Imagem intravital de neutrófilos Priming Usando IL-1-driven promotor DsRed Mice Reporter

Resumo

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Resumo

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes na circulação sanguínea humana e são rapidamente recrutados para sítios inflamatórios. Priming é um evento crítico que aumenta a funcionalidade fagocitária dos neutrófilos. Apesar de extensos estudos têm revelado a existência e importância de priming de neutrófilos durante a infecção e lesões, os meios de visualizar este processo in vivo têm sido indisponíveis. O protocolo fornecido permite o monitoramento do processo dinâmico de neutrófilos priming em animais vivos através da combinação de três métodos: 1) sinal de repórter DsRed - usado como uma medida de priming 2) in vivo rotulagem de neutrófilos - alcançada por injecção de antigénio anti-linfócito de fluorescência conjugada 6G (Ly6G) de anticorpo monoclonal (mAb) e 3) de imagem confocal intravital. Vários passos críticos estão envolvidos neste protocolo: Rato inflamação induzida por oxazolona pele da orelha, sedação adequada de animais, injeções repetidas de Ly6G anti-mAb, e prevenção do desvio de foco durante o exame. Embora não tenham sido observadas algumas limitações, tais como o limite de tempo de imagem contínua (~ 8 horas) em um mouse e o vazamento de isotiocianato-dextrano fluoresceína a partir de vasos sanguíneos no estado inflamatório, este protocolo fornece uma estrutura fundamental para imagiologia intravital de comportamento e função de neutrófilos com iniciador, que pode ser facilmente expandido para análise de outras células do sistema imunológico em modelos de inflamação do rato.

Introdução

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes e de curta duração em circulação. Eles são rapidamente recrutadas para os locais de infecção ou lesão, onde servem fagócitos como profissionais através de liberação de intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio, juntamente com grânulos contendo peptídeos antimicrobianos e proteases ^1. Durante o seu recrutamento, os neutrófilos são "preparada" por vários agentes, incluindo os produtos microbianos, quimioatractivos, e citocinas inflamatórias, resultando em funcionalidade de fagócitos marcadamente melhorada após a chegada ao sítio de inflamação ^2. Os mecanismos de escorvamento de neutrófilos têm sido extensivamente estudada in vitro ^3,4; No entanto, o controlo dinâmico do processo in vivo, não foi possível até à data.

Recentemente, tornou-se imagens intravital uma técnica importante para visualizar e quantificar a dinâmica de processos biológicos celulares em organismos vivos. IntraviTal imagem pode ser realizada por meio de microscopia de excitação de um fotão convencional (por exemplo, confocal) ou microscopia multifotônica aproxima ^5. Com o tempo, melhorias substanciais foram alcançados nesta técnica que permite maior resolução de imagem, profundidade de imagem melhorada, diminuiu photodamage tecidos e melhorada ^6,7 estabilização de imagem. Dada a sua capacidade única para permitir a visualização dinâmica da migração celular e interação ao longo do tempo, microscopia intravital tem sido amplamente aplicada a diversas áreas de estudo em imunologia ^8. imagens intravital permite imunologistas para melhor compreender e contextualizar as respostas imunes, tanto a nível celular e molecular em modelos animais vivos.

Os recentes avanços na transgênicos, bem como knock-in ratos repórter forneceram ferramentas úteis para o monitoramento dos comportamentos dinâmicos de neutrófilos em animais vivos. Lisozima M promotor-driven proteína verde fluorescente melhorada knock-inratos têm sido amplamente utilizados para caracterizar a motilidade de neutrófilos, monócitos e macrófagos, durante vários processos inflamatórios incluindo extravasamento, infecção bacteriana, e a inflamação estéril ^9-15. Além disso, os ratinhos transgénicos que expressam uma energia de ressonância de fluorescência de transferência biossensor citoplasmática foram empregues para estudar as actividades dos neutrófilos mitogénio quinase extracelular regulada e proteína quinase A dentro de intestino inflamado ^16. Um modelo murino com elevada especificidade para a expressão de fluorescência em neutrófilos é a knock-in rato Catchup, que produz a recombinase Cre, bem como a proteína fluorescente tdTomato, que por sua vez está acoplado a expressão de antigénio de linfócitos 6G (Ly6G) ^17. A visualização de neutrófilos Ly6G deficientes via este modelo tem demonstrado que estas células exercer funcionalidade normal numa variedade de contextos in vivo inflamatórias estéreis ou infecciosas em. camundongos transgênicos expressando o DsRed fluorescente protein gene sob o controlo do rato interleuikin-1β (IL-1β) promotor (pIL1-DsRed) ter sido utilizada para visualizar os comportamentos motilidade de células produtoras de IL-1 - Acredita-se que os neutrófilos, os monócitos inflamatórios, e macrófagos activados - emergente em pele inflamada ^18.

