Induzir um bloqueio de replicação de site específico no<i&gt; E. coli</i&gt; Usando um sistema fluorescente repressor de operador

Resumo

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Resumo

Obstáculos presentes no DNA, incluindo proteínas firmemente ligados e várias lesões, pode inibir seriamente a progressão da maquinaria de replicação da célula. O retardamento de um replissoma pode levar a sua dissociação do cromossoma, em parte ou a sua totalidade, levando ao colapso do garfo de replicação. A recuperação a partir deste colapso é uma necessidade para que a célula completa com precisão a duplicação cromossómica e subsequentemente se dividem. diversos mecanismos Portanto, quando ocorre o colapso, a célula tem evoluído que tomam lugar para restabelecer a forquilha de ADN e permitir a replicação para ser preenchido com alta fidelidade. Anteriormente, estas vias de reparação de replicação em bactérias, foram estudados utilizando os danos UV, o que tem a desvantagem de não ser localizada a um local conhecido. Este manuscrito descreve um sistema que utiliza um sistema de fluorescência repressor Operator (FROS) para criar um bloco de proteína específica do local que podem induzir a estagnação e colapso da replicação forks em Escherichia coli. Protocolos detalhe como o estado de replicação podem ser visualizados em células vivas individuais usando microscopia de fluorescência e de replicação de ADN intermediários podem ser analisados ​​por electroforese em gel de agarose a 2-dimensional. Temperatura mutantes sensíveis de componentes réplisome (por exemplo DnaBts) pode ser incorporada no sistema para induzir um colapso síncrona dos garfos de replicação. Além disso, as funções das proteínas de recombinação e helicases que estão envolvidas nestes processos podem ser estudados utilizando knockouts genéticas dentro deste sistema.

Introdução

Durante a replicação do DNA, o replisome enfrenta obstáculos no DNA que prejudicar a sua progressão. Danos no ADN incluindo lesões e as lacunas assim como estruturas aberrantes pode impedir a replissoma de prosseguir ^1. Recentemente, verificou-se que as proteínas ligadas ao ADN são a fonte mais comum de impedimento à replicação progressão forquilha ^2. O conhecimento dos eventos após o encontro do replissoma com um bloco de nucleoproteína foi previamente limitada pela incapacidade de induzir uma tal bloco no cromossoma de uma célula viva no local conhecido. Análise in vitro aumentou a nossa compreensão do comportamento cinético de um replissoma activo quando se encontra com uma nucleoproteína bloqueio ^3, bem como os detalhes mecanísticos da própria replissoma ^4,5. Entendimento atual da reparação de replicação é geralmente realizada com UV como o agente prejudicial e estudada usando DNA plasmídeo in vivo ^6-8 . Enquanto as proteínas que podem estar envolvidos na reparação do ADN após encontra um bloco de nucleoproteína in vivo são geralmente entendidos a partir destes estudos, se existem variações nos eventos moleculares no interior das vias de reparação devido à causa distinta no bloco de replicação é ainda contudo estar determinado.

Aqui, descrevemos um sistema que permite que um bloco de nucleoproteína a ser criada em um local específico do cromossoma utilizando um repressor Sistema Operador Fluorescente (FROS). Nós utilizamos uma cepa de E. coli, que teve uma matriz de 240 locais tetO incorporados no cromossoma ^9. Cada local tetO dentro da matriz tem uma sequência aleatória de 10 pb flanqueando-o a aumentar a estabilidade do conjunto, impedindo que a recombinação mediada por RecA-dentro da matriz. Esta matriz, e variações do mesmo, foram originalmente usado para entender E. coli dinâmica cromossómicas ^10,11 mas foram depois adaptadas para PreveNT replicação in vivo ^12. A matriz foi encontrado para ser mantida de forma estável e para bloquear perto de 100% de garfos de replicação quando ligado por TetR ^10,12. A utilização da matriz de lacO semelhante in vitro descobriu tão poucos como 22 locais foram suficientes para bloquear 90% da replicação, embora esta gama mais curto foi menos eficaz in vivo ^13. Para se adaptar a matriz para criar um bloqueio nucleoproteína, a proteína repressora deve ser altamente overproduced em condições otimizadas, onde então se liga à matriz para criar um obstáculo. A formação do bloqueio, e a sua subsequente libertação, pode ser controlada através da utilização de microscopia de fluorescência, se uma variante fluorescente etiquetado do repressor Tet é usado. O estado de replicação em cada célula está indicado pelo número de focos visto, em que um único ponto focal significa apenas uma cópia da matriz está presente no interior da célula e múltiplos focos são indicativos de replicação activa. Esta re ativaplicação é activado quando o bloqueio nucleoproteína é revertida pela adição do indutor gratuito que diminui a afinidade de ligação para o local de TetR operador suficientemente para replissoma para prosseguir através da matriz. A proteína repressora é ainda capaz de se ligar ao ADN com uma afinidade suficientemente alta que os agora múltiplas cópias da matriz pode ser visualizado.

