipeta estável para permitir que as camadas orgânica e aquosa e para estabilizar a separar-se novamente. Em seguida, libertam lentamente a lâmpada para retirar o máximo de organicamada c possível, sem qualquer contaminação aquosa.
      3. Subir rapidamente a ponta da pipeta através da camada aquosa, e resistir ao reflexo natural de libertar ligeiramente a lâmpada (o que resulta na retirada alguma contaminação aquoso) ao aumentar a pipeta para fora do tubo.
      4. Rapidamente transferir a camada orgânica de baixa viscosidade para o novo tubo adjacente. Qualquer contaminação aquosa serão visíveis como pequenas gotículas de líquido na parte superior da camada orgânica extraiu-se nos novos tubos de vidro. Se a contaminação aquosa / NaCl é visível, removê-lo com uma pipeta; centrifugar se necessário para reunir as gotículas aquosas em uma única gota.
   9. Devidamente dispor de tubos antigos de vidro, pipetas, e aquosa e soluções de resíduos orgânicos. Lave e reciclar tampas de tubos de vidro.
   10. Seca-se todas as amostras sob uma corrente suave de azoto e constante num colector de evaporação pré-aquecido a 75 ° C durante ~ 5 min dentro de um extractor de fumo. Para garantir o resfriamento evaporativo durante todo ste seca-downps, um fluxo suave e constante de azoto deve perturbar a superfície do líquido, sem respingos ou salpicos do líquido. Retirar amostras a partir do colector de evaporação após a secagem completa da amostra final. manchas brancas na parte inferior do tubo de vidro secas indicam tampão contaminação / NaCl.
   11. Pause o procedimento aqui se não há tempo suficiente remanescente no dia para completar a etapa de hidrólise de TFA. Temporariamente (isto é, durante a noite) armazenar amostras secas a -20 ° C. Para continuar o procedimento após o armazenamento, retire as amostras do freezer -20 ° C e permitir-lhes para aquecer completamente antes uncapping.
   12. Embora as amostras quente, em preparação para a hidrólise ácido trifluoroacético (TFA) (fase seguinte), definir a manta de aquecimento de tal modo que a temperatura dos conteúdos de proveta líquido irá atingir 121 ° C. Prepare a solução de TFA a partir de ações TFA (ver Passo 2.1 abaixo).

2. Ácido trifluoroacético (TFA) Hidrólise

Cuidado: ácido trif luoroacético (TFA) é um ácido orgânico corrosivo e tóxico irritante.

1. Prepara-se uma quantidade suficiente de uma solução 2,0 M de TFA em água desionizada. Cada amostra de analito exigirá 325 uL de solução 2,0 M de TFA. Concentrado de TFA é 13,0 M.
2. Adicionar 325 uL de TFA a 2,0 M a cada amostra de analito. Para evitar a evaporação de TFA e a perda de amostra durante o passo de secagem subsequente (2.3 abaixo), tapar bem a cada tubo de amostra imediatamente após a adição de TFA. Marque o nível de solução em todos os tubos de vidro. Vortex cada amostra cuidadosamente antes do passo seguinte.
3. Incubar os tubos de amostra tapados firmemente durante 2 horas num bloco de aquecimento pré-aquecida adequado ou forno de tal modo que o conteúdo atingir uma temperatura de 121 ° C. Se usando um bloco de aquecimento em vez de um forno, os tubos de amostra com tampa de folha de alumínio para evitar a condensação de TFA, na parte superior do tubo e a secagem parcial do resíduo da amostra na parte inferior do tubo. Verifique os níveis de solução de amostra após 20-30 min.para assegurar a mínima evaporação de TFA. Se necessário, aperte as tampas de mais ou substituir as tampas para um ajuste mais apertado.
4. Durante o tempo de espera de 2 horas, ajustar um outro colector de evaporação a 75 ° C durante o passo seguinte (ver 2.4).
5. Quando o período de aquecimento, 2-h é amostras completas, seco a 75 ° C sob uma corrente suave de azoto gasoso durante ~ 15 min. Não deixe amostras sem supervisão por mais de 15 min. Verifique frequentemente amostras e interromper o aquecimento e secagem, uma vez todas as amostras estão secos.
6. Pause o procedimento aqui se não há tempo suficiente remanescente no dia para completar o passo de redução. Temporariamente (ou seja, durante a noite) amostras armazenar a -80 ° C. Para continuar o procedimento após o armazenamento, retire as amostras desde a -80 ° C freezer, e permitir-lhes para aquecer completamente antes uncapping.