In vivo rotulagem pode servir como uma abordagem alternativa para a detecção de comportamentos celulares e moleculares de neutrófilos nos tecidos inflamados. Depois de injecção intravenosa de doses baixas de anticorpo monoclonal marcado por fluorescência anti-Gr-1 (Acm), a cascata de recrutamento de Gr-1 ⁺ neutrófilos foi visualizada em lesões da pele do rato infectados com Staphylococcus aureus ^19. Administração in vivo de conjugados contendo estreptavidina conjugados 705 pontos quânticos nm e mAb anti-Ly6G biotinilado rotular especificamente neutrófilos circulantes ^20. Além disso, a endocitose de tais conjugados em neutrophIL vesículas permite o acompanhamento do transporte de vesículas de alta velocidade em neutrófilos que migram para o interstício. In vivo, marcação com anticorpos de fluorescência conjugada contra a P-selectina Ligando-1 Glicoproteico (PSGL-1), L-selectina (CD62L), integrina αM (CD11b ) e quimioquina (motivo CXC) do receptor 2 (CXCR2) num modelo inflamatória induzida por TNFa tem elucidado os mecanismos de regulação em jogo durante a inflamação precoce ^21. neutrófilos polarizados sobressair urópodos PSGL-1-enriquecida para interagir com CD62L presente em plaquetas activadas, resultando na redistribuição de CD11b e CXCR2, receptores que dirigem a migração de neutrófilos e iniciam a inflamação.

IL-1β é um dos genes de assinatura que é elevado em neutrófilos sensibilizados ^22. Em ratinhos repórter pIL1-DsRed, DsRed sinais de fluorescência (isto é., A activação do promotor de IL-1β) correlacionam-se positivamente com a IL-1β expressão de ARNm e a produção de proteína IL-1β. ^{18 Para monitorar o processo de priming de neutrófilos, um método de microscopia intravital foi desenvolvido envolvendo a indução de inflamação da pele com oxazolona (OX) no modelo do rato pIL1-DsRed seguinte rotulagem in vivo de neutrófilos com Ly6G anti-mAb fluorescência conjugada. Através deste modelo, é possível estudar o comportamento e função de neutrófilos, preparadas em modelos animais de várias doenças e desordens.}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os experimentos com animais são realizadas de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de saúde e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade de Toledo.

1. A fenotipagem de pIL1-DsRed Mice

NOTA: Offspring são gerados por meio de cruzamento ratos pIL1-DsRed heterozigotos com o tipo selvagem camundongos (WT) C57BL6. Três a quatro semanas filhotes velhos são considerados prontos para fenotipagem. Sangramento submandibulares de ratinhos segue um protocolo estabelecido com modificações menores ^23.