Detalhes mais intrincados dos eventos no bloqueio nucleoproteína pode ser descoberto usando eletroforese em gel neutro neutro bidimensional agarose e hibridação Southern ^14-16. Estas técnicas permitem a análise das estruturas de ADN através da população. Os intermediários de replicação que são formados durante o evento, e potencialmente permanecer não reparado, pode ser visualizada. Através da variação da enzima de restrição e da sonda utilizada, os intermediários podem ser visualizados não só na região da matriz, mas também a montante da matriz, quando o garfo de replicação regride ^17,18. oregressão tenham ocorrido depois da dissociação replisome; os fios de condução e de retardamento nascentes separar a partir das cadeias molde e emparelham com uns aos outros como os cordões de modelo simultaneamente re-recozimento que resulta em uma estrutura de ADN de quatro vias (uma junção Holliday).

Utilizando este sistema, foi demonstrado que o garfo de replicação não é estável quando se encontra presente ¹⁸ bloco. Além disso, os derivados de componentes sensíveis à temperatura réplisome pode ser utilizada para impedir a recarga do garfo de replicação, uma vez que entrou em colapso. Uma vez que um bloco é estabelecida, a tensão pode ser deslocada para uma temperatura não permissiva para assegurar uma desactivação síncrona do replissoma e uma prevenção controlada de recarga. Esta desativação induzida pela temperatura garante todos os garfos dentro da população entraram em colapso em um determinado momento e permite a avaliação do que acontece quando o replisome entra em colapso, como o DNA é processado, eo que é necessário para reiniciar o processo de replicação do ADN.

Uma vantagem do sistema descrito aqui é que o bloco de nucleoproteína é totalmente reversível; portanto, a capacidade das células para se recuperar a partir do bloco nucleoproteína é capaz de ser seguido. A adição de anidrotetraciclina para as células irão aliviar a forte ligação do repressor, permitindo um garfo de replicação para prosseguir através da célula e para o restabelecimento da viabilidade. O relevo do bloqueio pode ser visualizada por electroforese em gel de agarose bidimensional neutro neutro depois de 5 min, e por microscopia dentro de 10 min. Além disso, a análise de viabilidade pode revelar a capacidade da estirpe para se recuperar a partir do bloqueio da replicação e continuam a proliferar.

Ao alterar o fundo genético das estirpes utilizadas no procedimento experimental descrito aqui, as vias de reparação para este tipo de bloqueio pode ser elucidado.

