preparação e<em&gt; In Vivo</em&gt; O uso de uma sonda baseado em atividades para<em&gt; N</em&gt; Amidase Ácido -acylethanolamine

Resumo

Aqui, nós descrevemos a preparação e utilização de uma sonda com base na actividade (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato de metilo), que permite a detecção e quantificação da forma activa da enzima pró-inflamatória N-amidase ácido -acylethanolamine (NAAA), tanto in vitro como ex vivo.

Resumo

perfis de proteína à base de Actividade (ABPP) é um método para a identificação de uma enzima de interesse em um proteoma do complexo através da utilização de uma sonda que tem como alvo química sítios activos da enzima. Uma etiqueta repórter introduzidos na sonda permite a detecção da enzima marcada por análise em gel de fluorescência, mancha de proteína, microscopia de fluorescência, ou espectrometria de massa de cromatografia de líquido. Aqui, descrevemos a preparação e utilização do ARN14686 composto, uma sonda baseada em atividades de cliques química (CC-ABP) que reconhece seletivamente a enzima N amidase ácido -acylethanolamine (NAAA). NAAA é uma hidrolase cisteína que promove a inflamação desactivando -alfa agonistas endógenos do receptor proliferador de peroxissoma activado (PPAR), tais como palmitoiletanolamida (PEA) e oleoletanolamina (OEA). NAAA é sintetizada como uma proenzima de comprimento completo inactiva, que é activada pelo autoproteolysis no pH ácido do lisossoma. estudos de localização have mostrado que NAAA é predominantemente expresso em macrófagos e outras células derivadas de monócitos, bem como em linfócitos-B. Nós fornecem exemplos de como ARN14686 podem ser usadas para detectar e quantificar NAAA activo ex vivo em tecidos de roedores por mancha de proteína e microscopia de fluorescência.

Introdução

Comumente usado métodos para investigar os padrões de expressão, interações e funções das proteínas, incluindo plataformas de espectrometria de cromatografia de massa de líquido para análise espingarda ^1,2, fermento métodos de dois híbridos ^3,4 e, em ensaios in vitro, são limitados em que eles são incapaz de avaliar a atividade das proteínas no seu estado nativo. profiling proteína baseado em atividades (ABPP) pode ser usado para preencher esta lacuna. Nesta abordagem, pequena molécula sondas capazes de se ligar covalentemente ao sítio activo de uma enzima de interesse conjugado com um grupo repórter que permite a detecção do alvo. Usando clique química (CC), o repórter pode ser integrado na sonda ou podem ser introduzidos após acoplamento alvo ocorreu ^5,6. O último procedimento requer a utilização de sondas que contêm grupos químicos adequados, tais como um alcino ou azida de terminal, que pode ser modificado com uma série de reagentes repórter via reacções bio-ortogonal sucH, tal como o Cu (I) catalisada por Huisgen [3 + 2] cicloadição ^7-9 ou Staudinger ligadura ^10,11.

Recentemente, foi divulgada a ARN14686 composto como o primeiro ABP para o in vitro e in vivo de detecção da hidrolase de cisteína, NAAA ^12. NAAA catalisa a desativação hidrolítica FAEs saturados e monoinsaturados, incluindo oleoletanolamina (OEA) e palmitoiletanolamida (PEA), que são agonistas endógenos do anti-inflamatório receptor nuclear PPAR-alfa ^13-15. NAAA é predominantemente expresso em macrófagos e outras células derivadas de monócitos, bem como em linfócitos-B ^14,16, sugerindo um papel na regulação da resposta imune inata. A enzima é sintetizada no retículo endoplasmático rugoso numa forma inactiva e é activado em compartimentos acídicos da célula através de um mecanismo ¹⁷ autoproteolica. A clivagem autoproteolítica gera uma nova cisteína N-terminal (C131 em ratinhos e ratos, C126 em seres humanos), que é o responsável por nucleófilo FAE hidrólise ^18,19. A inibição farmacológica da actividade NAAA altera o equilíbrio síntese / degradação FAE em favor do aumento dos níveis celulares de FAEs ^16,20,21. Vários derivados β-lactona e β-lactâmicos têm mostrado inibir a actividade de NAAA com elevada potência e selectividade ^16,22-26. Estes inibidores actuam através de S-acilação da cisteína catalítica ^16,27,28.