1. O isolamento de glóbulos brancos do sangue total de rato filhotes de cachorro
   1. Adicionar 20 ul de heparina a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
   2. Adquirir um filhote da gaiola. Grave a etiqueta do filhote de identificação. Não é necessário para anestesiar filhotes antes de recolha de sangue a partir da veia submandibular.
   3. Segure filhote de cachorro pela nuca do pescoço e perfurou a veia submandibular no thbolsa da bochecha e usando uma lanceta 5 mm. Aplicar uma força suficiente para criar um pequeno furo, de modo que as gotas de sangue exalam do ponto de penetração. Utilize uma agulha nova para cada filhote.
   4. Recolhe 3 - 5 gotas de sangue por pup num tubo de microcentrífuga contendo heparina. Limpar o local da punção e aplicar pressão para facilitar a hemostasia.
   5. Coloque cinzento em nova gaiola e observar durante 30 min antes de voltar a gaiola para a instalação para animais.
   6. Recolha de sangue a partir de ratinhos adultos de um fenótipo conhecido como controlos positivos e negativos.
   7. Adicionar 500 ul de tampão de lise de células vermelhas do sangue a cada um dos tubos, os tubos de vórtice e incubar durante 5 - 10 min em gelo.
   8. Adiciona-se lentamente 400 - 500 ul de soro de bovino fetal (FBS) por baixo das suspensões de células em cada tubo. Uma interface clara pode ser observado entre a suspensão de células da camada superior e a camada inferior de FBS.
   9. tubos com tampas de amostras e centrifugar a 1.500 × g por 5 min.
   10. Repita os passos 1.1.7 - 1.1.9 à peleterap remover as células vermelhas do sangue. Não repita se lise é suficiente pela primeira vez. O sedimento deve ser difícil de discernir, após a centrifugação.
2. Lipopolissacarídeo (LPS) Estimulação e Cultura
   1. Ressuspender as células em 200 ul de completa Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
   2. Transferir a suspensão de células para um tubo de citometria de fluxo.
   3. Adicione LPS solução de trabalho através da mistura de 10 uL de solução de reserva de LPS (1 mg / ml) com 990 ul de meio RPMI 1640 completo.
   4. Adicionar 20 ul de 10 ug / ml de LPS de solução de trabalho de 200 ul de suspensão de células.
   5. Tampão tubos frouxamente e incubar as amostras durante 4 horas a 37 ° C com 5% de CO _2.
3. Fluxo de Análise de Citometria
   1. Abra o programa de aquisição de dados para citometria de fluxo. Configurar o modelo de aquisição antes de provar aquisição.
   2. Clique na ferramenta Dot-Plot na paleta ferramenta. Desenhar uma fodispersão rward (FSC) vs dispersão lateral (SSC) enredo. Defina os parâmetros de tensão FSC e SSC a escala linear.
   3. Selecione os limites inferiores de FSC e SSC permitidos pelo citômetro. Aplicar limiares de 200 e 50 para o FSC e SSC, respectivamente.
   4. Dentro do FSC vs SSC trama, desenhar um G1 portão que inclui monócitos, granulócitos e células dendríticas, e exclui detritos, células vermelhas do sangue e linfócitos.
   5. Clique na ferramenta histograma na paleta ferramenta. Desenhar um histograma FL2 (canal de fluorescência vermelha). Usar uma amostra de controlo negativo para definir a linha de base dos sinais de FL2 e uma amostra de controlo positiva para desenhar um portão para incluir todos os eventos positivos DsRed.
   6. No painel Fluidics Controle do citômetro, defina o modo fluido a "RUN" ea taxa de fluxo para "HI" (cerca de 60 mL / min). Adquirir 10.000 eventos para cada amostra.
   7. Determinar pup fenótipo através da medição da percentagem de células positivas DsRed da porta G1.

2. A indução da inflamação da pele em pIL1-DsRed Mice

1. Anestesiar rato por injecção intraperitoneal (ip) de injecção de um cocktail anestésico contendo 100 mg / kg de cetamina, 10 mg / kg de xilazina, e 1 mg / kg de acepromazina. camundongos devidamente anestesiados não mostram retirada da pata traseira para pitada dedo do pé.
2. Aplique o creme de remoção de pêlos à superfície dorsal de ambas as orelhas do rato. Aguarde 30 segundos a 1 min. Limpe a superfície da orelha com algodão molhado em água e deixe secar ao ar.
3. Medir a espessura da orelha usando micrômetro e substituir rato em uma gaiola separada. Observar até à recuperação da anestesia (~ 15-30 min). Para resolver a inflamação da pele induzida pelo produto da remoção do cabelo, permitem mouse para descansar por 3 dias antes da experimentação adicional é realizada.
4. Prepare a 1,25% (w / v) OX dissolvendo 16,7 mg de OX em 1 ml de acetona e mistura de 750 ul de solução / acetona OX, com 250 ul de azeite. Preparar a solução de veículo através da mistura de 750 mL de acetona com 250 &# 181; l de azeite.
5. Re-anestesiar o mouse através de injecção ip de cocktail anestésico (2,1). Medir a espessura da orelha como antes.
6. Aplicar 12,5 ul de 1,25% OX em cada lado da orelha direita. Aplicar 12,5 ul de solução veículo de acetona / azeite em cada lado da orelha esquerda.
7. Mantenha o mouse separar gaiola companheiros até que esteja totalmente recuperado para prevenir insulto aos seus ouvidos por outros ratos, em seguida, substituir o mouse em sua gaiola original e voltar a instalação de alojamento animal.
   NOTA: A remoção do cabelo pode resultar em inflamação de pele menor seguindo pela mudança da espessura da orelha. Esta inflamação menor será resolvido 3 dias mais tarde confirmada pela espessura do ouvido normal. Após a aplicação tópica, durante 24 h, tratada orelhas-OX mostram significativa (p <0,01) em comparação inchaço solução de veículo sozinha ouvidos tratados.