Protocolo

1. Bloqueio de replicação com FROS

1. Induzindo a replicação de bloqueio
   1. Dilui-se uma cultura durante a noite fresca de uma E. coli estirpe transportando uma matriz tetO e pKM1 ¹⁸ a OD _600nm = 0,01 em um meio complexo diluído (0,1% de triptona, 0,05% de extracto de levedura, 0,1% de NaCl, 0,17 M _de KH ₂ PO _4, 0,72 MK ₂ HPO _4), com antibióticos conforme requerido para selecção.
      Nota: Não adicione tetraciclina para a seleção, uma vez que não é compatível com este sistema. Completar o volume de cultura equivalente a 10 ml por amostra necessário. Por exemplo, o volume de cultura para o desenho experimental na Figura 1 é de 60 ml.
   2. Crescer a 30 ° C com agitação até _{DO600 nm} = 0,05-0,1. Retirar uma amostra de 10 ml para servir como controlo não induzido e adiciona-se 0,1% de arabinose a restante cultura para induzir a produção de TetR-YFP de pKM1. Continuar a crescer tanto a não induzido e induzidoculturas. Depois de 1 hora, para verificar a presença de um único ponto focal dentro de cada célula da cultura induzida usando microscopia de fluorescência (ver secção 2).
   3. Se as células induzidas são confirmadas bloqueado (mais de 70% das células têm um único foco), registrar a _600nm OD e tirar uma amostra de 7,5 ml para análise por gel 2-D (ver secção 3). Tome uma amostra equivalente a partir da cultura de controlo não induzido.
2. Liberando a replicação de bloqueio
   1. Para libertar o bloco para a replicação, adiciona-se 100 ng mL ^-1 de anidrotetraciclina o indutor gratuito (NA) a uma amostra das células bloqueadas 10 ml. Continuar a crescer a 30 ° C durante 10 minutos e recolher amostras de densidade celular (1 ml), A análise por microscopia (10 ul) e geles de agarose a 2-dimensionais neutro-neutras (7,5 mL).
3. Induzindo Colapso da replissoma
   1. Se as células contêm um alelo sensível à temperatura, tais como TS dnaB ou TS dnaC que requer deactivação, mover o frasco contendo as células bloqueadas a 42 ° C. Retirar amostras para análises em pontos de tempo necessário (por exemplo, 1 hora, após incubação). Depois as células foram incubadas a 42 ° C durante 1 h, deslocar as células a 30 ° C durante 10 minutos (ver Figura 1).
      Nota: As células podem ser deslocada para 30 ° C para análise de reinicialização.

Figura 1:. Overview of the Block and Release Procedimento Experimental FROS replicação E. estirpes de E. coli que transportam a matriz tetO são cultivadas a 30 ° C. Quando as células atingem uma OD _600nm de 0,05 acima, a produção de TetR-YFP é induzida com arabinose (ara; 0,1%). Continuar a crescer uma subpopulação de células não induzidas para actuar como controlos a 30 ° C. Uma amostra das células induzidas é analisada através de microscopia de fluorescência após 1-2 horas (ver 2.1). Se a replicação éconfirmou a ser bloqueado, são tomadas amostras para análise em gel 2-D indicada pelos tubos de ensaio (ver 3.1) e para testes de viabilidade (opcional). O bloqueio de replicação pode ser removido com anidrotetraciclina (AT; 0,1 ug / ml) e analisadas células 10 minutos mais tarde. Se as células portadores de um alelo sensível à temperatura (por exemplo, dnaB ts), isso pode ser inactivado por deslocar as células bloqueadas a 42 ° C para análise apropriada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Microscopia por fluorescência

1. Prepara-se uma almofada de agarose por pipetagem de 500 ul de agarose fundida (1% em água) sobre uma lâmina de microscópio; sobrepor a lamela imediatamente antes das solidifica agarose. Armazenar as lâminas (s) em tecidos molhados, a 4 ° C até ser necessário.
2. Quando a agarose foi solidificada, retirar a lamela do bloco de agarose e pipeta 10 ul de bacterianacultura para o centro do teclado para impedir o movimento de células durante a visualização. Uma vez que a amostra foi seca (aproximadamente 5 minutos), substitua a lamela. Coloque uma gota de óleo de imersão para a lamela e colocar a corrediça sob ótica.
3. Visualize as células usando Fase Microscopia de 100x.
   1. Na caixa de diálogo Adquirir dentro do software de imagem, definir o tempo de exposição a 100 ms. Capturar a imagem selecionando Adquirir. Não mova o palco. Na caixa de diálogo Adquirir, selecione YFP como a iluminação para o Shutter externa relacionada com a Câmara. Defina o tempo exporsure a 1.000 ms. Desligue a luz palco. Capturar a imagem de fluorescência, selecionando Adquirir.
      Nota: O tempo pode variar de acordo com fonte de luz, microscópio e câmera utilizada.
   2. Para sobrepor a fase e imagens fluorescentes, selecione Cor Combine a partir do menu Display. Na caixa de diálogo Cor Combine, selecione a imagem YFP como o componente verde e a imagem de fase como o blue componente. Clique na cor combinar. Determinar se a população tinha replicação bloqueada com sucesso por estabelecer se a maioria das células têm um foco por célula.
      Nota: comparação com uma amostra de controlo sem a adição de arabinose é útil para identificar visualmente a diferença na produção de EYFP.

