Técnicas empíricas, metagenômicas e computacionais iluminam os mecanismos pelos quais os fungicidas comprometem a saúde das abelhas

Resumo

Consórcios microbianos dentro bumble colmeias enriquecem e preservar o pólen para larvas de abelha. Usando o sequenciamento de próxima geração, juntamente com o laboratório e experiências no terreno, este manuscrito descreve protocolos usados para testar a hipótese de que resíduos do fungicida alteram o pólen microbiome e demografia de colônia, finalmente levando à colônia perda.

Resumo

Os cultivadores costumam usam sprays de fungicida durante a flor para proteger as culturas contra a doença, que expõe as abelhas a resíduos do fungicida. Embora considerado "abelha-cofre", há evidência de montagem que resíduos do fungicida no pólen são associados com declínios de abelha (para espécies de tanto mel e bumble bee). Enquanto os mecanismos permanecem relativamente desconhecidos, pesquisadores têm especulado que a simbiose de abelha-micróbio está envolvidos. Micróbios desempenham um papel fundamental na preservação e/ou processamento de pólen, que serve como nutrição para abelhas larvas. Alterando a comunidade microbiana, é provável que os fungicidas interrompem esses serviços de micróbio-mediada e, assim, comprometem a saúde das abelhas. Este manuscrito descreve os protocolos usados para investigar o mecanismo (s) indireto pelo qual fungicidas podem estar causando declínio da colônia. Experimentos de gaiola, expondo as abelhas para flores tratada com fungicida já forneceram a primeira evidência que fungicidas causam perdas de colônias profunda em uma abelha nativa (Bombus impatiens). Utilizando doses de campo relevantes de fungicidas, uma série de experimentos foram desenvolvidos para fornecer uma descrição mais fina da dinâmica da comunidade microbiana de pólen fungicida-expostos. Mudanças na composição estrutural de assemblages fúngicas e bacterianas dentro o pólen microbiome são investigadas pela próxima geração sequenciamento e análise metagenomic. Experimentos desenvolvidos neste documento foram projetados para fornecer uma compreensão mecanicista dos como fungicidas afetam a microbiome de pólen-disposições. Em última análise, estas conclusões devem lançar luz sobre a via indirecta, através dos quais fungicidas podem estar causando declínios de colônia.

Introdução

Gerenciado e espécie de abelha selvagem está experimentando o declínio generalizado, com implicações importantes para ambos os sistemas naturais e agrícolas¹. Apesar de esforços concertados para compreender as causas deste problema, os fatores que levam mel abelha declínios ainda não estão bem compreendidas^2,3,4. Para certas espécies de abelhas selvagens, nativas, a situação tornou-se terríveis^5,6. Se as populações de abelhas não podem ser sustentadas quando eles se cruzam com a agricultura industrial, as suas populações continuará a cair e as culturas que exigem polinizadores (35% da produção mundial⁷) irão perdurar reduziram das colheitas.

Enquanto muitos potenciais fatores tais como a exposição de pesticidas, doenças e habitat perda^1,4,8,9,10 têm sido implicados em declínio de abelha do mel, relativamente pouco é conhecido sobre o efeito interativo desses estressores na saúde de abelhas nativas, dentro ou perto de sistemas agrícolas. Muitos esforços de pesquisa atual continuam a concentrar-se em inseticidas, (por exemplo,^11,de neonicotinoides¹²), embora a pesquisa última indica que fungicidas podem também desempenhar um papel em declínio de abelha por prejudicando a formação da memória, recepção olfativa¹³, ninho reconhecimento¹⁴, atividade enzimática e funções metabólicas^15,16,17. Globalmente, fungicidas continuam a ser aplicados nas culturas de floração durante a flor. Estudos recentes têm documentado que as abelhas comumente trazem resíduos do fungicida volta para a colmeia¹⁸, de fato, estudos têm demonstrado uma grande proporção de colmeias testadas contidas fungicida resíduos^19,20. Continuação dos trabalhos revelou aquele resíduo de fungicida é associado com altas taxas de mel de abelha mortalidade larval^21,22,23 e a presença de "sepultado pólen" dentro de colônias, que embora não-tóxico, é desprovida de atividade microbiana e é nutricionalmente comprometido²⁴. Apesar do fato de que fungicidas tem sido consideradas "abelha-cofre", agora há evidência que a exposição ao fungicida sozinha pode causar perdas severas de colônia em uma espécie de abelha nativa bumble, Bombus impatiens²⁵.

