Geração de células-tronco pluripotentes induzida por Usando sinoviócitos semelhantes a fibroblastos Isolado de articulações de pacientes com artrite reumatóide

Resumo

Aqui nós descrevemos um protocolo para a geração de células-tronco humanas pluripotentes induzidas por a partir de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos derivados de pacientes, utilizando um sistema lentiviral sem células alimentadoras.

Resumo

células somáticas adultas pode ser revertida em um estado de células estaminais pluripotentes-like usando um conjunto definido de fatores de reprogramação. Numerosos estudos têm gerado induzida por pluripotentes células estaminais (iPSCs) a partir de vários tipos de células somáticas por transdução de quatro Yamanaka fatores de transcrição: Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc. O estudo das iPSCs permanece na vanguarda da pesquisa biológica e clínica. Em particular, iPSCs específicos do paciente pode ser usado como uma ferramenta para o estudo pioneiro de patobiologia doença, uma vez que iPSCs pode ser induzida a partir do tecido de qualquer indivíduo. A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória crónica, classificada pela destruição da cartilagem e do osso na estrutura da articulação. hiperplasia sinovial é uma das principais razões ou sintomas que levam a estes resultados em RA. Sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLSS) são as principais células de componentes na membrana sinovial hiperplásica. FLSS na articulação limitlessly proliferam, eventualmente, invadindo o CARTIL adjacenteidade e osso. Actualmente, a sinóvia hiperplásica só pode ser removido por um procedimento cirúrgico. A sinóvia removido é utilizado para a investigação AR como um material que reflecte a condição inflamatória da articulação. Como um jogador importante na patogênese da AR, FLSS pode ser usado como um material para gerar e investigar as iPSCs de pacientes com AR. Neste estudo, foi utilizado o FLSS de um paciente com AR para gerar iPSCs. Utilizando um sistema de lentivírus, descobrimos que pode gerar FLSS RA iPSC específica para cada paciente. As iPSCs gerados a partir FLSS pode ser ainda utilizado como uma ferramenta para estudar a patofisiologia da RA no futuro.

Introdução

células-tronco pluripotentes são a plataforma de próxima geração em vários campos clínicos e biológicos. Eles são uma ferramenta promissora que podem ser utilizados nos modelos de doença, o rastreio de drogas, e a terapia médica regenerativa. Human Embryonic Stem Cells (hESCs) foram usados ​​principalmente para estudar e compreender células pluripotentes. No entanto, isolado pela destruição do blastocisto humano, hESCs estão associados com vários problemas éticos. Em 2007, o Dr. Shinya Yamanaka e sua equipe reverteu o processo de programação celular e desenvolveu células-tronco de adultos humanos células somáticas ^1,2. Portanto, ao contrário de hESCs, induzida por pluripotentes células estaminais (iPSCs) podem ser gerados a partir de células somáticas adultas, evitando os obstáculos éticos.

Normalmente, iPSCs são gerados através da entrega de quatro genes exógenos: Oct4, Sox2, KLF4, e c-Myc. Esses fatores Yamanaka são originalmente entregues usando sistemas de lentivírus e retrovirais. Os primeiros iPSCs foram derivadas de rato c somáticaells ^3. Mais tarde, a técnica foi aplicada para fibroblastos dérmicos humanos ^1,2. Estudos subsequentes com êxito iPSCs gerado a partir de várias fontes, tais como urina ^4, sangue ^5,6, queratinócitos ^7, e vários outros tipos de células. No entanto, existem algumas células somáticas que não foram utilizados na reprogramação, e rastreio das capacidades de reprogramação de vários tipos de células específicas de tecidos no estado de doença, é ainda necessária.

A artrite reumatóide (AR) é uma doença que pode atingir todas as articulações e levar a doenças auto-imunes em outros órgãos. RA afeta cerca de 1% dos adultos no mundo desenvolvido. É uma doença bastante comum e sua incidência aumenta a cada ano ^8. No entanto, o RA é difícil identificar nas fases iniciais e oncebone destruição ocorre não há nenhum tratamento que pode recuperar o dano. Além disso, a eficácia do fármaco varia de paciente para paciente, e que é difícil prever a medicINE que é necessário. Por conseguinte, é necessário o desenvolvimento de um método de rastreio de drogas, e um material de célula que pode reflectir as condições da AR é necessária.

Sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLSS) é um participante ativo celular na patogênese da AR ^9,10. FLSS existem no revestimento sinovial da íntima entre a cápsula e a cavidade articular, a qual também é referida como a membrana sinovial. Ao apoiar a estrutura conjunta e fornecer nutrientes para a cartilagem circundante, FLSS geralmente desempenham um papel crucial na função e manutenção conjunta. No entanto, FLSS na AR têm um fenótipo invasivo. RA FLSS têm um fenótipo de câncer, como, eventualmente, destruir o osso circundante por uma proliferação infinita ^10. Com esta característica única, FLSS pode ser usado como um material promissor que pode reflectir a patobiologia de RA. No entanto, estas células são raramente produzidos, e os fenótipos celulares como alterar as células passam por várias passagens in vitro condições. Portanto, pode ser complicado de usar RA FLSS como uma ferramenta que pode representar o estado do paciente.

Teoricamente, RA iPSCs derivadas de pacientes (RA-iPSCs) pode se tornar uma ferramenta ideal para o rastreio de drogas e novas pesquisas. IPSCs gerados têm capacidade de auto-renovação e pode ser mantido e expandido in vitro. Com pluripotência, essas células podem ser diferenciadas em linhagens de condrócitos e osteócitos maduras, que podem contribuir material celular para a pesquisa específica na AR e outras doenças relacionadas com os ossos ^11.

No presente estudo, nós demonstramos como isolar e expandir FLSS a partir de uma membrana sinovial removido cirurgicamente, e como gerar RA-iPSCs de FLSS usando lentivírus que contêm factores Yamanaka.

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Protocolo

Declaração de Ética: Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Católica da Coreia (KC12TISI0861).

1. Isolamento e sinoviito de expansão

1. Isolamento sinovi�ito
   1. Esterilizar dois pares de tesouras cirúrgicas e um par de fórceps.
   2. Transferir o tecido sinovial para uma placa de 100 mm e lava-se com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1% de penicilina / estreptomicina.
   3. Cortar os resíduos de tecido de gordura e ossos amarelados. Transferir o tecido cortado para um poço de uma placa de 6 poços e adicionam-se 5 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com soro bovino fetal a 20% (FBS).
   4. Pique os tecidos com a tesoura até que as peças são pequenas o suficiente para penetrar uma pipeta descartável.
   5. Transferir o meio contendo tecido para um tubo cónico de 50 ml. Colher o material remanescente por adição de 5 ml de DMEM com FBS a 20% para a placa de 6 poços e, em seguida, transferir para o tubo.
   6. colagenase Thaw no gelo. Adicionar a colagenase a uma concentração final de 0,01% e selar o tubo com parafilme. Incubar em um banho de água a 37 ° C com agitação durante 4 h.
   7. Após a incubação, encher o tubo com o meio DMEM com FBS a 20%, até que o volume total é de 50 ml e centrifugar a 300 xg, à ta durante 10 min.
   8. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e adicione 40 ml de meio para ressuspender o sedimento.
   9. Repita os passos 1.1.10-1.1.11.
   10. Ressuspender o sedimento em 25 ml de DMEM com 20% de FBS e esperar que as grandes aglomerações de tecido para desviar para o fundo.
   11. Transferir o sobrenadante para uma placa de 100 mm e incubar a 37 ° C em 5% de CO ₂ durante 14 dias.
2. Sinovi�ito Manutenção e Expansão
   1. Descartar os meios utilizados a partir da placa e lavar as células com 5 ml de PBS.
   2. Adicionar EDTA 1 ml de PBS / 1 mM e incuba-se a 37 ° C em 5% de CO ₂ durante 2 min.
   3. Toque o prato delicadamente e transfer as células para um tubo cónico de 15 ml. Centrifugar as células a 250 xg, TA, durante 2 min.
   4. Remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e ressuspender o sedimento em 30 ml de DMEM com 20% de FBS.
   5. Transferir as células a 3 x 100 mm, sem deixar qualquer material restante visível.
   6. Substituir a mídia com meios frescos a cada 3 d. Dividir as células a 80% de confluência utilizando EDTA 1 ml de PBS / 1 mM. Manter até 3 de passagem antes do uso. Divida cada prato de células em 3 pratos em cada divisão.
      NOTA: Depois de alcançar passagem 3, as células que não estão indo para ser utilizado de imediato pode ser congelado.

