Virus Zika sistema de cultura celular Infecciosas e do<em&gt; In Vitro</em&gt; Efeito profilático de interferões

Resumo

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Resumo

Vírus Zika (ZIKV) é um agente patogénico emergente que está ligada a anomalias do desenvolvimento fetal, tais como microcefalia, defeitos oculares, e comprometimento do crescimento. ZIKV é um vírus de RNA da família Flaviviridae. ZIKV é transmitido principalmente por mosquitos, mas também pode ser transmitida por maternal à transmissão vertical fetal, bem como o contato sexual. Até à data, não há nenhum tratamento ou vacinas fiáveis ​​opções disponíveis para proteger as pessoas infectadas pelo vírus. O desenvolvimento de um sistema de cultura de células reprodutível, eficaz Zika vírus infeccioso é fundamental para o estudo dos mecanismos moleculares de replicação ZIKV, bem como o desenvolvimento de drogas e vacinas. A este respeito, um protocolo descrevendo um in vitro Zika sistema de cultura de mamífero com base em células de vírus para análise da produção e crescimento virai é aqui relatado. Os detalhes sobre a formação de placas de vírus Zika numa monocamada de células e ensaio de placa para medição título virai são apresentados. cinética de replicação do genoma virale intermediários replicatory de cadeia dupla do genoma de ARN são determinadas. Esta plataforma de cultura foi utilizado para a tela de encontro a uma biblioteca de um pequeno conjunto de citocinas, resultando na identificação de interferão-α (IFN-α), IFN-β e IFN-γ como potentes inibidores do crescimento virai Zika. Em resumo, um sistema in vitro infecciosa viral Zika cultura e vários ensaios virológicos são demonstrados neste estudo, que tem o potencial de se beneficiar muito a comunidade de investigação para elucidar ainda mais os mecanismos de patogénese viral e a evolução da virulência do vírus. Antiviral IFN-alpha pode ainda ser avaliada como um, profilático pós-exposição, e opção de tratamento profilático para infecções por vírus Zika em populações de alto risco, incluindo mulheres grávidas infectadas.

Introdução

Virus Zika (ZIKV) é um patógeno humano importante associado à microcefalia e pobres resultados perinatais ^1,4. ZIKV pertence ao conjunto de flavivírus clinicamente relevantes que podem causar defeitos neurológicos, tais como o dengue, Nilo Ocidental, e vírus da encefalite de St. Louis. O principal modo de transmissão virai é pelo vector mosquito Aedes aegypti, e, além disso, a transmissão sexual também tem sido relatada ^5,6. ZIKV tornou-se um grande problema global de saúde devido à distribuição geográfica expansão do mosquito vetor e sua forte correlação com defeitos de nascimento. ZIKV foi isolado pela primeira vez em 1947 a partir de um macaco rhesus sentinela na floresta Zika, Uganda e o primeiro caso humano foi relatado em 1952 ^7,8. Indivíduos que se tornam infectados com ZIKV apresentam sintomas leves, como febre, erupção cutânea, dor de cabeça, conjuntivite e dor muscular / conjunta. Mulheres grávidas infectadas podem transmitir ZIKV ao feto em desenvolvimento ^1. ZInfecção IKV também tem sido associada à síndrome de Guillain-Barre, um nervo periférico desordem auto-imune desmielinização ^9.

O genoma viral consiste Zika de sentido positivo, de cadeia simples molécula de RNA que é cerca de 10,8 quilobases de comprimento. A estrutura do genoma está organizado como 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2a-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, com regiões não codificantes (NCR) flanqueando uma região codificadora de proteínas ^6. A única poliproteína (3419 aa) é traduzida que é co- e pós-tradução clivada em 10 peptídeos menores. Tanto o 5'NCR e estruturas de haste-laçada 3'NCR RNA desempenham um papel crítico no início do genoma viral tradução e replicação. Os componentes estruturais do genoma são compostas das proteínas da cápside, a membrana, e de envelope. As proteínas não estruturais são essenciais para a replicação do genoma.

