A detecção visual Colorimétrico de polimorfismos multi-nucleótidos em uma plataforma de manipulação pneumático gota

Resumo

Este trabalho apresenta um método simples e visual para detectar polimorfismos multi-nucleotídeos em uma plataforma de manipulação gota pneumático. Com o método proposto, toda a experiência, incluindo gota de manipulação e de detecção de polimorfismos de vários nucleótidos, pode ser realizada próximo de 23 ° C, sem o auxílio de instrumentos avançados.

Resumo

Um método simples e visual para detectar polimorfismo de multi-nucleótido (MNP) foi realizada sobre uma plataforma de manipulação gota pneumática sobre uma superfície aberta. Esta abordagem para a detecção de ADN foi colorimétrico baseado no crescimento mediada por hibridação de sondas de nanopartulas de ouro (sondas AUNP). O tamanho e a configuração do crescimento do AUNP são dominadas pelo número de amostras de DNA hibridaram com as sondas. Com base nas propriedades ópticas e SIZE- dependente da forma específica das nanopartículas, o número de desemparelhamentos de um fragmento de ADN da amostra com as sondas é capaz de ser discriminado. Os testes foram realizados através de gotículas contendo os reagentes e as amostras de ADN, respectivamente, e foram transportadas e misturado na plataforma pneumática com a sucção pneumática controlada da membrana hidrofóbicas à base de PDMS flexíveis. Gotículas podem ser entregues simultaneamente e, precisamente, numa superfície aberta na plataforma pneumática proposta que é altamente biocompatível sem FEP ladoect de amostras de ADN no interior das gotas. A combinação dos dois métodos propostos, o polimorfismo de multi-nucleótido pode ser detectada à vista sobre a plataforma de manipulação gota pneumático; nenhum instrumento adicional é necessária. O procedimento de instalação das gotas na plataforma para o resultado final leva menos de cinco minutos, muito menos do que os métodos existentes. Além disso, esta abordagem combinada de detecção MNP exige um volume de amostra de apenas 10 ul em cada operação, o que é notavelmente menos do que a de um sistema de macro.

Introdução

-polimorfismo de um único nucleótido (SNP), que é uma única diferença de par de bases numa sequência de ADN, é uma das variações genéticas mais comuns. Estudos atuais relatam que SNPs estão associados com o risco de doença, a eficácia da droga e os efeitos colaterais dos indivíduos por afetar a função do gene. ^1,2 Estudos recentes também revelou que as mutações de dois ou multi-ponto (polimorfismo multi-nucleotídeo) causam doenças específicas e individuais diferenças nos efeitos da doença ^3,4 A detecção de polimorfismo de nucleotídeo. é, portanto, imperativo prescreening doença. Métodos simples e eficientes para a detecção rápida de oligonucleotídeos específicos de sequência foram altamente desenvolvido nas últimas duas décadas. ^1,5 As abordagens atuais para identificar mutações no DNA tipicamente procedimentos, incluindo a imobilização da sonda, rotulagem de fluorescência, eletroforese em gel, etc. envolvem, ^6,7 mas estes métodos requerem geralmente um processo analítico de comprimento, expenequipamentos sive, os técnicos bem treinados e consumo significativo de amostras e reagentes.

Uma nanopartícula com uma grande proporção de área de superfície para volume e propriedades físico-químicas únicas é um material ideal como uma plataforma de detecção altamente sensível e barato para biomarcadores específicos. As nanopartículas de ouro (AUNP) são amplamente utilizados para a detecção de DNA devido à sua grande capacidade de ser modificado com sondas de oligonucleotídeos. ^8-10 técnicas de detecção de SNP também foram desenvolvidos usando AUNP. ^11-13 Neste trabalho adotamos uma nova abordagem colorimétrico para detectar a polimorfismo multi-nucleótido (MNP) através do DNA crescimento mediada por hibridação de sondas AUNP. ¹⁴ Este método de sondagem simples e rápida é baseada na teoria de que os comprimentos variados de ADN de cadeia simples (ssDNA) ou de ADN de cadeia dupla (dsDNA), conjugada com AUNP influenciar o crescimento do tamanho e forma do AUNP (ver Figura 1). ¹⁵ Este método de detecção de ADNapresenta um pequeno consumo de reagentes, um ensaio de duração pequena (alguns minutos), e um processo simples, sem controlo térmico que é aplicável prospectivamente para o diagnóstico clínico e um exame médico interno.

