Síntese e Caracterização de um pró-fármaco Aspirina-fumarato que inibe a actividade NFkB e da mama câncer de células estaminais

Resumo

This procedure will demonstrate how we synthesized and characterized the anti-NFκB and anti-cancer stem cell activity of an aspirin-fumarate prodrug.

Resumo

A inflamação é uma característica marcante do câncer que está subjacente a incidência de câncer e promoção e progressão, eventualmente, para metástase. Portanto, a adição de uma droga anti-inflamatória a regimentos de câncer padrão podem melhorar o resultado paciente. Um tal medicamento, a aspirina (ácido acetilsalicílico, ASA), tem sido explorada para a quimioprevenção do cancro e actividade anti-tumoral. Além de inibir o eixo 2-prostaglandina ciclooxigenase, actividades anti-câncer da ASA também têm sido atribuídas ao fator nuclear ĸB (NFĸB) inibição. Porque o uso ASA prolongado pode causar toxicidade gastrointestinal, uma estratégia pró-fármaco foi implementado com sucesso. Neste prodroga conceber o ácido carboxílico de ASA é mascarado e farmacóforos adicionais são incorporados.

Este protocolo descreve a forma como um pró-fármaco sintetizado aspirina-fumarato, GTCpFE, e caracteriza-se a sua inibição da via NFĸB em células de cancro da mama e cancro da atenuação da haste do tipo adequadolaços, um importante fenótipo NFĸB-dependente. GTCpFE inibe eficazmente a via NFĸB em linhas celulares de cancro de mama, a ASA não possui qualquer actividade inibidora, indicando que a adição de fumarato de estrutura ASA contribui de forma significativa para a sua actividade. Além disso, GTCpFE mostra a atividade de células-tronco anti-câncer significativa, bloqueando a formação mammosphere e atenuando a CD44 associado com células-tronco do câncer ⁺ CD24 ^- imunofenotipagem. Estes resultados estabelecem uma estratégia viável para desenvolver melhores medicamentos anti-inflamatórios para quimioprevenção e terapia do cancro.

Introdução

A inflamação é uma característica que subjaz múltiplos aspectos da tumorigénese, tais como incidência e promoção e progressão, eventualmente, para a metástase ^1. No cancro da mama, este é ainda apoiada por observações epidemiológicas que mostram que o uso regular da aspirina não-esteróides anti-inflamatórios clássica de drogas (ácido acetilsalicílico, ASA) está associada a uma redução tanto da incidência do cancro da mama, eo risco de metástases e recidiva ^2,3. ASA actua principalmente por inibição da actividade da ciclo-oxigenase-2, que é frequentemente sobre-regulada no cancro da mama ^4,5. No entanto, os efeitos anti-cancro de ASA pode também ser mediada por supressão aberrante factor nuclear kB (NFkB) de sinalização ^6-8. Isto é importante porque uma via NFkB desregulada promove a sobrevivência de células de tumor, proliferação, migração, invasão, angiogénese, e resistência à terapia ^9-11. NFkB activação da via também é crítico para a montagemuma resposta imune. Por conseguinte, para a terapia anti-cancro em que é necessária a inibição de NFkB prolongado, devem ser considerados os efeitos secundários prejudiciais que envolvem supressão imunológica de longa duração. Assim, ASA pode servir como um bom ponto de partida para otimização terapêutica.

Uma limitação para a aplicação ASA na terapia do cancro é a doses elevadas requeridas para a inibição da ciclo-oxigenase 2 e NFkB, que estão associadas com toxicidade gastrointestinal, tais como úlceras e hemorragias gástricas ^12,13. No entanto, a conversão de pró-fármaco como ASA em éster, podem reduzir a toxicidade gastrointestinal do ASA. Para aumentar ainda mais a potência e / ou adicionar funcionalidade, elementos estruturais adicionais ou auxiliares farmacóforos, também podem ser incorporados na concepção éster pró-droga. Um tal farmacóforo adicionado para aumentar a potência contra o ASA via NFkB é o fumarato, que demonstraram anteriormente ser importante para a inibição da via de NFkB ^14,15.