O ARN14686 composto foi concebido com base na estrutura química do, inibidor β-lactama NAAA-serina derivada sistemicamente activa, ARN726 (N-4 cyclohexylbutyl- - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato de metilo) ^16. O grupo 4-butil-ciclo-hexilo de ARN726 foi substituído com uma cadeia alifática em C9 saturado tendo uma marcação alcino terminal para conjugação subsequente com uma tag de CC repórter azida de rolamento. Nós escolhemos para projetar um ABP em duas etapas para minimally alterar a estrutura do andaime original, mantendo, assim, a afinidade da sonda para NAAA. Além do mais, evitando a introdução de etiquetas volumosos, uma tal sonda poderia ser mais adequado para o tratamento in vivo do que um PAF directa. ARN14686 NAAA inibe com elevada potência (hNAAA _CI50 = 6 nM, rNAAA IC ₅₀ = 13 nM) através da formação de um aducto covalente com a cisteína catalítica da enzima ^12. Experimentos em ratos vivos mostraram que a sonda é seletiva na captura NAAA expressos em pulmões. Ácido ceramidase, outra cisteína-amidase que partilha 33-34% de identidade com NAAA, também foi identificado como um alvo de baixa afinidade ao utilizar concentrações elevadas de sonda (10 uM in vitro, 10 mg / ml por via intravenosa, iv) ^12. Temos também utilizado ARN14686 para estudar a presença de NAAA activo em tecidos de rato a seguir à administração inflamadas de adjuvante completo de Freund (CFA) ^29.

Aqui, descrevemos um protocolo para os preparatina de ARN14686 (Figura 1) e sua aplicação para a investigação de activação NAAA ex vivo. Como exemplo, descreve-se um procedimento experimental para visualizar NAAA nas patas de ratos após a administração CFA. Nesta experiência, as proteínas são extraídas a partir de tecido da pata após a injecção IV da sonda, e o proteoma ABP-marcado é submetido a CC com biotina-azida. amostras biotiniladas são enriquecidas utilizando esferas de estreptavidina, e manchas de proteínas são realizadas. Em outra aplicação, descreve-se a localização de NAAA activo por microscopia de fluorescência em pulmões de ratinho a partir de ratinhos tratados com sonda. Neste caso, o tecido é seccionado e secções são submetidos a CC, por adição de rodamina. Um regime de fluxo de trabalho é ilustrado na Figura 2.

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Protocolo

Cuidado: Todas as reacções de química deve ser levada a cabo numa hotte ventilado e com a utilização de um revestimento do laboratório, luvas, e óculos de protecção. As reacções devem também ser levada a cabo num ambiente de azoto.

declaração ética: Nossos procedimentos que envolvem animais são realizados em conformidade com as normas italianas relativas à protecção dos animais utilizados para fins experimentais e outros científicos (DM 116192), e regulamentos Comunidade Económica Europeia (JO de CE L 358/1 1986/12/18 ).

NOTA: Síntese de [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] acetato de amónio é descrita para as produções de larga escala (50 g de N-Cbz-L-serina), mas pode ser facilmente dimensionado para baixo.

1. Síntese

Nota: Consulte a Figura 1 para o esquema de reação de síntese.