Atualmente, estirpes virais Zika são agrupados em três genótipos principais: Oeste Africano, Leste Africano e Asiático ^6,10-13. Foi proposto que a linhagem do Leste Africano espalhou para a África Ocidental e Ásia, onde mais tarde evoluiu ainda mais ^12. O genótipo asiático é responsável pelos surtos atuais nas Américas. Zika vírus podem ser cultivados em ambos os mosquitos e as células de mamíferos. Fibroblastos dérmicos primários, células dendríticas imaturas, células progenitoras neuronais corticais, células Vero e são susceptíveis a infecções virais Zika ^10,14,15. Ambos os tipos I e tipo II interferões têm sido mostrados para restringir o crescimento ZIKV em fibroblastos da pele ^15. Os objectivos deste estudo consistem em proporcionar, um protocolo detalhado passo a passo para a produção e o ensaio de genótipo asiática ZIKA estirpe viral PRVABC59 num sistema de cultura de células de mamífero e para demonstrar a utilidade deste sistema de cultura infecciosa como uma plataforma de desenvolvimento de drogas. Este recurso tem o potencial de se beneficiar muito a comunidade de pesquisa viral e neurológica Zika para elucidar ainda mais imecanismos ts da patogénese viral e evolução da virulência do vírus.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Nota: Uma representação esquemática do fluxo de trabalho é apresentado na Figura 1.

1. células

1. Utilização de células Vero para a produção de vírus e Zika análise do ciclo de replicação virai.
2. Prepare meio completo de crescimento contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, penicilina (100 unidades / ml), estreptomicina (100 unidades / ml), e 10 mM de HEPES.
3. Células Vero de cultura com o meio de crescimento completo especificado a 37 ° C com 5% de CO _2.

2. Zika produção de vírus

1. Colher as células Vero a densidade celular de 80% utilizando 0,25% de tripsina em T-75 balão e contar as células.
   1. Aspirar a mídia do frasco de cultura T-75 e lavar as células com 2 ml de tampão fosfato salino (PBS).
   2. Adicionar 2 ml de 0,25% de tripsina e incubação do balão a 37 ° C durante 5 min.
   3. Adicionar 8 mL de meio de crescimento contendo soro, para inactivar a tripsina. Pipeta cima e para baixo para o SUScélulas pend e transferência das células para um tubo de 15 ml.
   4. Retirar 10 ml de células e misturar com uma quantidade igual de 0,4% de azul de tripano. Coloque a mistura preparada para o slide câmara de contagem de células e obter células viáveis ​​contagens utilizando um contador de células automatizado.
2. Semente um total de 7 milhões de células num volume de 30 ml num frasco T-160.
3. No dia seguinte, preparar uma multiplicidade de infecção adequado (0,01 a 0,1 MOI) de Zika inoculo de vírus em um meio de cultura livre de soro de 10 ml por frasco.
4. Remova a mídia passou a partir do balão T-160 e, em seguida, adicionar o inóculo viral preparada na hora (10 ml).
5. Incubar os balões inoculados em 37 ° C com 5% _de CO ₂ durante 4-6 horas. Espalhar o inoculo pela inclinação suavemente os frascos de lado em cada hora.
6. Após a conclusão da incubação, o inoculo substituir com meio quente suplementado com soro de crescimento (30 ml) por cada frasco. Em seguida, continuar a cultura viral para o próximo 96 horas.
7. Verificar a progressão da eminfecção através da observação do aparecimento de placas virais na monocamada de células utilizando um microscópio de contraste de fase e captar imagens (Figura 2), conforme necessário, em 40X e 200X ampliações.

Figura 2:. Placas formadas por vírus Zika numa monocamada de células Vero imagens de campo claro de diversas ampliações mostram placas virais Zika a 48 hpi. Observe a presença de focos de células arredondadas sobre a monocamada. (Barra de escala = 50 mm) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. Colheita sobrenadantes de cultura celular no ponto de tempo de 96 h e centrifuga-se o sobrenadante a 300 xg durante 10 min a 4 ° C para remover os restos celulares.
9. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem detritos peletizada perturbador e transferência de to tubos de 15 ml. Ultracentrifugação a 24.000 xg pode ser realizada para concentrar as partículas virais (opcionais).
10. Armazenar os sobrenadantes de culturas virais em várias alíquotas a -80 ° C.