Nós sintetizado um pró-fármaco aspirina-fumarato ^15, GTCpFE, e levantaram a hipótese de que essa molécula híbrida seria seguro ainda potente contra a via NFkB. Testamos a sua actividade anti-NFkB em células de câncer de mama e sua capacidade de bloquear as células-tronco do câncer de mama (CSCs) ^15, que dependem de NFkB sinalização para a sobrevivência e crescimento ^16-21. Nós descobrimos que a potência de GTCpFE contra a via NFkB é significativamente melhorado em relação ASA ^15. Além disso, os blocos GTCpFE formação mammosphere e atenua a CSC marcador de superfície CD44 ⁺ CD24 ^- imunofenotipagem, indicando que GTCpFE é capaz de erradicar CSCs ^15. Estes resultados estabelecem o pró-fármaco a aspirina-fumarato como um agente anti-inflamatório eficaz que também pode ter como alvo CSCs de mama. Em termos de terapia do cancro da mama, GTCpFE pode ter o potencial para tratar a doença agressiva e mortal.

Protocolo

1. Síntese de Pró-fármaco A aspirina-fumarato GTCpFE

1. Utilizando uma seringa de êmbolo de plástico, medir 0,81 ml (20 mmol) de metanol e misturá-lo em água (10 ml) num balão de fundo redondo. Arrefece-se a mistura resultante a 0 ° C, colocando o frasco num banho de gelo-água. Adicionar o álcool 4-hidroxibenzílico (2,48 mg, 20 mmol) e agita-se a mistura reaccional até a solução ficar clara.
2. Prepara-se uma solução de cloreto de o -acetylsalicyloyl (3,77 mg, 19 mmol) em tolueno anidro (10 ml) por pesagem da quantidade desejada de cloreto de o -acetylsalicyloyl e dissolvendo-o no solvente, num frasco separado. Utilizando uma seringa de êmbolo de plástico, adicionar esta solução à mistura preparada no passo 1.1, e deixar a reacção agitar a 0 ° C.
3. Monitorizar a reacção por cromatografia em camada fina (TLC). As placas de TLC de sílica deve ter como fase estacionária.
   1. Prepara-se uma fase móvel composta de 20:80 acetato de etilo (AcOEt) / hexano. Numa câmara de TLC(Ou pequeno recipiente) adicionam-se 5 ml de fase móvel para cobrir a parte inferior da câmara.
      NOTA: A quantidade de fase móvel depende da câmara seleccionada. Sempre adicionar o suficiente para cobrir o fundo, mas uma vez que o TLC é colocado dentro, a linha de solvente não deve ultrapassar a altura em que os compostos são vistos.
   2. Retirar uma amostra de reacção com uma seringa (0,2 mL), coloque-o num pequeno vaso de reacção e diluir com acetato de etilo (2-3 gotas). Com um removedor de TLC, tomar cuidadosamente uma amostra da mistura da reacção diluída e identificá-lo no TLC.
      NOTA: As manchas devem ser de 1-2 mm e isso deve ser feito pelo menor de 1/4 de polegada da placa de TLC.
   3. No mesmo TLC, colocar um local de uma solução de cloreto de O-acetilsaliciloílo (0,2 mg em 0,5 ml de acetato de etilo) como uma comparação. Uma vez que os pontos estão secos, coloque-o na câmara e deixá-lo correr até a frente do solvente quase alcançou o topo do TLC.
   4. Leve o TLC para fora, deixe secar e visualizá-lo sob uma lâmpada UV. a reacção está completa quando o ponto de cloreto de ó -acetylsalicyloyl desaparece a partir da mistura de reacção.
   5. Quando a reacção está completa, remover o banho de gelo-água, e deixar a reacção a agitar à temperatura ambiente durante 20 h.
4. Filtra-se o precipitado utilizando um funil de Buchner com um disco de vidro sinterizado de porosidade média. Colocar o sólido num frasco de cintilação, e deixar o composto em vácuo durante a noite num exsicador à temperatura ambiente. Use pentóxido de fósforo (P ₂ O ₅₎ como o dessecante.
5. Seca-se um balão de fundo redondo, colocando-o num forno a 80 ° C durante pelo menos dois dias antes de configurar esta reacção. Alternativamente, vedar o balão com um septo e furar com uma agulha que está ligada a um sistema de bomba de vácuo. Ligar a bomba de vácuo ligada e secar o frasco usando uma pistola de calor. Deixe esfriar, e repita esta etapa mais 2 vezes.