2. Reprogramação FLSS Usando lentivírus que codificam fatores de Yamanaka

1. Transdução (D0)
   1. Seed 3 x 10 ⁴ culas por po de uma placa de 6 poços em meio de crescimento (500 ml de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina). Incubar as células O / N a 37 ° C em 5% de CO2.
   2. No dia seguinte, remover um frasco de lentivírus contendo 4 Yamanaka factores: Oct4, KLF4, Sox2 e c-Myc a partir do congelador e descongelamento, a 4 ° C. Nota: Lentivírus foi produzido pelo processo descrito no nosso estudo anterior ^11.
   3. Enquanto o descongelamento do vírus, alterar os meios de comunicação para a mídia de crescimento FLS (20% FBS além de antibióticos em DMEM) contendo / ml de brometo de Hexadimetrina 10 mg e ácido ascórbico 50 mg / ml.
   4. Depois de alterar a mídia, adicionar 30 ul de lentivírus para as células e misture delicadamente. Para melhorar a infecção Centrifugar a placa a 680 x g, 35 ° C durante 30 min.
   5. Após centrifugação, as células incubar a 37 ° C em 5% de CO _2.
2. Manutenção Até reprogramação é visível
   1. Durante 3 dias, substitui os meios diariamente com meio de crescimento FLS contendo 0,1 mM de butirato de sódio e ácido ascórbico a 50 ug / ml.
   2. No dia seguinte, substituir a mídia com uma mistura de meios de crescimento FLS emeios iPSC (proporção 1: 1) contendo 0,1 mM de butirato de sódio e ácido ascórbico a 50 ug / ml.
      Nota: Os componentes dos meios iPSC é dada na lista de materiais / equipamentos.
3. As células de divisão de Formação de Colónias
   1. Prepara-se uma placa de 6 poços revestidas com vitronectina.
      1. Adicionar 60 ul de vitronectina a 6 ml de PBS, sem Ca ²⁺ e Mg ^2+. Coloque 2 ml de cada mistura em poços e incuba-se temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. Nota: A concentração de trabalho de vitronectina é de 5 ug / mL.
   2. No D5, lavar as células com PBS.
   3. Adicionar 1 ml de PBS / 1 mM EDTA para separar as células e incuba-se a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 2 min.
   4. Colheita das células e centrifugar a 250 xg, TA, durante 2 min.
   5. Dividir as células em 3 diferentes proporções (1: 3, 1: 6 e 1: 9) para se conseguir diferentes confluencies. Adicionar 900 ul de meios de comunicação para a pelete de células e ressuspender. Adicionar 300, 150, e 100 uL da mistura de células por poço de uma 6-bem placa para conseguir uma proporção de 1: 3, 1: 6, e 1: 9, respectivamente.
   6. Substitua os meios de comunicação diária com a mídia IPSC até colónias aparecer. Colónias aparece após cerca de D18. Nota: Nesta fase, as colónias IPSC co-existir com o FLSS não reprogramada.
4. picking Colony
   1. Prepara-se uma placa revestida com vitronectina de 48 poços por adição de 500 ul de vitronectina aos poços, e incuba-se à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
   2. Coloque o microscópio sobre uma bancada limpa, e remover a placa de 6 poços da incubadora.
   3. Remover a solução de vitronectina a partir da placa de 48 poços e adicionar 500 ul IPSC meios suplementados com 10 mM de Rho-associado, em espiral enrolada contendo proteína cinase (ROCHA) inibidor.
   4. Usando uma ponta 10p pipeta, corte em torno da colônia. Transferir a colónia escolhido para um poço da placa de 48 poços.
   5. Depois de escolher várias colónias, incubar as células a 37 ° C, 5% de CO _2.
   6. Manter as células até que as colónias são grandes enough para transferência. Nota: Normalmente as células derramado quando a colónia fica fora do campo visível do microscópio, quando visto uma ampliação de 100X.