3. Medir Zika título do vírus por Plaque Assay

1. Semente células Vero naive a 1 x 10 ⁵ células por poço em 2 ml de volume, utilizando uma placa de 12 poços.
2. No dia seguinte, 10 preparar diluições em série de sobrenadantes de culturas virais colhidas a partir do balão T-160, utilizando meios isentos de soro. Remover os meios gastos de cada poço e adicionar 400 ul de inoculo preparada em células Vero em triplicado.
3. Incubar os frascos inoculados em 37 ° C com 5% _de CO ₂ durante 4-6 horas. Espalhar o inoculo, inclinando gentilmente a placa de lado em cada um de RH.
4. No final da incubação, o inoculo substitua com meio de soro suplementado (2 ml por poço).
5. Em 48 horas após a inoculação, a contagem de focos viral usando um contr fasemicroscópio ast. Calcular o título virai como unidades formadoras de placas (PFU) por ml. Ver Figura 3 para o ensaio de placas.
6. Fix e manchar as células em 4% de formaldeído e solução de violeta cristal 0,1% preparadas em 20% de etanol para a visualização clara de placas.

Ensaio 4. Zika Viral Genome Replication

1. Semente células Vero naive a 1 x 10 ⁵ células por poço em 2 volumes ml utilizando uma placa de 12 poços. No dia seguinte, preparar inóculos virais (MOI de 0,01 e 0,1; 400 ul / poço) de baixo e elevado título usando o meio livre de soro em triplicado. Para a infecção simulada, usar a mídia livre de soro (400 ul / poço) somente.
2. Repita os passos 3.2 a 3.4.
3. Nos 48 e 96 pontos Tempo hora, recolher as amostras para RNA e imunocitoquímica (ICC).
   1. Para amostras de RNA colheita, remova a mídia e, em seguida, adicione 400 ml de solução de lise diretamente a cada poço e recolher os lisados.
   2. Para ICC, remova a mídia e tgalinha fixar as células por adição de 1 ml de metanol a cada cavidade e incuba-se a placa a 4 ° C durante 30 min.
   3. A partir do lisado celular, isolar o ARN total utilizando um kit de isolamento de ARN de acordo com as instruções do fabricante. Quantificar o ARN utilizando um espectrofotómetro.
4. Realizar um de dois passos de transcrição reversa quantitativa PCR (RT-qPCR) para determinar o teor de genoma ZIKV a partir de ARN colhido.
   1. Para a transcrição reversa do ARN, em primeiro lugar uma mistura de reacção 13 uL de composto de 5 ug de ARN isolado, 1 ul de dNTPs (10 mM), e um hexâmero aleatório ul (250 ng) em um tubo de 0,2 ml. Incubar o tubo a 65 ° C durante 5 min e, em seguida, colocá-lo em gelo durante um minuto. Subsequentemente, adicionar 1 ul de transcriptase reversa, 4 uL de tampão de síntese 5x Strand, 1 ul de ditiotreitol 0,1 M, e 1 ul de inibidor de RNase à mistura de reacção. Incubar o tubo durante um adicional de 5 min a 25 ° C, seguido de 60 min a 50 ° C e inactivComeram a reacção por aquecimento a 70 ° C durante 15 min.
   2. Execute qPCR utilizando 1 ul do cDNA resultante com 12,5 ul de 2x corante verde super-mistura contendo DNA polimerase e 1 ml de 10 mM iniciadores individuais específicas para o vírus Zika [Zika vírus primers pan-genótipo (Por: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), vírus de genótipos Zika asiática iniciadores estirpe PRVABC59 (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], ou o vírus da hepatite C (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), ou gene GAPDH de limpeza celular (por: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') num volume reaccional de 25 ul.
   3. Executar PCR usando a condição de execução 95 ° C durante 15 seg e 60 ° C durante 30 segundos (40 ciclos) num sistema de PCR em tempo real.
   4. Use o nível de expressão de GAPDH com base nos limites ciclo de valor (Ct) para normalizar a Zmedição genoma viral ika. Calcular o valor de delta Ct (ΔCt) de Zika genoma comparada com a de GAPDH e obter o valor 2 ^ΔCt. Em seguida, calcular a variação de dobragem, tendo a proporção de conteúdo normalizados genoma Zika entre as células infectadas e não infectadas em pontos de tempo indicados. Veja a Figura 4 para resultados de replicação ZIKV genoma.
5. Realizar ICC utilizando as células de metanol fixo.
   1. Lavam-se as células fixadas três vezes com PBS 1x e bloquear com tampão de bloqueio TPI (soro de cabra a 3%, 3% BSA, 0,1% de Triton X-100 em PBS).
   2. Use monoclonal de ratinho anti-ARNcd J2 anticorpo (1 ug / ml) a uma diluição de 1: 100 em tampão de bloqueio e incubar durante a noite a 4 ° C.
   3. Lavam-se as células com PBS 1x e adicionar anticorpo secundário de cabra anti-IgG de ratinho-594 (1 ug / ml) a uma diluição de 1: 1000 em tampão de bloqueio e incubar durante uma hora à temperatura ambiente.
   4. Lave as células com PBS 1x e mancha de núcleos usando Hoechst corante eobservar as células utilizando um microscópio de fluorescência a uma amplificação de 100X (Figura 4).