3. Extração de DNA / agarose Plugs

1. Adicionar azeto de sódio (concentração final de 0,1%) para as amostras de cultura de 7,5 ml a partir de passos 1.1.3 e 1.2.1. Incubar em gelo durante pelo menos 5 min.
   Nota: A azida de sódio é extremamente tóxico. Consulte a Ficha de Segurança antes de iniciar o trabalho e não lidar com isso até que todas as precauções de segurança tenham sido lidas e compreendidas.
2. Centrifugar as células 5000 xg durante 10 min para sedimentar as células. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de tampão Pett IV (PIV) (10 mM de Tris: HCl (pH 8,0), NaCl 1 M). Microcentrífuga (13, 000 xg durante 2 min) para sedimentar as células. diScard o sobrenadante. Neste estágio, o processo os peletes ainda mais ou armazenar a -20 ° C.
3. Ressuspender as células com a densidade celular mais baixo em 50 ul de PIV e colocar a 50 ° C. Para todas as outras amostras, ajustar os volumes de PIV assim a densidade celular final é a mesma em cada um dos tubos (por exemplo, amostra 1 (OD _{600 nm} = 0,128) ressuspenso em 50 ul; Amostra 2 (OD _{600 nm} = 0,138) ressuspenso em 54 ul).
   1. Adicionar um volume igual de solução recém-preparada de agarose a 0,8% em PIV (concentração final de 0,4%;. Por exemplo, uma amostra de 50 ul, 54 ul de amostra 2). Certifique-se de que as amostras, de agarose e PIV são acima de 50 ° C para impedir a solidificação.
4. Tratar uma lâmina de microscópio com 40 mL de uma solução de vidro repelente de água ou silicone apropriado. Esfregue o slide com um lenço de papel até que esteja seco.
   Nota: Isto pode ser feito com antecedência e as lâminas tratadas armazenado a longo prazo à temperatura ambiente.
5. Coloque 20 gotas ul de tEle suspensão de células / agarose no slide para produzir plugs que são hemisférica.
   Nota: A primeira amostra (ressuspenso em 50 pi PIV) irá produzir 5 fichas em um slide.
6. Quando os tampões de ter solidificado, deslizar com suavidade em um tubo de microcentrífuga e adicionar 1 ml de tampão de lise celular (10 mM de Tris-HCl [pH 8], 1 M de NaCl, 100 ácido etilenodiaminotetracético mM (EDTA), 0,2% de desoxicolato de sódio, 0,5% sal de N-lauroilsarcosina de sódio (sarcosil), 100 ug ml de lisozima ^{- 1,} 50 ng mL ^{- 1} de RNase A). Incubar a 37 ° C durante 2 h.
7. Remover o tampão de lise de células e adicionar Sarcosil / proteinase K (ESP) solução de 1 ml de EDTA / (0,5 M de EDTA, sal de sódio a 1% de N-lauroilsarcosina (Sarcosil), 1 mg mL ^{- 1} de proteinase K). Incubar a 50 ° C durante a noite ou até que as fichas são transparentes. Se uma segunda incubação durante a noite se necessário, substituir a solução com tampão de ESP fresco depois de aproximadamente 18 horas.
8. Remova oESP tampão e lava-se os tampões de 5 vezes com 12 ml de Tris-EDTA (TE) de tampão (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 8,0), permitindo um equilíbrio de 30 min com cada lavagem. Armazenar a 4 ° C em 1 ml de tampão TE.

