Murino Experimental Modelo de desenvolvimento do tumor original e Peritoneal Metástase<em&gt; via</em&gt; Ortotópico injetar células do ovário Carcinoma

Resumo

Para esclarecer o processo de várias etapas de difusão peritoneal de carcinoma dos ovários, o presente estudo apresenta um modelo experimental murino de desenvolvimento do tumor original e metástases através de inoculação peritoneal ortotópico com essas células tumorais.

Resumo

carcinoma epitelial do ovário (EOC) está associada a um prognóstico ruim porque mostra disseminação peritoneal. Para melhorar o prognóstico, é importante controlar a disseminação peritoneal. No entanto, ainda não está claro como as células tumorais separar de lesões primárias e anexar ao mesotélio. O estabelecimento de um modelo animal apropriado é necessário para obter uma compreensão do mecanismo de disseminação peritoneal in vivo. No estudo actual, introduz-se o processo a partir da injecção local de células EOC para dentro da superfície do ovário murino para o desenvolvimento de metástases, incluindo o peritoneu e os órgãos distantes. Foram utilizados ratinhos nus fêmea (BALB / c nu / nu) com 8 semanas de idade. Sob um campo de vista microscópico, células EOC (1 x 10 ⁵ células / ml de matriz de médio extracelular (ECM) à base de hidrogel / ovário unilateral / mouse) foram injetados em ovários murino através de uma abordagem retroperitoneal pelo flanco dorsal. Este método proposto é um less procedimento invasivo para o mouse e minimiza os danos ao ovário. Aqui, descrevemos os passos metodológicos para o desenvolvimento da formação do tumor original e metastático do EOC.

Introdução

Carcinoma epitelial do ovário (EOC) representa a maior taxa de mortalidade relacionada ao câncer entre as doenças malignas ginecológicas ^1. EOC está associada a um mau prognóstico, principalmente devido ao seu final sintomatologia, e é muitas vezes associado a várias disseminações intraperitoneal e metástases à distância ^2-4. disseminação peritoneal é um processo multi-passo. Em primeiro lugar, as células de tumor a partir de separar as lesões primárias, e migrar para dentro da cavidade abdominal. Quando as células tumorais anexar ao mesotélio peritoneal, eles começam a invadir os tecidos através do mesotélio ^5,6. A fim de melhor compreender a biologia do tumor (por exemplo, a progressão do câncer e resposta terapêutica), modelos de ratos fornecer uma riqueza de informações. Um xenoenxerto de cancro humano com células é amplamente utilizada para modelos de ratos em que as células de cancro humano são inoculados por via subcutânea, por via intraperitoneal, por via intravenosa, e ortotopicamente. Um modelo animal com um ortotopicamente grafted tumor pode gerar mais eficientemente e com precisão os resultados que reflectem o ambiente tumoral em seres humanos, em comparação com um modelo animal com um tumor heterotopicamente enxertado. Por isso, para muitos tumores humanos, os modelos de transplante ortotópico foram estabelecidas ^7-11.

Aqui, descrevemos a inoculação ortotópico de células EOC humanos através de uma abordagem retroperitoneal pelo flanco dorsal, que tem capacidade de invasão limitada em comparação com a inoculação ventral. Esta técnica pode proporcionar uma variedade de informações úteis sobre EOC, particularmente o mecanismo de difusão intraperitoneal.

Protocolo

O protocolo de tratamento segue as orientações para a experimentação animal adotado pela Universidade de Nagoya.

1. Preparação de suspensões de células

1. linha de células humanas ovário clara carcinoma de células.
   1. Manter ES-2 em células ¹² meio RPMI-1640 com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e penicilina / estreptomicina (penicilina: 100 unidades / ml, estreptomicina: 0,1 mg / ml). As células de cultura a 37 ° C em uma incubadora de CO ₂ a 5% humidificada.
   2. Recolher as células em fase de crescimento logarítmico em 0,05% de solução de EDTA de tripsina / 0,02% (tripsina / EDTA).
      1. Em primeiro lugar, retirar os meios de idade a partir do recipiente de cultura de células, em seguida, lavar as células uma vez com PBS (PBS sem ^{Ca2 +} / ^{Mg2 +,} 3 - 4 ² ml por 25 cm).
      2. Em seguida, adicione 1 ml por 25 cm ² de tripsina / EDTA. Rodar o recipiente de cultura de células para cobrir a monocamada de células com tripsina / EDTA. Depois de retirar e descartar tripsina / EDTA, devolver o celularrecipiente de cultura na incubadora durante 3-5 minutos ou até que as células são separadas.
      3. Examinar as células sob um microscópio para assegurar que as células são separadas da superfície do recipiente de cultura de células e flutuante.
      4. Adicionar soro fresco contendo meio de crescimento para inactivar a tripsina (5 ml por cada 25 ^cm2), e re-suspender as células. Transferir as células ressuspensas a um tubo de 15 ml.
      5. Centrifugar a 300 xg durante 5 min. Realizar centrifugação quer a 4 ° C ou à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante e as células com meio de crescimento re-suspensão (5 ml por 25 ^cm2).
   3. Contagem de células (por exemplo, por exclusão de tripano azul), em seguida, re-suspender em meio de crescimento a uma densidade de 2 x 10 ⁸ células / ml. Colocar as células em suspensão em gelo.
2. Descongelar matriz extracelular congelado (ECM) à base de alíquotas de hidrogel num banho de gelo.
3. Adicionar a suspensão de células com ali quotas de hidrogel à base de ECM, na proporção de 1: 1 (célula C definitivaoncentration: 1 x 10 ⁵ células / ml de hidrogel baseado em médio ECM) e misture bem. Coloque as suspensões de células preparadas num banho de gelo até à sua utilização.