6. Inflar um balão com gás argônio, e ligá-lo a uma seringa de plástico (cujo h êmbolocomo foi removido), com uma agulha. Desligar a bomba de vácuo e remover a agulha a ela ligada que foi introduzido no balão de fundo redondo seco agora. Inserir a agulha ligada ao balão de árgon através do septo de selagem do frasco de fundo redondo.
   1. Adicionar éster 4-hidroximetilfenol de 2-acetyloxybenzoic ácido (100 mg, 0,349 mmol), 4-dimetilaminopiridina (4 mg, 0,033 mmol) e trietilamina (53 mg, 0,523 mmol) a um frasco separado, em seguida, dissolveu-os em tetra-hidrofurano anidro (5 ml). Com uma seringa de plástico ligada a uma agulha, adicionar esta solução para o balão de fundo redondo selado. Arrefece-se a mistura até 0 ° C, colocando o frasco num banho de água gelada.
7. À mistura anterior, adicionar uma solução de cloreto de etil-fumaroyl (68 mg, 0,419 mmol) em tetra-hidrofurano anidro (5 ml), gota a gota, ao longo de um período de 10 min. Agita-se a solução resultante a 0-5 ° C durante 2-4 h.
8. Extrai-se a mistura de reacção com acetato de etilo (100 ml) e salmoura (50 ml).
   NOTA: A salmoura é uma solução saturada de cloreto de sódio (NaCl). Para preparar, colocar 200 ml de água num recipiente de vidro limpo, em seguida, iniciar a adição de NaCl (enquanto se agitava) até que não se dissolve mais.
   1. Após extracção, remover a fase aquosa e repetir o último passo mais duas vezes.
   2. Seca-se a mistura por adição de sulfato de sódio à fase orgânica, até que o sólido não se acumular-se quando o material de vidro é agitada. Usando um outro funil de Buchner com um disco de material vítreo, filtrar a mistura para um balão de fundo redondo para remover o sulfato de sódio, depois evapora-se até à secura utilizando um evaporador rotativo, com a temperatura fixada em 40 ° C.
9. Usando uma CCF, determinar uma fase móvel adequada para utilizar em cromatografia de coluna.
   NOTA: Para este experimento foi utilizado um gradiente de 20:80 AcOEt / hexano.
10. Prepara-se uma coluna com gel de sílica e a fase de solvente apropriado. Uma vez que o composto foi adicionado, adicionar uma camada de sulfato de sódio (ou areia) para protect a coluna como o solvente é adicionado.
    1. À medida que a coluna é executado, monitorar o eluato por CCF. Identificar todos os outros tubo de ensaio como eles são recolhidos a partir da coluna. Quando o produto de interesse é eluído, misturar todas as amostras que continham o produto puro num grande frasco de fundo redondo, e secá-las utilizando um evaporador rotativo com a temperatura do banho para 40 ° C.
       NOTA: o produto deverá aparecer como um sólido branco.
11. Para confirmar a estrutura de GTCpFE, recolha de protões e de carbono ⁽¹ H e ¹³ C, respectivamente) os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN), conforme as instruções do fabricante.
    NOTA: Neste estudo a 400 MHz FT NMR espectrômetro foi usada para recolher o ¹ H e C espectros ^13. Executar pelo menos 25 scans à temperatura ambiente para se obter a resolução dos dados suficiente. Os picos de RMN foram observados os seguintes, ¹ H RMN (CDCl _3): δ 1,29 (t, 3 H, 3 J = 7,0 Hz, CH _3); 2,31 (s, 3H, _CH3); 4,26 (q, 2 H, 3J = 7,0 Hz, _COOCH2); 5,25 (s, 2 H, _OCH2); 6,89 (s, 2 H, HC = CH); 7,19 (m, 3 H, Ar); 7,42 (m, 3 H, Ar); 7,65 (m, 1 H, Ar); 8,22 (dd, 1 H, 3 J = 7,8, 4J = 1,2 Hz, Ar). ¹³ C RMN (CDCl _3)?: 169,70, 164,86, 164,75, 162,89, 151,28, 150,69, 134,76, 134,32, 133,26, 133,16, 132,25, 129,81, 126,26, 124,11, 122,47, 122,04, 66,40, 61,43, 21,05, 14,15.
12. Além disso, recolher um espectro de massa de alta resolução utilizando espectrometria de massa de cromatografia líquida em combinação com armadilha de iões e de tempo de voo da tecnologia (LCMS-TI-TOF) para medições de massa precisas, conforme as instruções do fabricante.
    NOTA: Neste estudo (M + NH ₄ ^+), calculado: 430,1496; observado: 430,1477.