5. Triagem de citocinas Biblioteca contra infecção por vírus de Zika

1. Semente células Vero naive a 1 x 10 ⁵ células por poço usando uma placa de 12 poços. Uma vez que as células são ligadas (6 horas após a sementeira), adicionar cada citocina nas concentrações indicadas em duplicados biológicos (2 ml de volume / poço). Incluir veículo (PBS) de controle sozinho.
2. Aos 12 horas pós-tratamento, execute infecção viral Zika (MOI de 0,1 em 400 ul por poço). Incluem poços de controlo negativo sem infecção (simulada).
3. Às 4 horas após a infecção, substituir o inoculo virai com meios de citocinas tratado (2 ml). Incubar as células a 37 ° C durante 44 h adicionais.
4. Em 48 horas após a infecção, a contagem de placas virais utilizando um microscópio de contraste de fase e adquirir imagens representativas de células infectadas a uma ampliação de 40X (Figura 5).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Uma estirpe viral Zika (PRVABC59; número de acesso GenBank KU501215) do genótipo asiático foi utilizado neste estudo ^12. Células Vero a 80% de confluência foram utilizadas para investigar Novo infecção viral de Zika. Para a produção viral e posterior caracterização virológica, foi empregado um início passagem de vírus (P3) Zika. As placas virais foram observadas no segundo dia da infecção. Progênies virais Zika libertados a partir da célula ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Aqui, um protocolo simplificado para a cultura de vírus Zika in vitro é apresentado. As etapas críticas incluindo, identificando pontos finais óptimas para a expansão da cultura de vírus, medindo título, e quantificar a replicação do genoma foram fornecidos. vírus Zika é um patógeno humano, por isso, enquanto manuseamento de agentes infecciosos, procedimentos de biossegurança devem ser rigorosamente seguidas. Uma linha de células de rim de macaco, Vero, foi usado para demonstrar vários ensaios vi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma Life Science	D5796
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red	Corning	25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4%	Life Technologies	T10282
Countess – Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Countess-cell counting  chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10283
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System	Thermo Fischer	4471088
RNase-Free DNase	Promega	M6101
Vero Cell Line	ATCC	CCL-81
Zika viral strain PRVABC59	Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6	Peprotech	200-06
IL-1 alpha	Peprotech	200-01A
TNF-alpha	Peprotech	300-01A
Interferon alpha A	R & D Systems	11100-1
Interferon beta	Peprotech	300-02BC
Interferon gamma	Peprotech	300-02
Centrifuge 5415R	Eppendorf	5415R
Centrifuge 5810R	Eppendorf	5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI	Nikon	Visit Nikon for Request