1. Preparação de carbonato de 2-piridilo-undec-10-inilo e undec-10-inilo 2-oxopiridina-1 carboxilato
   1. Em um frasco de 50 ml de fundo redondo, dissolver 350 mg de undec-10-in-1-ol em 3,5 ml de diclorometano seco.
   2. À solução em 1.1.1, adicionar 25 mg de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) e 530 mg de 2-dipyridylcarbonate (DPC). Agita-se a mistura à temperatura ambiente (TA) durante 16 horas.
   3. Adicionar 20 ml de diclorometano.
   4. Transferir a mistura para um funil de separação. Adicionar 15 ml de água, agitá-lo, e permitir que as duas fases para separar.
   5. Abrir a torneira, recolher a fase orgânica (inferior), e, em seguida, fechar a torneira. Adicionar 15 ml de uma solução saturada de _NaHCO3. Agitar a ampola de decantação e deixar as duas fases distintas. Repita este passo mais duas vezes.
   6. Seca-se a camada orgânica com Na ₂ SO _4, filtra-se através de algodão em um balão de fundo redondo (tara em primeiro lugar), e evapora-se até à secura sob pressão reduzida (evaporador rotativo).
   7. Pesa-se o balão e se obter 600 mg de um óleo que é uma mistura de carbonato de 2-piridilo undec-10-inilo e undec-10-inilo 2-oxopiridina 1-carboxilato de etilo em uma razão de 1,7: 1.
      ¹ H RMN (400 MHz, DMSO-d ₆₎ componente principal δ = 8,39 (dd, J = 5,0, 2,0, 1H), 7,98 (td, J = 7,9, 2,0, 1H), 7,40 (ddd, J = 7,2, 4,9, 0,9, 1H), 7,30 (d, J = 8,2, 1H), 4,22 (t, J = 6,6, 2H), 2,73 (t, J = 2,4, 1H), 2,18-2,11 (m, 2H), 1,76 - 1,62 (m, 2H), 1,50 - 1,23 (m, 12H).
      ¹ H RMN (400 MHz, DMSO-d ₆₎ componente menor δ = 7,74 (dd, J = 7,2, 1,9, 1H), 7,47 (dd, J = 6,7, 2,3, 1H), 6,44 (d, J = 9,4, 1H), 6,30-6,25 (m, 1H), 4,35 (t, J = 6,5, 2H), 2,72 (t, J = 2,4, 1H), 2,18-2,11 (m, 2H), 1,77-1,60 (m, 2H ), 1,52-1,20 (m, 12H).
   8. Usar o óleo, sem qualquer outra purificação ou separação.
2. Preparação de [(3S) -2-oxoazetidin-3-il] acetato de amónio
   1. Preparação de benzil N - [(S) -1- (hidroximetil) -2 - [(4-metoxifenil) amino] -2-oxoethil] carbamato.
      1. Numa 4-L balão de fundo redondo, dissolver 141,5 g de p-anisidina em 1,5 L de tetra-hidrofurano e 0,5 L de diclorometano.
      2. Arrefece-se a solução para 0 ° C num banho de gelo.
      3. Adicionar 50,0 g de N-Cbz-L-serina e 43,9 g de N - (3-dimetilaminopropil) - etilcarbodiimida N '.
      4. Agita-se a mistura com uma barra magnética, a 0 ° C durante 30 min.
      5. Remover a solução do banho de gelo e agita-se com uma barra magnética à TA durante 16 h.
      6. Evaporaram-se os solventes sob pressão reduzida (evaporador rotativo).
      7. Adicionar 400 ml de 1: 1 ciclo-hexano / acetato de etilo, agita-se com uma espátula, e decanta-se.
      8. Repita o passo 1.2.1.7 mais duas vezes.
      9. Dissolve-se o resíduo gomoso em 500 ml de acetato de etilo e lava-se com 400 ml de solução 0,1 M de HCl (10 vezes), com 400 ml de solução saturada de _NaHCO3 (2 vezes), e com 400 ml de salmoura.
      10. Seca-se a camada orgânica comNa ₂ SO _4, filtrar a solução através de algodão em um balão de fundo redondo (tara em primeiro lugar), e evapora-la até à secura sob pressão reduzida (evaporador rotativo).
      11. Pesa-se o balão e se obter 61,4 g de um sólido branco.
          ¹ H RMN (400 MHz, DMSO-d ₆₎ ô = 9,86 (bs, 1H), 7,52 (d, 2H, J = 9,0 Hz), 7,42-7,25 (m, 6H), 6,91-6,85 (m, 2H) , 5,06 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 5,02 (d, 1H, J = 12,9 Hz), 4,98 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 4,24-4,15 (m, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,70-3,57 (m, 2H).
   2. Preparação de benzil-N - [(S) -1- (4-metoxifenil) -2-oxo-azetidin-3-il] carbamato.
      1. Dissolve-se 58,6 g de N - [(S) -1- (hidroximetil) -2 - [(4-metoxifenil) amino] -2-oxo-etil] carbamato em 1,6 L de N, N-dimetilformamida.
      2. Arrefece-se a solução para 0 ° C com um banho de gelo.
      3. Adicionar 50,6 g de 1,1'-sulfonyldiimidazole e agita-se com uma barra magnética durante 30 min.
      4. Arrefecer a soluçãoa -20 ° C com um banho de gelo / NaCl e adicionar 10,2 g de hidreto de sódio (60% em óleo mineral) em porções.