2. GTCPFE inibe a atividade NFĸB em células de cancro da mama

1. Condições de cultura celular
   1. Manter linhas celulares de cancro da mama humano, MCF-7 e MDA-MB-231 de acordo com Cul de células padrãoture técnicas e propagar numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO _2.
      1. Prepare meio de células MCF-7 de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 com vermelho de fenol suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), aminoácidos não essenciais 1%, 2 mM de L-glutamina, 1% de antibióticos penicilina-estreptomicina e 6 ng / ml de insulina. Prepare meio de células MDA-MB-231 a partir melhorada Meio Essencial Mínimo (IMEM) suplementado com 5% de FBS, aminoácidos não essenciais 1%, 2 mM de L-glutamina, e 1% de antibióticos penicilina-estreptomicina.
2. NFkB-RE Ensaio de Luciferase Reporter
   1. Tripsinizar de cancro da mama MCF-7 células usando tripsina a 0,25% durante 5 min a 37 ° C, contar manualmente utilizando um hemocitómetro e as sementes em placas de 24 poços a 90.000 células por densidade bem.
   2. As seguintes células dia, co-transfectar com DNA de plasmídeo de um elemento de resposta a NFkB (NFkB-RE) constructo de luciferase, 1 ug / poço, along com o promotor de Renilla constructo de luciferase, 0,2 ug / poço. Realizar transfecções para cada grupo de tratamento em triplicado.
      1. Lavar as células duas vezes com PBS, e incubar com as misturas de ADN de plasmídeo e 1 ul por poço de reagente de transfecção (por exemplo, lipofectamina) em meio isento de soro. Após 6 h, alterar a forma de 1 ml de meio normal (sem a penicilina e antibióticos de estreptomicina).
   3. Após 16 horas, adicionar 1 ml de veículo ou diferentes soluções estoque do GTCpFE ou drogas ASA para cada poço. Dissolve-se soluções de reserva de fármaco (100, 50, 20, 10 e 1 mM) em sulfóxido de dimetilo na concentração de 1.000X. Após a adição dos fármacos, incubar as células durante 2 horas a 37 ° C.
   4. Para activar a via de NFkB, adicionar a citoquina pro-inflamatória TNF (10 ng / ml de solução) para cada poço para uma concentração final de 10 ng / ml e incubar durante 4 horas. Incluir um sozinho TNFa controle. Aspirar o meio e armazenar a células à temperatura de -80 ° C.
   5. Medida da luciferase utilizando um sistema de ensaio de repórter de luciferase de acordo com as instruções do fabricante.
      Nota: Quando se utiliza o sistema de ensaio de luciferase (por exemplo, sistema de ensaio de luciferase duplo), pela primeira vez, preparar uma solução de reagente de ensaio de luciferase por re-suspende-lo em 10 ml de tampão e armazená-lo a -80 ° C em alíquotas de 1 ml.
      1. Prepare tampão de lise 1x por diluição de tampão de 5x com água. Lisar as células em cada poço usando 100 ul de tampão de lise 1x. Incubam-se as placas num agitador orbital durante 15 min, a uma velocidade média.
      2. Rotular um tubo de 1,5 ml por amostra. Thaw reagente de ensaio de luciferase à temperatura ambiente (50 ul por amostra será necessário) e manter-se na folha. Prepare 1x reagente de extinção em um frasco de vidro, 1:49 em tampão de diluição e de vórtice que (serão necessários 50 ul por amostra).