Vários sistemas de microfluido para detectar a sequência de ADN ter sido desenvolvido; ¹⁶ Estes sistemas de microfluidos, evoluíram a partir de protocolos experimentais tradicionais, necessária menos peças de equipamento de grandes dimensões e simplificada os protocolos experimentais, de modo a melhorar a sensibilidade, limite de detecção e especificidade do ADN biossensor. Métodos de detecção de DNA nos sistemas microfluídicos ainda exigem, no entanto, instrumentos de um processo subsequente, como a PCR (reação em cadeia da polimerase) máquinas para a amplificação de sinal e um leitor de fluorescência para uma única leitura para identificar o SNP heterogêneo. ^17,18 Desenvolvimento de uma simples plataforma sem o processamento subsequente para ler diretamente os resultados de polimorfismo multi-nucleotídeoé altamente desejável. Comparado ao bem utilizado, convencional, fechou sistemas microfluídicos, o open-superfície dispositivos microfluídicos oferecem promissora várias vantagens, tais como um caminho óptico claro, uma maneira fácil de acessar a amostra, a acessibilidade ambiental direta e cavitação não facilmente formadas ou obstrução interfacial em o canal. ¹⁹ o nosso trabalho anterior apresentou uma plataforma pneumático simples para a manipulação da superfície aberta gotícula (ver Figura 2). ²⁰ Nesta plataforma, as gotas podem ser simultaneamente transportadas e manipulado sem interferência a partir de uma energia motriz usando uma força de sucção, que tem um grande potencial em aplicações biológicas e químicas. Esta plataforma pneumático foi assim utilizada para executar a manipulação de amostras de ADN para a detecção de MNP em combinação com a abordagem colorimétrico utilizando o conceito de ADN crescimento mediada por hibridação de sondas AUNP.

O protocolo apresentado neste artigo descreveuma detecção visual simples de polimorfismos multi-nucleotídeos na plataforma manipulação gota pneumático em uma superfície aberta. Este trabalho confirma que o polimorfismo multi-nucleotídeo é detectável a olho nu; a plataforma pneumático proposto é adequado para aplicações biológicas e químicas.

Protocolo

1. Método para Detectar MNP

Nota: Esta secção descreve o procedimento para detectar a MNP com base no crescimento mediada por hibridação de nanopartículas de ouro.

1. Prepara-se o ADN da sonda (5'-tiol-GAGCTGGTGGCGTAGGCAAG-3 ') solução a uma concentração de 100 uM.
2. Prepare o partículas AUNP sonda de DNA modificado (sonda AUNP). ²¹
   Nota: O volume utilizado aqui depende da exigência de AUNP sonda de DNA modificado (sonda AUNP) partículas. É, por conseguinte, dependente do número de experiências para ser realizado. Nós normalmente preparar partículas da sonda AUNP excesso como peças de reposição. O volume utilizado nestes passos é ajustável e flexível.
   1. Adicionar ADN sonda (100 pM, preparada no passo 1.1) a uma solução de nanopartículas de ouro (13 nM, 17 nM) a uma concentração de DO / ml.
   2. Traga as concentrações finais de sulfato de dodecilo de sódio (NAC ₁₂ H ₂₅ SO _4, SDS) e tampão de fosfato (PBS) a 0,01% e 0,01 M, respectively.
   3. Após 20 minutos, trazer a concentração de cloreto de sódio (NaCl) a 0,05 M com uma solução de cloreto de sódio (2 M) e PBS (0,01 M), mantendo a SDS a 0,01% e incubar durante 20 min.
   4. Aumentar a concentração de NaCl em incrementos de 0,1 M para uma concentração final de 1 M de mais de 20 intervalos mínimo.
   5. Incubar durante a noite com agitação num misturador de vortex a 23 ° C. A velocidade de agitação não afecta a experiência, enquanto as amostras de ADN e sondas AUNP tornar hibridada.
   6. Centrifugar as nanopartículas de ouro a 7.000 xg durante 30 segundos e remover o sobrenadante.
3. Adicionar partículas sonda AUNP em água desionizada (água Dl) a uma concentração de 25 nM (solução de sonda AUNP).
4. Preparar as amostras de ADN alvo totalmente complementares (: 5'-CTTGCCTACGCCACCAGCTC-3 '; três pares de bases incompatíveis: 5'-TTT CTTGCCTAC ACCAGCTC-3'; seis pares de bases incompatíveis: 5'-TTTTTT CTTGCCT CCAGCTC-3 ') em concentraçõesde 0,06, 0,11, 0,17, 0,20, 0,30, 0,50 uM, respectivamente.
5. Adicionar solução de sonda AUNP (6 ul, 25 nM) nas amostras de ADN (350 ul) com NaCl (14 uM).
6. Agitar a mistura de amostras de ADN e sondas AUNP com um misturador de vórtice a 23 ° C durante 5 min para hibridação de ADN.
7. Para o crescimento AUNP, adicionar NH ₂ OH (6 mL, 400 mM) e HAuCl ₄ (6 mL, 25,4 mM) à solução de (a mistura de amostras de ADN e sondas AUNP). O crescimento de AUNP leva cerca de 30 seg para conclusão. A mudança constante de coloração mantém mais do que 1 h.
   CUIDADO: O contato da pele com HAuCl ₄ pode produzir efeitos tóxicos graves. Por favor, consulte as folhas de dados de segurança de material (MSDS) antes do uso. Por favor, use luvas e utilizar um exaustor quando se utiliza HAuCl _4.