      5. Agita-se a mistura a -20 ° C durante 1 h, e depois extingue-se com 2 ml de metanol e 1 L de água.
      6. Aspirador de filtrar o precipitado, lavar com 200 ml de água, e seco sob vácuo.
      7. Obter 42,2 g de um sólido branco.
         ¹ H RMN (400 MHz, DMSO-d ₆₎ δ = 8,08 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,42-7,28 (m, 5H), 7,30 (d, 2H, J = 8,9 Hz), 6,95 (d , 2H, J = 8,9 Hz), 5,06 (s, 2H), 4,86 ​​(ddd, 1H, J = 8,5, 5,6, 2,6 Hz), 3,90 (t, 1H, J = 5,6 Hz), 3,73 (s, 3H) , 3,55 (dd, 1H, J = 5,6, 2,6 Hz).
   3. Preparação de benzil-N - [(S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato.
      1. Suspender 9,0 g de benzil-N - [(S) -1- (4-metoxifenil) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato de metilo em 500 ml de acetonitrilo e 400 ml de água.
      2. Arrefece-se a solução para 0 ° C num banho de gelo.
      3. Adicionar 45,4 g de ceric nitrato de amónio em porções, ao longo de 45 min e agita-se com uma barra magnética, a 0 ° C durante 15 min.
      4. Adicionar 500 ml de solução saturada de _NaHCO3 com cautela, e em seguida, adicionar 500 ml de acetato de etilo.
      5. Filtra-se o precipitado e lava-se com 200 ml de acetato de etilo.
      6. Separa-se a solução bifásica e lava-se a camada aquosa com 200 ml de acetato de etilo (3 vezes).
      7. Seca-se a camada orgânica com Na ₂ SO _4, adicionam-se 5 g de carvão activado, filtra-se através de uma almofada de sílica de diatomáceas e evapora-se até à secura sob pressão reduzida (evaporador rotativo).
      8. Adicionar éter dietílico e agita-se com uma espátula.
      9. Filtra-se o sólido e obter 4,85 g de um sólido quase branco.
         ¹ H RMN (400 MHz, DMSO-d ₆₎ δ = 7,97 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,94 (bs, 1H), 7.42- 7.30 (m, 5H), 5,05 (s, 2H), 4,67 (ddd, 1H, J = 8,7, 5,4, 2,7 Hz), 3,40 (t, 1H, J = 5,4 Hz,), 3,09 (dd, 1H, J = 5,4, 2,7 Hz).
   4. Preparação de [(S) -2-oxoazetidin-3-il] -amónio de etilo.
      1. Dissolve-se 0,93 ml de ácido acético em 245 ml de acetato de etilo. Marcar este como "solução prendendo."
      2. Dissolve-se 3,28 g de benzil-N - [(R) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato de metilo em 298 ml de etanol.
      3. Adicionar 14,1 ml de ciclo-hexadieno e 3,27 g de paládio a 10% sobre carbono.
      4. Agita-se a suspensão à TA durante 12 h, e, em seguida, filtra-se através de uma curta almofada de terra de diatomáceas. Despeje o líquido eluição directamente na solução de trapping.
      5. Evapora-se o solvente sob pressão reduzida (evaporador rotativo), mantendo a temperatura abaixo de 35 ° C.
      6. Tritura-se o sólido obtido com tetra-hidrofurano e se obter 1,72 g de um sólido branco.
         ¹ H RMN (400 MHz, DMSO-d ₆₎ ô = 7,68 (s largo, 1H), 3,99 (ddd, 1H, J = 5,2, 2,4, 1,2 Hz), 3,32 (t, 1H, J = 5,2 Hz), 2,79 (dd, 1H, J = 5,2, 2,4 Hz), 1,90 (s, 3H).
3. Preparação de undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbamato
   1. Em um balão de 10 ml de fundo redondo, dissolvem 60 mg de [(3S) -2-oxoazetidin-3-il] acetato de amónio em 2 ml de diclorometano seco.
   2. Arrefece-se a solução para 0 ° C num banho de gelo e adicionar 81 ul de N, N-diisopropiletilamina gota a gota.
   3. Dissolve-se 350 mg da mistura em bruto contendo 10-undec-2-inil-oxopiridina um carboxilato de etilo em 2 ml de diclorometano seco, adicionar-se à solução, e agitar à TA durante 15 h. Evapora-se o solvente até à secura sob pressão reduzida (evaporador rotativo).
   4. Purifica-se por cromatografia em coluna (gel de sílica), utilizando um aparelho de cromatografia em coluna automatizada:
      1. Absorver a amostra em gel de sílica, equilibrar a coluna com ciclo-hexano, e carregar a amostra para dentro do cartucho.
      2. Elui-se com ciclo-hexano / acetato de etilo desde 100: 0 a 0: 100 e recolher picos em tubos de ensaio.
      3. Evapora-se o solvente das fracções correspondentes ao composto até à secura sob pressão reduzida (evaporador rotativo) e obter 40 mg de um sólido branco.