      3. Adicionar 10 ul de lisado de células para um tubo de microcentrífuga rotulado. Em seguida, adicionar 50 ul de reagente de ensaio de luciferase egentilmente vortex. Imediatamente depois, colocar o tubo num suporte e medir a luminescência da luciferase por meio do programa de dupla no luminómetro. Selecione e pressione o seguinte: Execute Promega Protocolos → dupla Glo → OK.
      4. Adicionam-se 50 ul do reagente de extinção para o tubo de ensaio e suavemente vórtice. Medir a luminescência. Repita essas etapas para cada amostra.
      5. Analisar dados usando planilha normalizando NFkB-RE ao controle interno Renilla (NFkB-RE / Renilla). Compare inibidores de dados para o único controle TNF (TNF só é fixado a 100%).
3. NFkB-alvo transcrição do gene
   1. Semente de células MCF-7 em placas de 6 poços a 250.000 células por poço em 2 ml de volume de meio preparado tal como descrito na secção 2.1.
   2. No dia seguinte, adicionar 2 ul de diferentes GTCpFE 1000X existências (100, 50, 20, 10 e 1 mM) durante 2 h antes da adição de TNFa 10 ng / ml durante mais 2 horas. Executar a cada tratamentoem triplicado. Incluir veículo e TNFa sozinho controlos.
   3. Isolar o ARN usando o método de extracção tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio de acordo com as instruções do fabricante ^22. Determinar a concentração de RNA (em dietilpirocarbonato (DEPC) de água tenha sido tratada com) e pureza RNA usando um espectrofotômetro. Manter as amostras de RNA no gelo ou armazenar a -80 ° C. Utilizar apenas pontas de barreira livre de RNase ao manusear RNA.
   4. Realizar a transcrição reversa de 0,5 ug de ARN total utilizando um estojo comercialmente disponível de Moloney vírus da leucemia murina (M-MLV) de transcriptase reversa.
      NOTA: O kit inclui 5x tampão e ditiotreitol (DTT), em conjunto com uma mistura de dNTP, e mistura de hexâmeros aleatórios.
      1. Adicionar 0,5 ug de ARN de 200 unidades de M-MLV, dNTP 0,5 mM, 100 ng de hexâmeros aleatórios, DTT 10 mM, 1x tampão e água DEPC para um volume final de reacção de 10 uL. Efectua-se a reacção de transcriptase reversa usando um ciclador de PCR durante 50 min a 37 ° C, e, em seguida, 15 min a 70 &# 176; C a aquecer-inactivar a enzima.
   5. Dilui-se o produto de ADNc resultante para 100 ul com água duplamente destilada e usar 2 ul de cada reacção subsequente reacção em cadeia da polimerase quantitativa (PCR).
      1. Misture a frente e reverso iniciadores para o gene de interesse na concentração de 1,25 ^ M cada. Preparar um master mix com 2 mL de água bidestilada, 1 ml de 1,25 mM mistura de iniciadores e 5 ul de 2x do corante para permitir a detecção do DNA de cadeia dupla. Carregar os 2 ul de ADNc e 8 ul de mistura principal em placas de 96 poços de PCR.
   6. Realizar PCR quantitativo utilizando um sistema de PCR em tempo real (40 ciclos, 95-60 ° C) de acordo com as instruções do fabricante e analisar os dados manualmente.
      NOTA: Todos os iniciadores de PCR utilizados foram validados e relatado anteriormente ^23.
   7. Calcular mudança vezes a expressão do gene utilizando o método de folha de cálculo através ΔΔCt, com a proteína ribossómica 36MRNA B4 servindo como controle interno ^23.