3. Rotulagem de neutrófilos no pIL1-DsRed Mice

NOTA: Na rotulagem vivo de neutrófilos pela baixa dose de fluorescence-conjugado mAb específicos de neutrófilos segue um protocolo recentemente desenvolvido ^19. Injecções retro-orbital, são realizadas de acordo com um protocolo estabelecido com algumas modificações ^24.

1. Preparar solução de trabalho de anti-Ly6G mAb por diluição de 10 ul de 0,5 mg / mL de Alexa Fluor 647 conjugado com anti-Ly6G mAb (clone 1A8) em 90 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
2. Transferir 100 ul da solução de trabalho Ly6G anti-mAb (50 ug / ml) para uma seringa de insulina U-100 com agulha de calibre 28.
3. Anestesiar um adulto pIL1-DsRed do mouse através de injecção ip do cocktail anestésico descrito anteriormente (2,1). Coloque o abdómen do rato anestesiado para baixo em uma placa de trabalho limpo.
4. Aplicar uma pressão descendente suave para a pele e dorsal ventral de um olho mouse para se projetam parcialmente o globo ocular da tomada.
5. Cuidadosamente colocar a agulha, o bisel para baixo, segundo um ângulo de aproximadamente 30 ° no canto medial para a retro-orbitalseio.
   NOTA: O operador pode sentir a pressão, a penetração e resistência aliviada uma vez que as inserções de agulhas dentro do seio.
6. Lenta e suavemente injectar 100 ul de Ly6G mAb anti-solução (5 ug de mAb / murganho / injecção) no rato de trabalho. Remover a agulha rapidamente. Uma pequena quantidade de sangramento sugere uma injecção bem sucedida.
7. aplicar imediatamente 1,25% OX e solução de veículo para a orelha esquerda do rato e direita.
8. Após 8 h, administrar 100 ul de solução preparada de fresco de mAb anti-Ly6G de trabalho (5 ug de mAb / murganho / injecção) através de injecção retro-orbital no mesmo rato.
9. Para visualizar os vasos sanguíneos, imediatamente antes de imagem, administrar 100 ul de 30 mg / ml de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated dextrano (150 kDa) por meio de injecção de retro-orbital.