3. Imunofluorescência Coloração

1. Preparação de Células
   1. Colocar uma tampa de vidro 18 milímetros estéril para uma placa de 12 poços.
   2. Adicionar 1 ml de PBS para esfriar e lave a tampa de vidro.
   3. Substituir com 1 ml de uma solução / 10 ug mL de vitronectina.
   4. Incubar a placa a temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
   5. Descartar a solução vitronectina e iPSCs placa na placa de 12 poços revestida com vitronectina e cultura durante 7 dias a 37 ° C, 5% de CO _2, mudando os meios diariamente.
2. A coloração celular
   1. Descartar o meio de cultura e lava-se as células uma vez com PBS.
   2. Fixar as células em 0,4% de paraformaldeído (PFA) durante 30 min à TA.
   3. Permeabilizar as células com 0,1% de Triton X-100 durante 5 min à TA.
   4. Remover a permeabilizaçãosolução e bloco com PBS contendo 2% de albumina de soro bovino (BSA) durante 30 min à temperatura ambiente.
   5. Dilui-se a anticorpos em PBS contendo BSA a 2% de acordo com a Tabela 1. Incubam-se as células com os anticorpos primários durante 2 h à RT.
   6. Adicionar o anticorpo secundário (diluído 1: 200) e incuba-se as células durante 1 h à temperatura ambiente, evitando a luz.
   7. Tratar as células com 1 ul / ml de DAPI durante 10 min.
   8. Colocar a tampa de vidro na parte superior da lâmina de vidro com antifade reagente e incubar à TA durante 24 horas, evitando a luz.
   9. Verificar a expressão com um microscópio de fluorescência.

4. em tempo real de Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR)

1. Extrair ARNm a partir do sedimento celular utilizando o tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio método de extracção ^11.
2. Amplificar o ADNc a partir de 2 ug de ARNm total usando transcrição reversa ^11.
3. Misturar os componentes necessários para a PCR utilizando 2 ul de ADNc de METplaca ^11.
4. Execute RT-PCR e verificar os resultados por eletroforese em gel de ^11.

5. fosfatase alcalina (AP) Coloração

1. IPSCs cultura durante 5-7 dias a 37 ° C, 5% de CO ₂ antes da coloração.
2. Aspirar os meios de comunicação e corrigir as células com PFA 4% durante 1 min.
3. Descartar o fixador e lavar as células com tampão de lavagem 1X.
4. Prepare os reagentes para coloração com AP. Misturar os reagentes nas seguintes proporções Fast Red Violet: solução de fosfato de Naftol AS-BI: água = 2: 1: 1.
5. Incubam-se as células com a solução de coloração à TA durante 15 min, evitando a luz.
6. Descartar a solução de coloração e lavar as células com tampão de lavagem.
7. Cobrir as células com PBS para evitar a secagem e verificar a expressão utilizando um microscópio de campo brilhante.

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Resultados

Neste estudo, nós descrevemos um protocolo para gerar iPSCs de FLSS usando um sistema lentiviral. A Figura 1A mostra um esquema simples do protocolo de isolamento FLS. A seguir à remoção cirúrgica da membrana sinovial, o tecido foi cortado em pequenos pedaços utilizando uma tesoura cirúrgica. A colagenase foi adicionado para isolar as células dos aglomerados de tecido. As células foram incubadas durante 14 dias antes de processamento adicional. A Figura<...

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Discussão

Antes da descoberta da iPSCs, os cientistas usaram principalmente os CES para estudar a biologia de células-tronco e outras linhagens de células através da diferenciação. No entanto, os CES originam a partir da massa interna de um blastocisto, que é um embrião de fase inicial. Para isolar os CES, a destruição do blastocisto é inevitável, levantando questões éticas que são impossíveis de superar. Além disso, embora os CES têm características stemness e pluripotência, eles não podem ser obtidos a parti...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 mlL Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
Collagenase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 ml)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/ml)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/ml)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde (PFA)	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004