4. Neutral neutro 2-Dimensional eletroforese em gel

1. Transferir uma ficha de agarose do passo 3.8 para um tubo de microcentrífuga fresco e adicionar 150 ul de tampão de enzima de restrição (1x concentração). Adicionar 25-100 unidades de enzima de restrição (por exemplo, 60 unidades de EcoRV; (ver Figura 3A)). Digerir a 37 ° C durante 6-8 h.
2. A 4 ° C, verter um gel de agarose a 0,4% (300 ml) em 1x Tris / borato / EDTA (TBE) para um tabuleiro de gel de cerca de 25 x 25 cm. Inserir um pente para poços de fazer aproximadamente a mesma largura que o diâmetro do bujão. Quando o gel é fixado, remover o pente e mover o gel até à temperatura ambiente.
3. Deslize um dos tampões de agarose digerida em um poço, posicionar a lâmina plana do encaixe de encontro ao lado do poço onde tADN que vai entrar no gel. Inserir um único plug da mesma maneira em cada segundo poço.
4. Pipetar 0,4% de agarose fundida nas cavidades para selar as fichas em posição.
5. Carga escada de DNA de 1 kb num poço vazio, mais uma vez deixando um intervalo entre a escada e amostras, e executar o gel durante a noite (16 horas, 55 V) em TBE 1x, à temperatura ambiente.
6. Corar o gel num banho de água contendo brometo de etídio (0,3 ug ^mL-1) durante 20 min.
   Nota: O brometo de etídio é considerado um agente mutagénico potente e uma toxina. Consulte a Ficha de Segurança antes de iniciar o trabalho e não lidar com isso até que todas as precauções de segurança tenham sido lidas e compreendidas.
7. Visualizar o DNA com um transiluminador de UV de onda longa e cortar cada pista com um fragmento linear, mesmo cortado, minimizando a inclusão de excesso de agarose em ambos os lados da pista.
   Nota: Por exemplo, se o fragmento de interesse é de 5,5 kb, cortado um fragmento de 7,5 centímetros para incluir os fragmentos de ADN a partir de 5 kb a approximately 12 kb (ver Figura 3A).
8. Coloque a pista de gel excisado num tabuleiro de gel a 90 ° em direcção da migração de DNA.
   Nota: Duas fileiras de 3 fragmentos de gel pode caber em um tabuleiro de gel 25 x 25 ² cm. A primeira linha de pistas de gel está na parte superior do tabuleiro, a segunda fileira de 12,5 cm.
9. Preparar 300 ml de agarose para o segundo gel dimensão (0,9% em 1 x TBE com 0,3? G ml ^{-1 de} brometo ^de etídio). Quando a agarose é arrefecida a 50 ° C, pipetar a agarose fundida em torno das fatias de gel para solidificar a sua posição. Verta a agarose restantes na bandeja a uma profundidade que é pelo menos o nível com as fatias de gel.
10. Uma vez que o gel é solidificado, electroforese a 4 ° C em TBE 1x contendo 0,3 ug ^mL1 brometo de etidio a 220 V até que o ADN tenha migrado cerca de 10 cm.
    Nota: 4 horas é suficiente para um fragmento de 5,5 kb, mas um fragmento mais pequeno será necessário menos tempo.
11. Extirpar os blocos onde o DNA genómico está presente ucantar a borda de uma régua de metal, incluindo o gel acima, para incluir o ADN que não é visível (ver a Figura 3C).