2. Preparação de Reagentes CC

1. Preparação de 5 mM da solução de moléculas Tag-azida
   1. Dissolve-se 1,5 mg de azida-PEG3-Fluor 545 em 0,5 ml de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Faça alíquotas de 0,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C.
   2. Dissolve-se 1,1 mg de azida-PEG3-Biotina em 0,5 ml de DMSO. Faça alíquotas de 0,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C.
2. Preparação de 50 mM da solução de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP)
   1. Dissolver 14,3 mg de TCEP em 1 ml de água, e torná-lo fresco cada vez.
3. Preparação da solução 50 mM de CuSO ₄ 5H ₂ O ·
   1. Em um frasco de vidro, dissolver 12.48 Mg de CuSO ₄ 5H ₂ O · em 1 ml de água. Armazenar à temperatura ambiente por até um mês.
4. Preparação de 83,5 mM de solução stock de Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (TBTA)
   1. Em um frasco de vidro, dissolver-se 8,85 mg de TBTA em 200 ul de DMSO. Armazenar à temperatura ambiente por até um mês.
5. Preparação de Trabalho 1,7 mM Solução de TBTA (imediatamente antes da utilização)
   1. Adicionar 20 ul de TBTA 83,5 mM a um frasco de vidro e dilui-se com 180 ml de DMSO.
   2. Adicionar 800 mL de terc-butanol e vortex.