3. Redução

1. Dentro de uma hotte, preparar uma quantidade suficiente de um boro-hidreto / L de sódio 10 g _(NaBH4) em solução de 1 M ammoniUM hidróxido de (NH ₄ OH). Cada amostra requererá 475 ul desta solução. Faça uma solução nova para cada lote de amostras. Hidróxido de amónio concentrado (27-30% w / w NH ₃₎ é de cerca de 14,5 M.
   Cuidado: borohidreto de sódio _(NaBH4) é uma toxina higroscópico, reativa-água e potente irritante que liberta-upon contato com vapores inflamáveis ​​altamente água que causam graves queimaduras por contacto inalação, ingestão ou olhos / pele.
   Cuidado: hidróxido de amônio (NH ₄ OH) é um irritante corrosivo e toxina capaz de causar queimaduras graves e danos irreversíveis de órgãos após contacto inalação, ingestão ou olhos / pele. Lave as áreas afetadas com água durante 30 min, e impedir a vítima de esfregar ou coçar as áreas afetadas.
2. Para cada amostra, adicionar 475 uL de a 10 g / L de NaBH ₄ em 1 M _de NH ₄ OH. amostras misture bem para dissolver quaisquer resíduos. tubos de ensaio tampão epermitir que a reacção de redução para continuar durante 1 h.
3. Durante o tempo de espera de 1 hora, ajustar o colector de evaporação aquecida a 75 ° C. Use um bloco de aquecimento com poços apropriados para os tubos de vidro (veja 3.4).
4. Quando o período de reacção de 1 h está completa, adicionar 63 uL de metanol (MeOH) para cada amostra. Este passo e o seguinte passo de remover boro residual como borato de trimetilo - um líquido relativamente volátil que entra em ebulição a 68 ° C.
5. Amostras secas (no colector pré-aquecida) a 75 ° C sob uma corrente suave de azoto gasoso durante ~ 15 min. Verifique frequentemente amostras e não deixá-los abandonados. As pequenas gotículas de líquido na parte inferior dos tubos de vidro, a amostra não é ainda seco.
   Nota: Para distinguir as bolhas de ar a partir de gotas de líquido, inclinar o tubo de ensaio. Somente gotículas de líquido vai passar depois de inclinar, mas o inverso não é sempre verdadeiro: se uma bolha não se move, ele ainda pode ser um (muito pequeno) gota de líquido.
6. Uma vez samplES são completamente seco, preparar uma mistura 9: Solução 1 (v / v) de metanol (MeOH) e ácido acético (AcOH). Adicionar 125 ul desta solução de MeOH: AcOH para cada amostra.
7. As amostras secas em um colector (pré-aquecida) a 75 ° C sob uma corrente suave de azoto gasoso.
8. Quando as amostras são completamente seco, no vácuo secar as amostras para 20 min à temperatura ambiente: Colocar as amostras em uma banheira de vácuo de plástico (como os vendidos pela FoodSaver), feche a tampa de vácuo, definir o disco de vácuo para "vácuo", conecte o mangueira de vácuo, e ligue o vácuo. Para desmontar o vácuo, inverta essas etapas. Aguarde que o sistema para descomprimir completamente antes de tentar abrir a tampa de vácuo.
9. Pause o procedimento aqui se não há tempo suficiente remanescente no dia para completar o passo de redução. Temporariamente (ou seja, durante a noite) amostras armazenar a -80 ° C. Para continuar o procedimento após o armazenamento, retire as amostras desde a -80 ° C freezer, e permitir-lhes para aquecer completamente antes uncapping.
10. Enquanto espera para amostras para aspirar-seco (quente ou, depois da armazenagem), se preparar os reagentes para o passo seguinte. Obter e número um silanizada amostrador automático cónico-bottom (AS) frasco (com tampa) para cada amostra. Além disso, pré-aquecer ambos os num bloco de aquecimento superficial AS-poços frasco e um bloco de tubos de vidro de poços profundos de modo a que os conteúdos do tubo de vidro vão atingir uma temperatura de 50 ° C.