3. GTCpFE inibe as células-tronco do cancro da mama In Vitro

1. Mammosphere ensaio de formação de
   1. Prepare mammosphere média (MS), completando de Dulbecco Modified Eagle Médium: Mistura Nutriente F-12 (DMEM / F12) fenol meio isento de vermelho com 1% de metilcelulose. Deixa-se dissolver por agitação suave durante a noite a 4 ° C. Filtrar esterilizar a forma e completar com B27 1x, 1% de penicilina e estreptomicina, 5 ug / ml de insulina, 1 ug / ml de hidrocortisona, factor de crescimento epidérmico e 20 ng / mL de recombinante humana.
   2. Preparar células isoladas de linha celular MDA-MB-231 por digestão com tripsina (tripsina a 0,25% durante 5 min a 37 ° C) de culturas em monocamada e filtrar através de peneiros de malha. contar manualmente células dissociadas único e placa em placas de 96 poços de ultra-baixas de fixação a uma densidade de 400 células / poço. No dia seguinte, adicionar diferentes concentrações de GTCPFe (por exemplo, concentrações finais GTCpFE: 1, 10, 20, 50 ^ M) para um volume final é de 100 uL. Realizar todos os tratamentos em triplicado.
   3. Após 7 dias de cultura na incubadora, aquisição de imagens por meio de um software de imagens usando um microscópio invertido. contar manualmente o número MS> 75 m de diâmetro. Compare o tratamento medicamentoso para o controle do veículo.
      NOTA: O diâmetro das MS> 75 uM é determinado usando o software de imagem.
2. CD44 ⁺ CD24 ^- CSC Imunofenótipo
   1. Tripsinizar as células MDA-MB-231 com 0,25% de tripsina durante 5 min a 37 ° C. Contagem usando um hemocitômetro e da semente em placas de 10 cm em 3 milhões de células por prato em 10 ml de meio, como descrito na secção 2.1. Adicionar veículo (10 uL dimetil sulfóxido) ou GTCpFE (10 ul de estoque de 50 mM) às células durante 72 h.
   2. Para os grupos de veículos ou de tratamento GTCpFE, Trypsinize células (como no passo 3.2.1) e distribuir 1 milhão de células em 'Test & #39; ou "controle" 5 ml tubos de poliestireno contendo 2 ml de solução salina equilibrada de 1x Hank (HBSS) tampão suplementado com 2% FBS.
   3. Para manchar para o CD44 marcadores de superfície e CD24, as células girar e adicionar 20 mL de cada anticorpo conjugado e HBSS + 2% FBS para tubos de ensaio para um final de 100 ul volume total (diluição 1: 5). Adiciona-se 100 uL de HBSS + 2% FBS para abrange os tubos. Incluir anticorpo CD44-APC conjugada e anticorpo CD24-PE controles mancha simples ou os controles immunoisotype IgG.
   4. Incubar as células no escuro a 4 ° C durante 30 min. Girar as células durante 5 min a 400 xg e reconstituir em 200 ul de tampão de HBSS com 2% de FBS. Manter as células em gelo no escuro.
   5. Executar a classificação de células activadas por fluorescência (FACS) de células vivas utilizando um instrumento analisador de FACS de acordo com as instruções do fabricante. Colete pelo menos 50.000 eventos para cada tubo. tratamentos executados em triplicado.
      NOTA: Gating é baseada em controles de nenhuma mancha (Cotubo ntrol), immunoisotypes IgG, eo CD44-APC e manchas individuais CD24-PE.
   6. Analisar dados usando um software citometria de fluxo disponível.
      NOTA: A percentagem de células-tratados GTCpFE com o CD44 ⁺ CD24 ^- imunofenotipagem é estimado e comparado com o controle do veículo.