3. NAAA análise da expressão em Paw tecido conjuntivo de ratos tratados com CFA

NOTA: Use ratos Sprague-Dawley, pesando 175-200 g, e realizar todos os procedimentos de acordo com as diretrizes para o uso ético dos animais. ratos de casas em gaiolas ventiladas em uma luz 12-hr / ciclo escuro e dar-lhes livre acesso a comida e água. Para o protocolo de CFUm tratamento, consulte o artigo publicado por Bonezzi et al. ²⁹ Usar animais 7 dias após a administração CFA.

1. A administração intravenosa de ARN14686
   1. Dissolver ARN14686 no veículo (15% de PEG e Tween solução salina 15%). Calcula-se a concentração da solução de acordo com o peso de ratos (dose de 3 mg / kg, volume de injecção de 5 ml / kg).
   2. Proceda com injecções EV em três ingênua e três ratos tratados com CFA. Coloque cada rato em um dispositivo de retenção de plástico apropriado. Em seguida, coloque a cauda de rato na água morna por 2-4 min para permitir a vasodilatação e injetar o iv composto através da veia da cauda.
   3. Injectar iv três ratos (ingênua e CFA-tratado) com apenas veículo.
2. Coleção pata e Dissection
   1. Sacrificar os ratos por inalação de CO ₂ 4 horas após a sonda ou veículo de administração e recolher as suas patas, cortando-0,5 cm acima da articulação do joelho utilizando um bisturi.
   2. Remova cuidadosamente a pele por dissecção assistida-tesoura e dissecar tecidos moles por raspagem-los a partir do osso. Descarte os ossos e recolher os tecidos moles das patas. Amostras congeladas de encaixe em azoto líquido e armazenar a -80 ° C.
3. A pata homogeneização e lisossomais Preparação Proteína
   NOTA: Evite a utilização de detergentes e tampões contendo amina, como eles podem inibir a reação CC.
   1. Combinar tecido da pata a partir de 3 ratos (obtida tal como descrito na secção 3.2.1) e homogeneizá-los em 4 mL de sacarose 320 mM em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4) e um cocktail de inibidor de protease (ver Tabela de Materiais / Reagente); usar um instrumento de dispersão de alto desempenho (ver Tabela de Materiais / Reagente).
   2. Centrifuga-se o homogeneizado de tecido durante 20 minutos a 1000 xg, a 4 ° C; salvar o sobrenadante.
   3. Adicionar 2 ml de sacarose 320 mM em PBS e o cocktail inibidor de protease para o sedimento de tecido ehomogeneizar mais uma vez.
   4. Centrifugar durante 20 minutos a 1000 xg, a 4 ° C, e adiciona-se o sobrenadante a um a partir do passo 3.3.2.
   5. Centrifugar os sobrenadantes recolhidos durante 30 min a 12000 xg, a 4 ° C.
   6. Pesa-se o sedimento e ressuspender em dois volumes de PBS (isto é, 200 ul para cada 100 mg de pelete). Transferir para um tubo de recolha de 1,5 ml e congelar a -80 ° C durante 1 h.
   7. Descongelar as amostras e congelar novamente durante 1 h a -80 ° C.
   8. Repetir o ciclo congelação / descongelação mais duas vezes.
      NOTA: Este passo destina-se a solubilização da proteína. Congelar durante a noite, se necessário.
   9. Centrifugar durante 1 h a 100000 xg, a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante, que contém as proteínas solúveis do lisossoma, e rejeitar o sedimento. Armazenar a -80 ° C ou prosseguir imediatamente com a quantificação de proteínas.
   10. Quantificar o teor de proteína usando um ensaio de proteína BCA ³⁰ kit comercial (ver Tabela de Material / Reagente ), seguindo as instruções do fabricante.
   11. Armazenar as amostras a -80 ° C até à sua utilização.
4. CC com azida-PEG3-Biotina
   NOTA: O protocolo de CC e enriquecimento talão estreptavidina (passos 3,4-3,6) são ligeiramente modificada do protocolo publicado por Speers e Cravatt ^31.
   1. Preparar 500 ul (1 mg / ml, em PBS) de proteínas lisossómicas de ratos probe- e tratados com veículo (ratos ingénuos e CFA-tratados).
   2. Preclear amostras com 40 ul de uma lama a 50% de agarose e estreptavidina (lavar três vezes com 1 ml de PBS antes da utilização), durante 1 h a 4 ° C. Centrifugar durante 4 minutos a 1000 xg, a 4 ° C e levar o sobrenadante.
   3. Adicionar 11,3 ul de um estoque de 5 mM de azida-PEG3-Biotina e vortex.
   4. Adicionar 11,3 ul de um estoque de 50 mM de TCEP recém-preparados e vortex.
   5. Premix 34 ul de uma solução de trabalho preparada de fresco de TBTA 1,7 mM com 11.3 ul de uma _CuSO4 50 mM · 5H ₂ O estoque.
   6. Adicionar 45,3 ml de uma solução pré-misturada e vórtice TBTA / CuSO ₄ 5H ₂ O ·.
   7. Incubar a reacção a 25 ° C durante 2 h (um tempo de incubação mais longo não afecte a reacção). Observar a precipitação da proteína nesta etapa. Misturar após a primeira hora de incubação.
5. A remoção dos reagentes em excesso CC
   1. Centrifugar as amostras durante 4 min a 6500 xg, a 4 ° C e remover o sobrenadante.
   2. Adicionar 750 mL de metanol frio e ressuspender por ultra-sons (5 segundos com um sonicador de sonda).
   3. Centrifugar as amostras durante 4 min a 6500 xg, a 4 ° C e remove-se o sobrenadante utilizando uma seringa e agulha.
   4. Repita duas vezes passo 3.5.2 (ultra-sons não é necessário).
   5. Após a última lavagem, adicionar 325 ul de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) a 2,5% em PBS para a pelete de proteína e sonicar 3x durante 5 seg.
   6. Aquecer as amostras durante 5 minutos a 65 ° C e uma sonicarganho.
   7. Centrifugar durante 5 minutos a 6500 xg à temperatura ambiente e guardar o sobrenadante.
   8. Adicionar 1,4 ml de PBS para diluir a concentração de SDS a 0,5%. Armazenar a -20 ° C ou continuar com o enriquecimento estreptavidina.
6. estreptavidina Enriquecimento
   1. Com PBS, levar o volume das amostras obtidas no passo 3.5.8 para 4,2 ml. Adicionar 40 ul de uma lama a 50% de agarose e estreptavidina utilizando uma ponta de corte de extremidade (lavar três vezes com 1 ml de PBS antes da utilização).
   2. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente com rotação e, em seguida, centrifuga-se durante 2 min a 1400 x g.
   3. Remover o sobrenadante sem secagem dos grânulos e peletes usar sobrenadante residual para transferir os grânulos a uma coluna de 1 ml de girar (ver Tabela de Materiais / Reagente).
   4. Lavar por gravidade com 3 x 1 ml de SDS a 1% (em PBS), 3 x 1 ml de 6 M de ureia (em PBS), e 4x 1 ml de PBS.
   5. Uso 2x 500 ul de PBS para transferir as esferas para um tubo de 1,5 ml e centrifugar durante 2 minutos a 1400 xg à temperatura ambiente. Com cuidado, aspirar o sobrenadante com uma seringa e agulha.
   6. Elui-se as proteínas ligadas à resina por adição de 25 ul de tampão de eluição (ureia 6 M, 2 M tioureia, 2% de SDS, e biotina 6 mM, todos em PBS) durante 15 min à t.a., seguido por 15 min a 95 ° C ^32.
7. proteína Blot
   1. Adicionar 5 uL de tampão de 6x Laemmli (para 9 ml: 0,5 ml de Tris-HCl 1 M pH 6,8, 5 ml de SDS a 20%, 5 mg de azul de bromofenol, 3 ml de glicerol, e _H2O até 9 mL) e adicionar 5% β-mercaptoetanol imediatamente antes da utilização. Resumidamente centrifugar as amostras a 2000 xg para sedimentar a resina e de carga de 25 ul do sobrenadante obtido num gel de poliacrilamida a 4-12%.
   2. Efectuar a electroforese em gel e transferência de proteína sobre uma membrana de blotting de acordo com as instruções do fabricante ^33.
   3. Saturar a membrana de blotting durante 1 hora com 10 ml de um tampão de bloqueio (ver Tabela de Materiais / Reagente) contendo 0,1% de Tween-20.Evitar o uso de leite, uma vez que pode aumentar o fundo.
   4. Lava-se a membrana com 10 ml de 0,05% de Tween-20 em PBS e adicionar 10 ul de estreptavidina fluorescente (ver Materiais / Reagente Tabela) dissolvido em 10 ml de tampão de bloqueio com 0,1% de Tween-20 durante 1 h à TA.
   5. Lavar 4 vezes com 0,05% de Tween-20 em PBS e uma vez com apenas PBS (10 min cada).
   6. Use um scanner de imagem (ver Tabela de Material / Reagente). Ligue o instrumento e o computador conectado. Espere até que esteja pronto.
   7. Inicie o programa de aquisição e seleccionar o modo de fluorescência. Seleccione a área de membrana e escolher a pasta de destino para os arquivos salvos.
   8. Defina os seguintes parâmetros de aquisição: 680 nm comprimento de excitação, filtro BPFR700, V tubo fotomultiplicador (PMT) valor 1.000 (canal 2), e 25 um tamanho de pixel. Adquirir a imagem.