4. A acetilação (realizada em um Fume Hood)

1. Adicionar 18 mL de água desionizada a cada amostra. Cap e completamente vortex todos os tubos para dissolver completamente quaisquer precipitados.
2. Adicionar anidrido acético 250 ul a cada tubo de vidro. Boné, completamente vórtice, e sonicado num banho de água durante 2 minutos para assegurar a dissolução completa de todos os resíduos e precipitados.
3. Cobrir tubos de vidro com uma folha de alumínio, e incuba-se a uma temperatura interna de 50 ° C durante 10 min.
4. Adicionar 230 uL de ácido trifluoroacético concentrado (ATF) para cada amostra. tampa imediatamente umd misturar as amostras. Em seguida, incubam-amostras cobertas com folha de alumínio durante 10 minutos a uma temperatura interna de 50 ° C.
5. Após a incubação, adicionar 1,8 ml de diclorometano (CH ₂ Cl ₂₎ para cada amostra. Tampe e misture bem.
6. Adicionar 2,0 ml de água desionizada a cada amostra. Cap e amostras misture bem. Centrífuga de 0 a 3000 x g para separar as camadas. Usar uma pipeta de Pasteur silanizada não para efectuar a extracção líquido / líquido conforme descrito no Passo 1.4.6, evitando a contaminação da água.
7. Repetir a extracção mais uma vez, para um total de duas extracções. Use pipetas Pasteur silanizadas para transferir a camada orgânica em rotulados silanizada AS frascos (realizada de forma segura em um rack AS). Encha os frascos quanto ao logo abaixo da borda.
8. Usar um pré-aquecida, bem raso-bloco de aquecimento para amostras secas (em frascos AS) durante 15 min a 40 ° C sob gás de azoto. Não excesso de seca. Os produtos finais são conhecidos como parcialmente metilados acetatos de alditol (PMAAs).

5. Cromatografia Gasosa - Espectrometria de Massa (GC-MS)

1. Reconstituir cada amostra em 100 ul de acetona e misturar bem. Use um amostrador automático para injectar 1 ml de cada amostra em modo de divisão para o GC-modo de divisão liner (mantida a 280 ° C e contendo um pequeno tampão de lã de vidro silanizada). Usar uma razão de divisão de 40. A utilização de hélio como o gás veículo no modo de fluxo constante a 0,8 ml / min através de uma coluna de GC DB-5ms 30-m com uma ID de 0,25 mm e 0,25 micron de espessura de filme.
2. Mantenha a temperatura do forno GC inicial a 165 ° C durante 0,5 min. Após o tempo de espera inicial, programa o forno a rampa da temperatura, para cada ensaio, a partir de 165 ° C a 265 ° C a uma velocidade de 10 ° C / min (o que demora 10 minutos) e, em seguida, rampa imediatamente a temperatura de 265 ° C a 325 ° C a uma velocidade de 30 ° C / min (o que demora 2 min) e manter a temperatura a 325 ° C durante 3 min. O tempo total da corrida por amostra é de 15,5 min.
3. Use um properolizadas sintonizado e calibrado espectrómetro de massa para sujeitar os componentes da amostra que eluem da coluna de GC a ionização de electrões (El, 70 eV a 250 ° C). Para um analisador de massa TOF, analisar fragmentos de m / z 40 até m / z 800 com uma taxa de adição de impulsos de 0,1 seg. Defina um tempo de atraso solvente EI-filamento de 2,5 min.