Para estabelecer o nexo de causalidade entre a exposição de fungicida e colônia mortalidade, o modus operandi destes produtos químicos precisa ser determinado. Como evidenciado em solos²⁶e sedimentos²⁷ambientes aquáticos²⁸, alvejando os fungos, os fungicidas mais prováveis alteram abundância de fungos e diversidade dentro de pólen-disposições, invocando, assim, uma grande comunidade mudar isso fortemente pode favorecer as bactérias. Sem fungos competidores ou antagonistas, certas bactérias patogênicas podem proliferar relativamente desmarcada, facilitando a deterioração de pólen-disposições. Passado a pesquisa demonstrou que os microorganismos, particularmente leveduras e fungos filamentosos, servir como simbiontes nutricionais para abelhas^29,30,31, proteger contra parasitas e patógenos^{32 ,33}e fornecer a preservação a longo prazo das lojas de pólen. Fungicidas, portanto, podem indiretamente prejudicar as abelhas imaturas por perturbar a comunidade microbiana que é necessário para fornecer estes serviços e/ou pelo aumento da suscetibilidade a de parasitas e patógenos oportunistas¹². Com o aumento da demanda na produção de alimentos, culturas em todo o mundo estão sendo pulverizadas cada ano com fungicidas durante flor, ressaltando a necessidade de compreender a magnitude de tais efeitos fungicida-induzida.

Até à data, as lacunas de conhecimento primário relacionados com abelhas nativas microbiana ecologia pode ser representada pelas seguintes perguntas: em que medida fungicida muda a comunidade microbiana dentro de pólen de abelha-disposições? Quais são os impactos a jusante de consumir pólen com uma comunidade microbiana profundamente alterada? De acordo com estas perguntas ecologicamente relevantes, experimentos foram desenvolvidos com os principais objetivos de revelar 1) desse resíduo de fungicida sozinho pode causar declínio grave colônia em uma espécie de abelha nativa; 2) o grau a que as comunidades microbianas em pólen-disposições são alteradas por fungicidas e 3) como a saúde das abelhas é afetado por uma comunidade microbiana severamente alterada. Os objetivos experimentais foram definidos para abordar as questões acima, usando uma combinação de experimentos baseados em laboratório e campo. Usando metagenomic de estado-da-arte e técnicas moleculares ao lado dos métodos tradicionais de observações de campo, esta pesquisa tem como objetivo reunir os potenciais efeitos dos fungicidas sobre a saúde das abelhas.

O primeiro objectivo deste estudo é demonstrar que a exposição de fungicida sozinho pode causar perdas de colônias significativas entre as espécies de abelhas nativas. Um estudo envolvendo gaiolas de campo grande foi usado para investigar os efeitos da exposição de fungicida sobre o crescimento da colônia de Bombus impatiens, uma abelha nativa onipresente, abundante nos Estados Unidos (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Foi hipotetisado que urticária tratada com fungicida apresentaria menor aptidão e demografia atípica comparado a urticária não-expostos. Dados obtidos neste experimento com suporte a esta hipótese, demonstrando que os resíduos do fungicida dentro de pólen podem ser a única causa de perdas de colônias profunda em um nativo bumble bee espécie²⁵. O segundo objectivo deste estudo é investigar a resposta do pólen microbiome para exposição de fungicida. A hipótese é de que a composição da comunidade de micróbios dentro de pólen-disposições expostos aos fungicidas será diferente do pólen não tratada. Enquanto a diversidade e abundância de fungos são esperados para diminuir significativamente, bactérias e/ou uma única espécie fúngica dominante provavelmente crescerá desmarcada na ausência de outros fungos concorrentes. Através de uma série de ensaios in vivo , estas mudanças na composição da comunidade microbiana serão analisadas usando metagenômica.

Protocolo

1. examinar o efeito de fungicida de exposição na Bumble Bee Colony sucesso usando gaiola experimentos de campo