5. Hibridação Southern

1. Preparação de Soluções
   1. Preparar tampão despurinação (solução 0,125 M de HCl).
      Nota: Este tampão pode ser reutilizado e que é estável à temperatura ambiente durante até um mês.
   2. Preparar tampão de desnaturação (NaCl a 1,5 M, NaOH a 0,5 M).
      Nota: tampão de desnaturação pode ser reutilizada uma vez e é estável até 3 meses à temperatura ambiente.
   3. Preparar tampão de neutralização (NaCl 1,5 M, Tris 0,5 M). Ajustar a pH 7,5 com HCl.
      Nota: tampão de neutralização pode ser reutilizada uma vez e é estável até 3 meses à temperatura ambiente.
   4. Prepare 10x Solução salina de citrato de sódio (SSC) tampão (citrato 0,15 M Tri-sódio, 1,5 M de NaCl, pH é 7-8), para utilização em passos 5.2.4 e 5.2.6. A partir deste tampão, faça um estoque SSC 2x (para uso no passo 5.2.9).
      Nota: 10x SSC e 2 x SSC umre estável à temperatura ambiente durante 3 meses.
   5. Preparar tampão ¹⁹ de modificação Church e Gilbert hibridação (tampão fosfato 0,5 M [pH 7,2], 7% (w / v) de sulfato de dodecilo de sódio (SDS), EDTA 10 mM). Deixar a 65 ° C para dissolver completamente antes de usar.
2. Transferir
   1. Lavar os blocos de gel excisados ​​em solução depurinação durante 10 min à temperatura ambiente num agitador rotativo ou agitador orbital. Mantenha a velocidade de agitação baixa para evitar danificar os blocos de agarose.
   2. Lavar os blocos de gel brevemente com água destilada e depois com tampão de desnaturação durante 30 min. Lavar novamente brevemente em água destilada e, em seguida, incubar os blocos de gel em tampão de neutralização, durante 30 min com agitação suave à temperatura ambiente.
   3. Cortar uma membrana de nylon para a dimensão exacta do gel (s). Corte um nick no canto superior direito para ajudar a orientar a membrana em etapas futuras.
      Nota: Dois blocos de gel (6 amostras) pode ser visualizado em uma membrana.
   4. Pour suficiente 10x SSC em uma de trAy de modo que não vai secar durante a noite. Criar uma plataforma de cerca de 5 cm acima do nível do tampão. Saturar 3 folhas de 3mm de papel para cromatografia com 10x SSC e coloque sobre a plataforma. Cortar o papel de cromatografia de modo que é suficientemente longo para ser imersa em tampão em ambas as extremidades e de largura suficiente para encaixar o gel na membrana.
   5. Colocar o gel (s) na parte superior do papel cromatográfico saturado. Enquadrar o gel com película de plástico para evitar que o tampão de by-passar o gel durante a transferência. Cuidadosamente colocar a membrana de corte no topo do gel (s). Retirar as bolhas de ar entre a membrana e o gel por laminagem uma garrafa ou pipeta serológica suavemente através da membrana.
   6. Corte três folhas de papel 3MM cromatograf ia com o mesmo tamanho como a membrana. Saturar as folhas de papel de cromatografia com 10x SSC e colocar na parte superior da membrana. Remova as bolhas de ar que se formaram.
   7. Pilha toalhas de papel, pelo menos, 5 cm de altura em cima do papel mata-borrão seguido por um suporte sólido (apropeso ximate de 1 kg para uma membrana de 23 x 16 cm). Permitir que a transferência prosseguir durante a noite.
   8. Expor a membrana (ADN lado para cima) a 1200 J / ^m2 de UV para reticular o ADN à membrana. Não enxaguar antes desta etapa.
   9. Lavar a membrana completamente em SSC 2x para evitar elevado ruído de fundo nas imagens blot. Use a mancha imediatamente para hibridação (ver 5.3) ou secá-lo à temperatura ambiente, embrulhe em filme plástico e armazenar a 4 ° C.
3. hibridização
   1. Pré-aqueça o forno de hibridação e os frascos a 55 ° C.
   2. Adicionar 100? G ml ^-1 de albumina de soro bovino (BSA) e 10? G ml ^-1 de ADN não específico (por exemplo, ADN de esperma de salmão) ao tampão de hibridação pré-aquecida.
   3. Para permitir uma cobertura uniforme do tampão de hibridação, quando a membrana é enrolado, coloque a mancha sobre um quadrado de tamanho similar de malha de nylon com o lado ligado ao ADN da membrana virada para cima. Role a blot ao longo de sua borda longa. Deslizara mancha / mesh dentro de uma garrafa de hibridização. Adicionar uma quantidade apropriada de tampão de hibridação pré-aquecida para desenrolar o blot (por exemplo 30 ml para uma membrana de 23 x 16 ^cm2).
   4. Incubar em um forno pré-aquecido, girando os frascos, durante 1 h.
   5. Preparar a sonda através da mistura de 50 ng de produto de PCR purificado homóloga à região de interesse, 150 ng de iniciadores de hexâmero aleatório, para tamponar o fragmento de Klenow e H ₂ O para fazer um volume de 13 ul. Ferver durante 3 min, em seguida, colocar imediatamente em gelo. Adicionar 1 ml de 1 mM de dCTP / dGTP / dTTP mistura, 1 ul de fragmento de Klenow (5 U) e 50 uCi de desoxiadenosina-trifosfato marcado radioactivamente 5'no fosfato alfa (α ³² P-dATP).
   6. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Adicionar 1 ml de 1 dNTP mM misturar e 1 ml de fragmento de Klenow. Incubar 20 min a RT.
   7. Ferva sonda para 5 min e adicionar imediatamente para tubos de hibridização. Hibridar durante a noite a 55 ° C, com rotação.
   8. Decantar o prOBE de membrana.
      Nota: A sonda é capaz de ser reutilizada uma vez.
   9. Lavar a membrana rapidamente em pré-aquecido, tampão de lavagem de baixo rigor (2 x SSC, 0,1% (w / v) de SDS). Adicionar tampão fresco de baixo rigor na lavagem e incubar durante 5 min a 55 ° C com rotação. Repetir.
   10. Lavar duas vezes em tampão de lavagem de rigor médio (1x SSC, 0,1% (w / v) de SDS) durante 10 min a 55 ° C com rotação.
   11. Lavar duas vezes em tampão de lavagem de severidade elevada (0,1 x SSC, 0,1% (w / v) de SDS) durante 5 min a 55 ° C com rotação.
   12. Remover a membrana e DAB com tecido para remover o excesso de líquido. Embrulhe em filme plástico assegurando que não há umidade remanescente sobre o filme plástico e coloque na gaveta exposição com uma tela de armazenamento de fósforo pré-inibida. Fechar a cassete e expor durante pelo menos 2 horas antes de visualização usando um gerador de imagens de fósforo.