4. Localização de NAAA cataliticamente activo no rato pulmões por fluorescência Microscópia

NOTA: Use masculino camundongos 8 a 10 semanas de idade e realizar todos os procedimentos de acordo com as diretrizes para o uso ético dos animais. Os ratos domésticos em gaiolas ventiladas em um 12 hr ciclo de luz / escuridão e dar-lhes livre acesso a comida e água.

1. A administração intravenosa de ARN14686 em Ratos
   1. Dissolver ARN14686 no veículo: solução salina 15% de PEG e 15% de Tween-20. Calcula-se a concentração da solução de acordo com o peso do rato (dose de 3 mg / kg, volume de injecção de 5 ml / kg).
   2. Prosseguir com a injeção intravenosa de 3 ratos. Coloque cada rato em um dispositivo de retenção de plástico apropriado. Em seguida, coloque a cauda do rato em água morna por 2-4 min para permitir a vasodilatação e injetar o iv composto através da veia da cauda.
   3. Injectar 3 iv ratos com apenas veículo.
2. Coleção de pulmão e Slice Preparação
   Aviso: Pega paraformaldeído com cuidado em um exaustor, e usar luvas!
   1. Anestesiar ratos com chlohidrato de RAL (400 mg / kg). Confirmar anestesia com uma pitada dedo do pé. Executar uma perfusão transcardial como se segue:
      1. Superficialmente cortar a pele ventral com uma tesoura e expor as superfícies da membrana torácicas e peritoneal.
      2. Superficialmente cortar a membrana peritoneal com uma tesoura, logo abaixo do processo xifóide, expondo o diafragma e os órgãos viscerais. Tenha cuidado para não dilacerar qualquer vasculatura significativo.
      3. Abrir a cavidade torácica, cortando o diafragma de uma face lateral para a outra.
      4. Inserir a agulha 25 G ligada à bomba de seringa automatizada e infundir 20 ml de solução salina a 0,9%, seguido de 60 mL de PFA a 4% em tampão fosfato (0,1 M, pH 7,4).
   2. Uma vez que a perfusão for concluída, puxe o coração usando uma pinça e dissecá-lo com cuidado para fora. Segure a traqueia com uma pinça e cortar completamente através dele com uma tesoura. Puxe delicadamente a traqueia para cima e retire os pulmões da caixa torácica. Dissecar o tecido aseparar o pulmão direito e esquerdo.
   3. Postfix o tecido em paraformaldeído 4% para 1 hr, amostras congelar no frio 2-metilbutano, e armazená-los a -80 ° C.
   4. Colete 40 mm seções usando um criostato, montá-los imediatamente em lâminas (uma em cada cinco), e processá-los para imuno-histoquímica como detalhado abaixo.
3. Tissue Fatias permeabilização e Bloqueio
   1. Lavar com PBS (2 x durante 5 min) e permeabilizar com 0,1% de Triton X-100 de PBS durante 15 min à TA.
   2. Lavar com PBS (2 x durante 5 min) e bloquear com albumina de 3% de soro de bovino (BSA) em PBS durante 30 min à TA.
   3. Lavar com PBS (2x por 5 min) e avançar para o CC.
4. CC com Azide-PEG3-Fluor 545 em fatias de tecido
   1. Prepara-se uma solução por mistura dos reagentes CC preparados como descrito no ponto 2. Para 1 ml de solução, adicionar: 2 ul de azida-PEG3-Fluor 545 (5 mM), 20 ul de TCEP (preparado de fresco a 50 mM stock), 58,8 ul de TBTA (preparado de fresco Solução de trabalho de 1,7 mM), 20 ul de CuSO ₄ 5H ₂ O · (estoque 50 mM), e 900 ul de PBS.
   2. Adicionar cerca de 400 ul de mistura CC às fatias de tecido, que foram preparados de acordo com a secção 4.2. Preste atenção que o volume escolhido de mix CC é suficiente para cobrir as fatias. Incubar durante 1 h à TA, protegido da luz.
   3. Lavar com PBS (1x durante 5 min), metanol frio (1x durante 5 min), uma solução de 1% de EDTA mM e Tween-20 a 0,5 em PBS (3x durante 2 min), e de PBS (1x durante 5 min).
   4. Ar seco, adicione uma gota de antifade montagem com DAPI (ver Materiais / Tabela Reagente), estreita com lamelas (evitando a formação de bolhas), e selar com o polonês. Armazenar a 4 ° C até à análise.
5. Aquisição de imagem
   1. Use um microscópio confocal equipado com 546 nm e 450 nm lasers de excitação (ver Tabela de Material / Reagente) seguinteo guia de usuário.
   2. Selecione uma lente objetiva de 60X com NA = 1,40, certificando-se de visualizar o slide através das oculares e se concentrar em uma área de interesse.
   3. Determinar os parâmetros de aquisição de acordo com as características da amostra e do equipamento.