1. Set até dez gaiolas de malha em um campo plantaram com aveia. Cavar uma trincheira ao redor de cada gaiola e todas as quatro bordas da gaiola malha cavar o solo para garantir que as abelhas não podem escapar. Estocar as gaiolas com plantas em vasos, que são conhecidas por ser atrativo para as abelhas (por exemplo, trigo mourisco, borragem, alyssum, cosmos e girassóis) ( Figura 2).
2. Complementar as gaiolas com uma única bandeja (36 cm x 42 cm) no-flor trevo. Cluster de recursos florais dentro de um canto da gaiola, ocupando um espaço de aproximadamente 2,5 m x 1 m. vegetar a área restante da gaiola pelas aveias.
3. Atribuir aleatoriamente a abelha colônias e cada trabalho que contém uma única rainha, um tratamento (fungicida presente/ausente, N = 5 colónias por tratamento, totais 10 colônias), em seguida, colocá-los dentro de uma gaiola de campo (N = 1/gaiola) por 29 dias (23 de junho -21 de julho de 2014).
4. Orientar as caixas de colônia tal que a colônia ' aberturas s apontam para o sul para fornecer as abelhas com óptimas condições de navegação. Subsidiar as colônias com bexigas de água de açúcar, colocadas dentro das caixas de colmeia para complementar a disponibilidade de néctar.
5. Aplicar fungicida chlorothalonil-baseado em um nível de campo relevantes (20 g/L) para as gaiolas de tratamento cinco fungicida plantas, usar uma mão realizada pulverizador de pesticidas, duas vezes durante o estudo (dia 0 e 13). Revestir as flores uniformemente tal que nenhum líquido adicional adere às superfícies florais ( Figura 3).
6. Na conclusão do estudo de gaiola de campo, remover as colônias de b. impatiens das jaulas à mão, cool as colmeias, colocando no congelador -20 ° C por 20 min.
7. Remover abelhas usando Pinças esterilizadas e registrar o número de larvas, pupas, fêmeas adultas (eu. e. forrageiras) e os machos adultos. Usando uma balança analítica gravar o peso seco da rainha mãe, larvas, pupas, fêmeas adultas (ou seja, forrageiras) e machos adultos.

2. Examinar os efeitos da exposição fungicida nas comunidades microbianas no pólen-disposições do Bumble Bee ninhos usando laboratório baseado os ensaios In Vivo