4. Imagem intravital de neutrófilos Priming em pIL-1-DsRed Mice

1. Anestesiar rato com injeção ip de cocktail anestésico (2,1).0; Aplicar pomada veterinária para os olhos do mouse para evitar a secura sob anestesia para a imagem latente.
   1. Prepare 1 ml de meia-dose cocktail anestésico por diluição de 500 uL de mistura de anestésico original com um volume igual de PBS.
   2. Transferir a metade da dose de cocktail de anestésico a seringa de 1 ml com uma agulha de calibre 27 de borboleta.
   3. Insira a agulha de borboleta no abdômen do rato por via intraperitoneal e corrigir a asa de borboleta para o abdômen gravando.
2. Coloque uma lamela de vidro no centro da fase de imagem. Tape as bordas da lamela para segurá-la no lugar.
3. Colocar uma gota de PBS na superfície ventral da orelha de rato, bem como sobre a lamela.
4. Posição anestesiados rato com a sua orelha sobre a lamela. Montar a ponta da orelha, com o lado dorsal para baixo, como um sanduíche entre a orelha da lamela e uma lâmina de vidro, também mantida no seu lugar por meio de fita adesiva.
5. Ligue um multi-laser de microscópio de fluorescência confocal e todo o relacionado equipment. Desligue as luzes de quarto para minimizar a exposição de luz ambiente.
6. Abra o software de aquisição de imagem. Selecionar os canais de laser para detecção de corantes fluorescentes no menu Lista Dye.
7. Ajuste o foco na pele da orelha inflamado pela observação de sinais verdes dos vasos sanguíneos e sinais vermelhos das células DsRed ⁺ através da ocular.
8. Executar uma verificação rápida com velocidade de digitalização de 2 mS / pixel e resolução de 512 × 512 pixels. Selecione um pseudo para cada canal no menu Exibir Live. Ajuste o botão de foco para definir o fim e começar a localização da digitalização.
9. Realizar varreduras lentas com velocidade de digitalização de 4-8 ms / pixel e resolução de 800 × 800 ou 1.024 × 1.024 pixels. Ajustar a alta tensão, ganhar, e deslocamento em cada canal para maximizar a intensidade de sinais, evitando saturação (pixels vermelhos). Deve haver apenas alguns pixels vermelhos em cada canal.
10. Criar conjuntos de imagens tridimensionais, digitalizando thpele e orelha começando superficialmente no estrato córneo e progredindo para baixo com x, y, os volumes z de 317 uM × 317 uM × 30 mm (objectiva 40x), 635 uM × 635 uM × 30 mm (objectiva 20x), ou 1.270 uM × 1.270 mm × 50 mm (objetiva de 10X) em 2 mm z-passos.
    NOTA: O estrato córneo é a camada mais externa da epiderme e pode ser facilmente localizado com base no seu sinal de autofluorescência forte.
11. Em experimentos com imagens de lapso de tempo, ficha imagens tridimensionais a cada 2 ou 4 min por até 8 horas.
12. De forma intermitente, como o rato começa a se recuperar da anestesia, observou baseada na observação de bigodes espasmos, administrar 5 - 10 l de meia dose cocktail anestesia através da agulha borboleta.
    NOTA: Tenha cuidado com a dose de anestesia - overdose pode causar a morte mouse. Alternativamente, a anestesia por inalação de um frasco pode ser aplicado para o rato para anestesia a curto prazo e umcone de nariz pode ser usado para imagiologia de longo prazo.
13. Remover o rato anestesiado do palco quando imaging está completa. Retire a fita e remover a agulha borboleta do abdómen do mouse. Devolver o mouse para uma gaiola separada na unidade de alojamento dos animais.
    NOTA: Para imagens de curto prazo (<1 hora), os ratos se recuperar totalmente da anestesia rapidamente em 1-3 horas. Para imagiologia de longo prazo (~ 8 horas), os ratos recuperar lentamente, com um período de recuperação típico de 12 - 16 horas. Assim, a administração de água oral é recomendado, pelo menos várias vezes durante o período de recuperação para evitar a desidratação grave.
14. Conjuntos de dados de imagem de processo, rastrear células individuais, gerar rotas migratórias, e calcular a direção e velocidade de migração celular usando a imagem do software de análise ^25.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Rastreio dos ratinhos pIL1-DsRed é realizada com base no sinal de fluorescência fenotípica DsRed produzido pelos seus leucócitos do sangue periférico por citometria de fluxo. Estimulação por LPS é capaz de induzir a produção de IL-1β em células mielóides, incluindo neutrófilos, monócitos, e células dendríticas ^26-28. Assim, os leucócitos isolados foram incubados com LPS durante 4 h antes da análise de citometria de fluxo. Em seguida, é definida para propaga...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O objetivo deste estudo é desenvolver uma tecnologia para monitorar o processo de priming de neutrófilos em animais vivos, que ainda não foi cumprida pelas técnicas atualmente disponíveis. Para atingir este objectivo, três metodologias estabelecidas são realizados: 1) a indução de inflamação da pele em ratinhos repórter DsRed-driven promotor de IL-1p como uma medida da escorva, 2) in vivo rotulagem dos neutrófilos com doses baixas de fluorescência-conjugado anti-Ly6G mAb, e 3) de imagem de microsc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heparin sodium	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-540-31
ACK lysing buffer	Lonza	10-548E
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F0926
Lipopolysaccharides	Sigma-Aldrich	L4391
Ketamine hydrochloride	Hospira	NDC 0409-2051-05
Xylazine	LLOYD Laboratory	NADA #139-236
Acepromazine	Boehringer Ingelheim	ANADA 200-361
Hair-removal cream	Church & Dwight
Acetone	Fisher Scientific	A16P4
Oxazolone	Sigma-Aldrich	E0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody	BioLegend	127610
U-100 insulin syringe with 28 G needle	BD	329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDa	Sigma-Aldrich	74817
Butterfly infusion set (27 G needle)	BD	387312
FACSCalibur cytometer	BD
CellQuest Pro software	BD
Confocal microscope	Olympus	FV1000
Metamorph Software	Universal Imaging