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Resultados

ARN14686 foi projetado com base no cadafalso da ARN726 inibidor NAAA. O grupo 4-butil-ciclo-hexilo de ARN726 foi substituído com uma cadeia alifática em C9 saturado tendo uma marcação alcino terminal (Figura 1). A tag alcino foi introduzida, a fim de permitir a utilização de um procedimento de marcação de dois passos para adicionar um fluoróforo ou uma molécula de biotina através de CC. Esta característica torna ARN14686 uma ferramenta muito versátil para so...

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Discussão

A actividade enzimática é finamente regulados em níveis diferentes, incluindo a transcrição de ARN, a síntese de proteínas, a translocação da proteína, a modificação pós-translacional, e interacção proteína-proteína. Muitas vezes, a expressão da enzima sozinha não leva em conta para a sua actividade. ABPP foi desenvolvido para estudar a actividade de proteínas no seu estado nativo. Duas características são necessárias: uma sonda química que covalentemente liga-se ao sítio activo de uma enzima de...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1’-sulfonyldiimidazole	Sigma Aldrich	367818	Harmful
2-dipyridylcarbonate	Fluorochem	11331	Harmful
2-Methylbutan	Sigma Aldrich	M32631	Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment
4-(Dimethylamino)pyridine	Sigma Aldrich	107700	Toxic
Acetic acid	Sigma Aldrich	695092	Flammable, Corrosive
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998	Flammable, Toxic
Activated charcoal	Sigma Aldrich	161551
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	A9434	Harmful
Azide-PEG3-Biotin	Jena Biosciences	CLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545	Jena Biosciences	CLK-AZ109
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23227
Bio-spin columns	Biorad	732-6204
Biotin	Sigma Aldrich	B4501
Blocking buffer	Li-Cor Biosciences	927-40000
β-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250	Higly toxic
Bovin serum albumine (BSA)	Sigma Aldrich	A7030
Bromophenol blue	Sigma Aldrich	B0126
Bruker Avance III 400	Bruker
Celite	Sigma Aldrich	419931	Health hazard
Ceric ammonium nitrate	Sigma Aldrich	22249	Oxidizing, Harmful
Chloral hydrate	Sigma Aldrich	C8383	Higly toxic
CuSO4.5H2O	Sigma Aldrich	209198	Toxic
Cyclohexadiene	Sigma Aldrich	125415	Flammable, Health hazard
Cyclohexane	Sigma Aldrich	34855	Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard
Dichloromethane	Sigma Aldrich	34856	Harmful, Health hazard
Diethyl ether	Sigma Aldrich	296082	Flammable, Harmful
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Acros Organics	348441000
Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6)	Sigma Aldrich	175943
Ethanol	Sigma Aldrich	2860	Flammable, Harmful
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	34858	Flammable, Harmful
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Irdye 680-LT Streptavidin	Li-Cor Biosciences	925-68031
IRDye680-LT Streptavidin	Licor	925-68031	Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes
Methanol	Sigma Aldrich	34966	Highly toxic
Methanol	Sigma Aldrich	34860	Flammable, Toxic, Health hazard
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma Aldrich	E7750	Harmful, Corrosive
N,N-diisopropylethylamine	Sigma Aldrich	D125806	Flammable, Corrosive, Toxic
N,N-dimethylformamide	Sigma Aldrich	227056	Flammable, Harmful, Health hazard
N-Cbz-L-Serine	Fluorochem	M03053	Harmful
Nikon A1 confocal microscopy	Nikon		Read the user manual
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel	Thermo Fisher Scientific	NP0335BOX
Palladium on carbon	Sigma Aldrich	330108
p-anisidine	Sigma Aldrich	A88255	Toxic, Health hazard, Environmental hazard
Paraformaldehyde	sigma Aldrich	441244	Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable
Poly(ethylene glycol)	Sigma Aldrich	P3265
ProLong Gold antifade mountant with DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36931	Avoid bubbles formation
Protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	P8340
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	Toxic, corrosive, falmmable
Sodium hydride	Sigma Aldrich	452912	Flammable
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313
Starion FLA-9000 immage scanner	FUJIFILM		Read  the user manual
Streptavidin agarose	Thermo Fisher Scientific	20349
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Tert-butanol	Sigma Aldrich	360538	Toxic, flammable
Tetrahydrofuran	Sigma Aldrich	186562	Flammable, Harmful, Health hazard
Thiourea	Acros Organics	424542500	Toxic, warm at 50 °C to dissolve
Tris	Sigma Aldrich	RDD008
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Sigma Aldrich	C4706
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)	Sigma Aldrich	678937
Triton-x100	Sigma Aldrich	X100	Toxic
Tween-20	Sigma Aldrich	P9416
Tween-80	Sigma Aldrich	P1754
Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer	IKA
Undec-10-yn-1-ol	Fluorochem	13739	Harmful
Urea	Sigma Aldrich	U5378	Toxic, warm at 50 °C to dissolve