Análise 6. Os dados

1. Se utilizando um analisador de massa TOF, somar o mais abundante e / ou de diagnóstico de fragmentos de iões para cada PMAA através da aplicação de uma janela de massa de 0,15 Da até se obter um cromatograma iónico extraída. Iões-alvo para cada PMAA ter sido publicado anteriormente, ^33, mas as seguintes alterações foram feitas: íons t-Glc estão agora 145,1 + 205,1; 2-Man íons são 161,1 + 189,1; 3-Gal íons são 161,1 + 233,1, 6-Gal íons são 161,1 + 189,1 + 233,1; 2,6-Man íon é 189,1; íons 3,6-homem são 189,1 + 233,1.
2. Use QuanLynx ou outro software para integrar automaticamente as áreas de pico para cada resumiu extraídos cromatograma iónico.
3. Verificar manualmente os resultados de integração, visualizando cada cromatograma de iões extraídos integrado. Em seguida, exportar os dados de integração de pico para uma planilha para análise e normalização de dados, o que implica a divisão da área de cada XIC hexose individual, a soma de todas as áreas hexose XIC; Da mesma forma, a área de cada indivíduo HexNAc XIC é dividido pela soma de todas as áreas HexNAc XIC. Este procedimento produz abundâncias normalizados para cada indivíduo e hexose HexNAc.

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Resultados

Um cromatograma iónico total de corrente (TIC) que mostra permetilação bem sucedida, hidrólise, redução, e acetilação das amostras de plasma de sangue humano relativamente aos casos em que dois passos críticos permetilação foram incorrectamente executadas são mostrados na Figura 3.

Rendimento absoluto do HexNAc Relativo ao Hexoses:

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Discussão

Em geral, a produção bem sucedida de alditol acetatos parcialmente metilados (PMAAs) a partir de hexoses é cheio com menos dificuldades e é mais robusta do que a produção bem sucedida de N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. O mecanismo exato por trás desse fenômeno, uma vez que se desenrola em cada passo deste processo é desconhecida, mas devem estar relacionados com a química única do grupo acetil N (em vez de grupo hidroxila) que é exclusivo para HexNAc relação ao hexoses. O mecanismo su...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium hydroxide beads	367176	Sigma-Aldrich	20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 ml Spin column	69705	Pierce division of ThermoFisher Scientific	Includes  plugs and polyethylene frits
GC-MS autosampler vial (silanized)*	C4000-9	ThermoFisher Scientific	Target DP High Recovery Vial, 1.5 ml, 12 mm x 32 mm, includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 ml polypropylene test tubes	05-402-25	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
2 ml polypropylene test tubes	05-408-138	ThermoFisher Scientific	Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	D8418	Sigma-Aldrich	BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane	I8507	Sigma-Aldrich	Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile	A955-4	ThermoFisher Scientific	Optima LC/MS
Microcentrifuge	75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge	ThermoFisher Scientific	24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)*	53283-800	VWR	13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes	14-930-15D	ThermoFisher Scientific	Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13 mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride	S7653	Sigma-Aldrich	>99.5% pure
Chloroform	4440-08	Macron Fine Chemicals
Trifluoroacetic acid	299537	Sigma-Aldrich	99% purified by redistillation for protein sequencing
Sodium borohydride	71321	Fluka Analytical	99%
Ammonium hydroxide solution	320145	Sigma-Aldrich	NH3 content: 28.0-30.0%
Methanol	AH230-4	Honeywell Burdick & Jackson	HPLC grade
Acetic acid	320099	Sigma-Aldrich	99.70%
Plastic vacuum desiccator	Any model of adequate size	FoodSaver
Acetic anhydride	539996	Sigma-Aldrich	99.50%
Dichloromethane	D143SK-4	ThermoFisher Scientific	Stabilized HPLC grade
Acetone	9006-03	J.T.Baker	Baker Analyzed
Heated evaporation manifold (main unit)	pi18823	ThermoFisher Scientific	Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator)	pi18826	ThermoFisher Scientific	ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold	pi18816	ThermoFisher Scientific	Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13 mm dia test tubes, 13 holes (14 mm dia. x 45 mm deep)
Gas chromatograph	Model A7890	Agilent	Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer	GCT Premier (Time-of-Flight)	Waters
Split-mode liner (deactivated / silanized)	5183-4647	Agilent	Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column	122-5532	Agilent	30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane	95541	Sigma-Aldrich
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization)	EW-06536-30	Cole-Parmer	12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.