Resultados

O FROS é um bloco de nucleoproteína induzível, específica do local que permite intermediários de replicação para ser visualizado em células vivas ^12,18. Um projeto experimental geral para células de amostragem é ilustrada na Figura 1. O momento da amostragem e variações no fundo genético tornar este um sistema versátil para estudar o reparo de um tal bloco. O esquema ilustra como mutantes sensíveis à temperatura, tais como TS e TS dnaB...

Discussão

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded^20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	Sigma-Aldrich	16922	Growth media component
Sodium Chloride	VWR	27810.364	Growth media component
Yeast extract	Sigma-Aldrich	92144	Growth media component
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Growth media component; Potassium buffer component
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786	Growth media component; Potassium buffer component
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	For induction of TetR-YFP production
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919	Release of replication bloackage
Axioskop 2 Fluorescence microscope	Zeiss	452310	Visualization of cells
eYFP filter set	Chroma Technology	41028	Visualization of YFP
CCD camera	Hamamatsu	Orca-AG	Visualization of cells
MetaMorph  Software (Molecular Devices)	SDR Scientific	31282	Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript
Agarose	Bioline	BIO-41025	For agarose plugs and gel electrophoresis
Original Glass Water Repellent (Rain-X)	Autobarn	DIO1470	For agarose plug manufacture
TRIS	VWR	VWRC103157P	TE, TBE buffer component
Ethylene diaminetetraacetic acid	Ajax Finechem	AJA180	0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Bacteriostatic agent
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148	TE buffer component
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	Cell lysis buffer component
N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)	Sigma-Aldrich	L5125	Cell lysis and ESP buffer component
Rnase A	Sigma-Aldrich	R6513	Cell lysis buffer component
Lysozyme	Amresco	6300	Cell lysis buffer component
Proteinase K	Amresco	AM0706	ESP buffer component
Sub-Cell Model 192 Cell	BioRad	1704507	Electrophoresis system
UV transilluminator 2000	BioRad	1708110	Visualization of DNA
Ethidium Bromide	BioRad	1610433	Visualization of DNA
Boric acid	VWR	PROL20185.360	TBE component
Hybond-XL nylon memrbane	Amersham	RPN203S	Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used
3MM Whatman chromatography paper	GE Healthcare Life Sciences	3030690	Southern blotting
HL-2000 Hybrilinker	UVP	95-0031-01/02	Crosslinking of DNA and hybridization
Deoxyribonucleic acid from salmon sperm	Sigma-Aldrich	31149	Hybridization buffer component
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	Denaturation buffer component
Trisodium citrate dihydrate	VWR	PROL27833.363	Transfer buffer
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Amresco	227	Wash buffer component
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	Hybridization buffer component
Random Hexamer Primers	Bioline	BIO-38028
Klenow fragment	New England BioLabs	M0212L
dNTP Set	Bioline	BIO-39025
Adenosine 5’-triphosphate-32P-ATP	PerkinElmer	BLU502A
Storage Phosphor Screen	GE Healthcare Life Sciences	GEHE28-9564-76	BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen
Typhoon FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28-9558-09	Visualization of blot
Hybridization bottle	UVP	07-0194-02	35 mm x 300 mm