2. Fabricação de uma plataforma de Manipulação pneumática Gota

Nota: A plataforma de manipulação gota PDMS baseada compreende duas componentes: a Pmembrana de DMS (100 um) com uma superfície super-hidrófoba e uma camada de ar do canal (5 mm). Sem um processo de MEMS, os processos de maquinagem comuns foram utilizados para fabricar este dispositivo, que inclui o controlo por computador numérico micromaquinagem (CNC), para fazer um molde, a carcaça de PDMS e de replicação para prototipagem rápida dos componentes de microfluidos, e micromaquinação por laser para a fabricação de uma superfície super-hidrófoba (ver Figura 3).

1. Use a máquina de CNC equipado com uma broca (0,5 mm) para produzir moldes de mestre à base de PMMA (ver Figura 3) com microestruturas. Use uma velocidade de alimentação da broca bit 7 mm / seg e uma velocidade de rotação de 26.000 rpm. Usar um ventilador de ar e água desionizada para remover a sucata de PMMA e para limpar a superfície dos moldes mestres.
2. Prepara-se uma mistura da base de PDMS e o agente de cura na proporção de 10: 1. Desgaseificar a mistura no interior de um exsicador durante 30 minutos, ou até que todas as bolhas de ar são removidas.
3. Despeje o PDMS em the mestre de molde e assar o PDMS durante 3 horas a 60 ° C no forno para se obter as microstruturas inversas das câmaras de ar (membrana PDMS) e os canais de ar (camada de PDMS).
4. Retirar a camada de PDMS do molde mestre (à mão). Faça furos na camada de PDMS para entradas de ar de sucção.
5. Colocar a membrana PDMS, a camada de PDMS e o substrato de vidro dentro da câmara do sistema de tratamento de plasma de oxigénio. Após o tratamento por plasma de oxigénio, ligar-se a membrana de PDMS, a camada de PDMS e o substrato de vidro em conjunto numa placa de aquecimento (90 ° C) durante 10 min.
6. Coloque o chip compósitos para a máquina de corte a laser (PDMS lado da membrana para cima). Importar o arquivo .dwg para definir a área hidrofóbicas (15 mm × 12 mm). Veja a Figura 3. Diretamente gravar a membrana PDMS com uma máquina -Laser CO ₂ para criar a área hidrofóbicas na membrana PDMS (potência de 12 W, velocidade de varredura 106,68 mm / seg).
7. Limpe a superfície hidrofóbicas com água DI para lavardistância os resíduos carbonizados na superfície.
8. Ligue a entrada de ar de sucção e a bomba de vácuo através de uma válvula de solenóide (ver Figura 4). Conectar-se a válvula solenóide para o computador e controle com um módulo USB I / O digital.

3. Operação para a detecção de MNP na Plataforma Pneumática

Nota: Esta secção descreve a operação para identificar rapidamente o colorimetricamente e MNP na plataforma de manipulação gota pneumático (consulte a Figura 5). Todos os passos de ter lugar a 23 ° C (temperatura ambiente) e humidade relativa de 85%.