1. Pulverize adquirido comercialmente pólen de um pó fino, usando um padrão moinho de esfera do laboratório. Esterilize o pólen em pó por imersão em etanol a 70%, permitindo que evapora-se durante a noite sob a luz UV. Verificar a esterilidade do pólen por chapeamento ~0.5 mg em meios de ágar de uso geral.
   1. Para o seco, pólen esterilizado, usando pipetas esterilizadas, adicionar dosagem relevantes do campo do fungicida: propiconazol em 14,3%; azoxistrobina em 22,9% para tratamentos (0,74 µ l e 0,65 µ l respectivamente / dia / colmeia). Misture bem, usando varas de madeira esterilizadas.
2. 6 lugar de colmeias experimentais (n = 3 cada para controle e tratamento) em uma bancada de laboratório limpo, higiênico, mantida à temperatura ambiente. Cada dia pesar 4,27 g de pólen ^{34 , 35}, misturado com água estéril (para controle) dentro de uma capa usando técnica asséptica padrão ou fungicidas (para os tratamentos).
   1. Usando os alçapões fornecidos pelo lado da caixa de papelão encerram as colmeias, introduzir o pólen dentro das colmeias. Suplemento das colmeias com solução de açúcar esterilizado a cada semana. Continue alimentando o regime por quatro semanas.
3. Na conclusão do estudo em laboratório, esfriar as colmeias colocando no congelador-20 ° C por 20 min. raspar o pólen-disposições contidas dentro de câmaras ninhadas usando Pinças esterilizadas e espátulas e lugar em tubos de armazenamento estéril. Loja a-80 ° C. contagem e registar o peso dos trabalhadores e rainha mãe no início e no final do experimento (passo 1.7).
4. Kits de isolar DNA da amostra de pólen-provisão usando o isolamento de DNA comercialmente disponível (ver tabela de materiais para obter detalhes).
   1. Adicionar 0,25 g de pólen-provisão para extração de tubos, brevemente vórtice misturar.
   2. Fazer um 200 mg/mL solução de lisozima em água destilada deionizada, suficiente para 50 µ l/amostra. Agitar vigorosamente a solução de forma completamente.
   3. Adicionar 50 µ l da solução de lisozima para os tubos de extração com amostra nele e misture bem várias vezes por inversão. Incube o tubo por 10 min a 37 ° C em banho-maria. Se formou o precipitado, aquecer a solução a 60 ° C até dissolver antes de usar.
   4. Adicionar 70 µ l de solução aquosa de Lise para os tubos de extração, secure horizontalmente sobre uma almofada de vórtice do leito com fita, e tubos de vórtice de 10 min. centrifugar a 10.000 x g, durante 30 s, à temperatura ambiente.
   5. Transferir o sobrenadante para um tubo de coleta limpa 2 mL. Adicionar 250 µ l de solução de precipitação de proteínas e o vórtice para 5 s. Incubar a 4 ° C por 5 min em um banho de gelo.
      Nota: Espere entre µ l 400 a 500 µ l do sobrenadante. Sobrenadante pode ainda conter algumas partículas.
   6. Centrifugar os tubos à temperatura ambiente por 1 min a 10.000 x g e transferir até 600 µ l do sobrenadante para um tubo de coleta limpa 2 mL. Adicionar 200 µ l de solução de remoção do inibidor aquosa, vórtice brevemente e incubar a 4 ° C por 5 min. centrifugar os tubos à temperatura ambiente por 1 min em 10.000 x g. transferir até 750 µ l do sobrenadante num tubo de colheita limpa 2 mL.
   S.
   7. Adicionar 1200 µ l de solução aquosa de vincular ao sobrenadante e vórtice para 5 carregar aproximadamente 675 µ l do sobrenadante para um filtro de rotação e centrifugar 10.000 x g por 1 min à temperatura ambiente. Descartar o fluxo através de.
   8. Repetir 2.4.7. duas vezes.
      Nota: Um total de três cargas para cada amostra processada são necessários.
   9. Adicionar 500 µ l etanol e centrifugar a temperatura ambiente por 30 s a 10.000 g. x descartar o fluxo através de e centrifugar novamente a temperatura ambiente por 1 min em 10.000 x g. colocar girar o filtro em um tubo de coleta limpa 2 mL.
   10. Adicione 100 µ l de eluição buffer para o centro da membrana do filtro. Centrifugar a temperatura ambiente por 30 s a 10.000 g. x descarte o filtro de rotação. Loja coletou DNA entre-20 ° C e -80 ° C
5. uso isolado DNA para sequenciação.
   1. Quantify e normalizar o DNA isolado a 2 ng / µ l por análise fluorométrica. Reações de
      1. preparar em triplicado para cada amostra coletada comparar a quantidade relativa de 28S (planta), analisar sua (fungos) e 16S (bacteriana) componentes de cada amostra de pólen-provisão ³⁶. Certifique-se de que cada reação contém 10 ng de DNA total e 2x de mix de mestre tintura com base assimétrica cianina µ l 2.5 cada de primers para diante e reverso pares 28KJ/28B ³⁷ em planta e ITS1/ITS5.8R de DNA fúngico ³⁸ .
   2. Amplificar DNA usando os seguintes parâmetros: pre-desnaturação de 2 min a 50 ° C, 2 min desnaturação inicial a 95 ° C, 40 ciclos de (15 s a 98 ° C, 15 s a 58 ° C, 60 s a 72 ° C), seguido por uma curva de derretimento.
   3. Preparar um protocolo PCR 2-passo, aninhado usando bibliotecas de sequenciamento de próxima geração como alvo o 16S rRNA região variável V3/V4 e ITS / 5.8s região de espaçador do rRNA.
      1. Adicionar 12,5 µ l de DNA para 5 pmol de cada primer e 2 x mestre mistura. Faça reações separadas para cada região (16S ou ITS; ver tabela 1). Modificar os iniciadores específicos de região como descrito anteriormente ^{39 , 40} para adicionar sequências de nucleotídeos específicas do Sequenciador adaptador saliência para as sequências do gene-específico.
      2. Realizar a amplificação inicial usando os seguintes parâmetros: 3 min desnaturação inicial a 95 ° C, 25 ciclos de (30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, 30 s a 72 ° C), 5 min extensão final a 72 ° C.
      3. Seguinte inicial de amplificação, verifique se o tamanho da biblioteca e a quantidade por mobilidade electrophoretic e limpar usando um 1 x volume sólido fase reversível immgrânulos de obilization para remover primers residuais e os reagentes da reação. Pool de 16S e sua amplicons quantitativamente para criar um pool de amplicons único para cada amostra.
      4. Adicionar adaptadores específicos sequenciador e amostra específicas índices duplas usando os seguintes primers (ver tabela 1). Adicione 2,5 µ l de DNA amplificado para 5 pmol de cada primer e 2 x mestre mistura. Executar a amplificação de biblioteca usando os seguintes parâmetros: 3 min desnaturação inicial a 95 ° C, 8 ciclos de (30 s a 95 ° C, 30 s a 55 ° C, 30 s a 72 ° C), 5 min extensão final a 72 ° C.
   4. Seguir PCR, limpo terminadas bibliotecas usando um volume 1 x dos grânulos de imobilização reversível de fase sólida. Avalie a qualidade e quantidade das bibliotecas terminadas usando mobilidade electrophoretic e fluorometry, respectivamente. Padronizar a bibliotecas de 2 µM e piscina antes da sequenciação.
   5. Executar sequenciamento de nova geração em uma plataforma análoga aos adaptadores adicionado em PCR secundária, com um comprimento adequado para cobrir o amplicon inteira ⁴¹.
6. Sequência de anotação e análise da composição microbiana.
   1. Combinar par-final sequenciamento dados (R1 e R2) em contigs único para bibliotecas tudo sequenciadas. Depois de mesclar arquivos tanto R1 e R2, é produzido um arquivo fasta único para cada uma das bibliotecas.
      Nota: Este passo e os processos descritos abaixo (salvo indicação em contrário) são executados em Mothur versão 1.38.0 ³⁸.
   Cada arquivo fasta para remover bases ambíguas, inesperadas sequências longas e longos homopolímeros de tela
   2. .
      Nota: Os parâmetros para seleção e remoção de sequência são maxambig = 0, maxlength = 600 e maxhomop = 8 para ambos os genes. Remover sequências idênticas, mas manter uma tabela de contingência separadamente para todas as bibliotecas (também conhecido como tabela de contagem em Mothur).
   3. Alinhar sequências originais da biblioteca gene 16S contra a versão do banco de dados SILVA 123 e a biblioteca ITS genética contra o banco de dados se unem seus ⁴².
      Nota: As sequências devem ser anotadas do nível do Reino para o nível de gênero.
      1. Posteriormente, cluster alinhado sequências com o pre.cluster de função usando o diff = 5 e remover quimeras.
   4. Classificar sequências usando o método Wang ⁴³ baseado no UNITE ITS (para gene ITS) arquivos de taxonomia (valor de corte de 80%) e SILVA (para gene 16S).
   5. Carregar no R ⁴⁴ as tabelas de contingência (um por gene) geradas durante o processo de classificação em Mothur. Em cada nível taxonômico, obter abundância relativa por biblioteca para posterior análise das mudanças da comunidade microbiana.
      Nota: Em cada nível taxonômico, mesclam grupos taxonômicos quando abundância relativa é inferior a 2% para todas as repetições experimentais.