2. ortotópico inoculação com suspensões de células

NOTA: A cirurgia não requer um conjunto dedicado. A cirurgia pode ser executada em uma bancada de laboratório em uma área do quarto que é separado e possui uma actividade mínima. Um capuz laminar também pode ser usado. instrumentos cirúrgicos esterilizados devem ser utilizados e as tesouras não deve ser usado para fazer incisões na pele.

1. Use camundongos nu feminino (BALB / c nu / nu) com 8 semanas de idade, para este modelo de inoculação ortotópico.
2. Em primeiro lugar, anestesiar o rato usando inalação com isoflurano (2-4%). Verifique a profundidade da anestesia, verificando a falta de retirada mediante pitada dedo do pé firme. Após o rato é anestesiado, aplique uma pomada oftálmica estéril branda para os olhos para evitar a secagem, se necessário.
3. Coloque o rato anestesiado em um operating barriga do lado do palco para baixo. Desinfectar a área cirúrgica várias vezes com álcool e uma esfoliação à base de clorexidina à base de iodo ou.
4. Faça um ~ 2 cm de incisão vertical perto da espinha entre o arco costal direito e fêmur. Usar uma cobertura cirúrgica esterilizada em torno do local da incisão. Fixar as superfícies da pele incisão com grampos para manter a abertura.
   Nota: Os retractores pode ser usado em vez das braçadeiras.
5. Em seguida, fazer uma segunda incisão (aproximadamente 1 cm) no peritoneu parietal sob a primeira incisão para abrir a cavidade abdominal. Fixar as superfícies abdominais incisão. Clipe da gordura do tecido que rodeia o tubo falópico e ovário ipsilateral com uma braçadeira para remover o ovário a partir da cavidade abdominal. Com cuidado, coloque o ovário e trompa de Falópio em gaze. Em seguida, coloque barriga para o lado do mouse para baixo sob o microscópio de dissecação.
6. Colocar a suspensão de células em uma seringa de insulina (1/2 cc, 29 g) imediatamente antes da injecção. Cuidadosamente injectar a suspensão de células preparada (1- 2 ul) para o ovário. Para vários segundos, reter a agulha dentro do ovário para garantir a gelificação do hidrogel à base de ECM. Depois de a gelificação, as células de tumor injectadas no interior do ovário.
7. voltar cuidadosamente o ovário no corpo. Suturar a segunda incisão com seda médica estéril e, em seguida, selar a pele com grampos de sutura.
8. Após a cirurgia, os ratos serão administradas uma a analgesia (por exemplo, o meloxicam, intramuscular (IM) ou subcutânea (SC), 0,2 mg / kg) durante um período de 24 h inicial.

Tratamento 3. pós-cirúrgica

1. Coloque cada rato em uma gaiola separada em papel limpo, com um pacote quente para manter o mouse morna até que recuperou a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Em seguida, retornar os animais para suas gaiolas de criação e de monitoramento. Monitorar os ratos por dia durante 3 - 7 dias após o tratamento cirúrgico.
2. Monitoramento de ratos pós-operatória
   1. Em caso de sinais de dor, administrar analgesiasics diária (por exemplo, o meloxicam, IM ou SC, 0,2 mg / kg).
   2. Se os ratos têm sinais de infecção (por exemplo, vermelhidão, inchaço, secreção), administrar a injecção diária com um reagente anti-infeccioso (por exemplo, penicilina, im, 100.000 UI / kg).
3. Remover materiais fechamento da pele 10 - 14 dias após o tratamento pós-cirúrgico.

4. Análise de tumores e metástases

NOTA: O tumor será formada nas injectados ovário de 2 - 3 semanas após a inoculação.

1. Sacrificar os ratos por dióxido de carbono, e depois recolher as amostras (por exemplo, tumores, metástases e órgãos) ^13-15 para posterior análise ^14,16-20.
   NOTA: Se um sistema de imagem in vivo está disponível, células portadoras de enzimas que produzem bioluminescência (por exemplo, a luciferase) ou a proteína fluorescente (por exemplo, GFP) pode ser utilizado no presente protocolo. Este protocolo modificado irá fornecer informações úteis paraa dinâmica da disseminação de células de cancro a partir do tumor primário.

Resultados

Seis ratinhos nus tinham os seus ovários inoculados com a linha de células de carcinoma de células claras humano ES-2, tal como descrito no presente protocolo. Como mostrado na Figura 1A, após 2 semanas, 5 dos 6 ratos tinha um tumor no ovário inoculados com células ES-2, mas não havia nenhum tumor no ovário contralateral sem inoculação (utilizado como um controlo). Além disso, 2 dos 5 camundongos mostraram várias disseminações peritoneal com ascite. C...

Discussão

Os modelos animais são essenciais para analisar os mecanismos de desenvolvimento de tumores, progressão, metástase, e a eficácia do fármaco contra as células cancerosas. Os ratinhos portadores de células cancerosas do ovário humano, também têm sido usados ​​como um modelo animal. Aqui, descrevemos um procedimento menos invasivo para a administração de células tumorais de ovário em um sítio ortotópico. Usando este procedimento, a inoculação para o ovário através de uma abordagem retroperitoneal pe...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel matrix	BD	354234	ECM-based hydrogel
Insulin syringe	TERUMO	SS-05M2913	1/2 cc, 29 G x 1/2"
Suturing needle with suture			11 mm, 3/8, Nylon6-0
Reflex 7 mm Wound Clip Applier	CellPoint Scientific	204-1000
Reflex 7 mm wound clips	CellPoint Scientific	203-1000