1. Coloque a gota de amostra de ADN alvo (10 ul, 0,5 uM) sobre a área hidrofóbicas da plataforma de manipulação gota pneumático.
2. Coloque a gota AUNP sonda (10 ul, 25 nM) sobre a área hidrofóbicas da plataforma de manipulação gota pneumático.
3. Controlar a sucção de ar para fazer com que a deflexão da membrana PDMS com uma válvula solenóide e uma Siprograma mple (por exemplo, o LabVIEW). Fornecer de sucção de ar em cada câmara de ar ao longo do caminho de migração das gotículas (contendo DNA alvo e as sondas AUNP respectivamente) sobre a membrana de PDMS de tal modo que as gotículas colidem uns com os outros e coalescer. Usar uma pressão de funcionamento da bomba de vácuo de -80 kPa (pressão manométrica).
   1. Em alternativa, controlar a sucção de ar manualmente, desde que a gotícula é completamente misturado. Ao lado, ligar ou desligar a bomba de vácuo e entradas de câmara de ar com tubos nas fases iniciais de testes.
4. Controlar o rolo de sucção de ar para a gotícula coalescida frente e para trás para aumentar a eficácia da mistura durante 3 min utilizando o sistema de controlo da válvula de solenóide. O DNA alvo e as sondas AUNP tornar-se bem misturados e hibridizados dentro de 3 min. Utilize uma frequência de condução e uma pressão de trabalho de 5 Hz e -80 kPa (pressão manométrica), respectivamente.
5. Coloque uma gota contendo NH ₂ OH (2 mL, 400 mM) e HAuCl4 (2 mL, 25,4 mM) sobre a área hidrofóbicas da plataforma de manipulação gota pneumático.
6. Controlar a sucção de ar (-80 kPa pressão gauge) para permitir que as gotículas colidem uns com os outros e se aglutinam. Em seguida, controlar a sucção de ar (5 Hz e -80 kPa de pressão) para permitir que o rolo coalescida gota a frente e para trás para aumentar a eficiência de mistura durante 1 min.
7. Meça e registre a cor da gota coalesceram com o olho nu.

Resultados

Neste trabalho, três amostras de DNA foram testadas utilizando um método simples e inovador de detecção através do crescimento de DNA mediada por hibridação das sondas AUNP. As sequências de DNA sonda e amostras de DNA de três tipos, especificamente, o cDNA (totalmente complementar à sonda de DNA), TMDNA (três pares de bases de DNA incompatíveis) e SixMDNA (seis pares de bases de DNA incompatíveis) estão listados no Protocolo etapa 1. os desemparelhamentos para a sonda de A...

Discussão

Neste protocolo, um método colorimétrico simples para detectar MNP pode ser implementado em concentrações que variam de 0.11-0.50 uM em tubos de microcentrífuga. Além disso, o método de detecção MNP proposto é conduzida sobre uma plataforma de manipulação gota pneumático que tem um elevado potencial para o rastreio de ADN e outras aplicações biomédicas. Na prática, o intervalo da concentração detectável de ADN da amostra depende da eficiência de mistura dos plataformas operacionais. Para assegurar q...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning	SYLGARD 184
benchtop engravers	Roland DG	EGX-400
laser cutting machine	Universal Laser Systems, Inc.	VLS 3.50
Oxygen plasma treatment system	Femto Science Inc. Korea	CUTE-MPR
solenoid valve			home built
vacuum pump	ULVAC KIKO, Inc.	DA-30D
13-nm AuNP solution	TAN Bead Inc., Taiwan	NG-13
DNA (with 5 -end labeled thiol)	MDBio, Inc., Taiwan
phosphate buffered saline (PBS)	UniRegion Bio-Tech,. Taiwan	PBS001-1L
sodium dodecyl sulfate (SDS)	J. T. baker	4095-04
Hydroxylamine solution (NH2OH)	Sigma-Aldrich	467804
Chloroauric acid (HAuCl4)	Sigma-Aldrich	G4022
sodium chloride (NaCl)
vortex mixer	Digisystem Laboratory Instruments Inc.	VM-2000
centrifuge	Hermle Labortechnik GmbH.	Z 216 MK