Resultados

Estudo de gaiola de campo:

Dados obtidos a partir das experiências de gaiola mostram que as colônias de abelhas bumble tinham uma resposta significativa à exposição de fungicida. As colmeias tratada com fungicida produziram significativamente menos trabalhadores (12,2 ± 3,8, média ± SE) do que as colmeias de controle (43,2 ± 11,2, F_1,9= 6.8, p = 0,03) (Figura 4

Discussão

Investigações sobre os efeitos dos fungicidas na saúde das abelhas permaneceram um aspecto pouco estudado de estratégias de manejo de pragas. Nosso estudo visa colmatar esta lacuna de conhecimento por meio de um conjunto de técnicas complementares que explicitamente isolar os fatores potenciais abelha declínios de condução. O planejamento, lógica e processamento dessas experiências são detalhados abaixo.

É importante garantir que não há abelhas podem escapar da malha das experiê...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Natupol Beehive	Koppert	USRESM1	16 hives
Propiconazole 14.3	Quali-Ppro	60207-90-1	Propiconazole 14.3%
Abound	Syngenta	4033540	Azoxystrobin 22.9%
Chlorothalonil	Syngenta	3452	Fungicide used for trials
Pollen granules	Bee rescued	B004D5650C	3X 16oz bottles, pollen for trials
Bacterial strains for inoculation	Currie Lab
Yeast strains for inoculation	Hittinger lab
Primer pairs	UW Biotech Center
DNA Isolation Kit	Mo Bio	12830-50	Commercial DNA isolation kit
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851	DNA quantification tool
Select Master Mix for CFX	Thermo Fisher	4472952	Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.
Real-Time PCR Detection System	Bio Rad	1855196	Instrument used for PCR amplification
PCR Clean-Up Kit,	Axygen	10159-696	Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes
DNA 1000 Kit	Agilent	5067-1504	Used for sizing and analysis of DNA fragments
MiSeq Sequencer	Illumina		Used for next-generation sequencing
Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)	VWR