Resultados

Na Figura 1, a estrutura química do pró-fármaco a aspirina-fumarato, GTCpFE, e a sua actividade inibitória sobre a citocina induzida NFĸB via em células de cancro da mama são indicados. GTCpFE inibe ambos os pontos finais NFĸB, NFĸB-RE actividade da luciferase (Figura 1B) e a expressão de genes alvo NFĸB, tais como a molécula de adesão intercelular 1 (ICAM1), quimiocina CC Motivo ligando 2 (CCL2), e Factor de Necrose Tumoral (TNF) (F...

Discussão

In this protocol, we demonstrated the synthesis of an ASA prodrug, GTCpFE, where the fumarate pharmacophore was incorporated to improve the anti-NFĸB activity in breast cancer cells. GTCpFE is an effective NFĸB inhibitor, whereas ASA itself is not, even at much higher concentrations. The fumarate moiety has anti-inflammatory properties as shown by its ability to inhibit NFĸB signaling in a variety of cell lines and tissues^14,25-29. The prodrug strategy described herein, is amendable to other mal...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 Red Medium	Life Technologies	11875-093	Warm up to 37 °C before use
IMEM	Corning	10-024-CV	Warm up to 37 °C before use
DMEM / F12 Medium	ThermoFisher	21041-025	Warm up to 37 °C before use
MEM NEAA 10 mM 100x	Life Technologies	11140
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140-122
L-Glutamine 100x	Life Technologies	25030-081
Insulin	Sigma-Aldrich	I-1882
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Trypsin 2.5% 10x	Invitrogen	15090046
Methyl Cellulose	Sigma	M0262
B27 Supplement 50x	Gibco	17504-044
EGF	Gibco	PHG0311L
NFκB-RE Luciferase Construct	Clontech	pGL4.32
Renilla Luciferase Construct	Promega	pGL4.70
Lipofectamine 2000	ThermoFisher	11668-019
Dual-Luciferase Reporter Assay	Promega	120000032
NanoDrop Spectrophotometer	ThermoFisher
Eppendorf Mastercycler	Eppendorf
StepOne Real Time PCR System	Thermo Scientific
Eclipse Microscope	Nikon
CyAn ADP Analyzer	Beckman Coulter
QCapture Software	QImaging
Summit Software	Beckman Coulter
GraphPad Software	Prism
TRIzol	ThermoFisher	15596-018
M-MLV Reverse Transcriptase	Invitrogen	28025-013
100 mM dNTP Set	Invitrogen	10297-018
Random Hexamers	Invitrogen	48190-011
Fast SYBR Green Master Mix	ThermoFisher	4385612
Costar 96W, ultra low attachment	Corning	3474
HBSS, 1x	ThermoFisher	14025134
CD44-APC conjugated antibody	BD Pharmingen	560990	Store at 4 °C, protect from light
CD24-PE antibody	BD Pharmingen	560991	Store at 4 °C, protect from light
Recombinant Human TNFα	Fisher	210TA100
CCL2 Primer Forward Sequence			AGAATCACCAGCAGCAAGTGTCC
CCL2 Primer Reverse Sequence			TCCTGAACCCACTTCTGCTTGG
ICAM1 Primer Reverse Sequence			TGACGAAGCCAGAGGTCTCAG
ICAM1 Primer Forward Sequence			AGCGTCACCTTGGCTCTAGG
TNF Primer Forward Sequence			AAGGGTGACCGACTCAGCG
TNF Primer Reverse Sequence			ATCCCAAAGTAGACCTGCCCA
36B4 Primer Forward Sequence			GTGTTCGACAATGGCAGCAT
36B4 Primer Reverse Sequence			GACACCCTCCAGGAAGCGA
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881-500G
4-Hydroxybenzyl Alcohol	Sigma-Aldrich	20806-10G
O-Acetylsalicyloyl Chloride	Sigma-Aldrich	165190-5G
Phosphorous Pentoxide	Sigma-Aldrich	79610-100G
Ethyl Fumaroyl Chloride	Sigma-Aldrich	669695-1G
Sodium Sulfate	Sigma-Aldrich	246980-500G
4-Dimethylaminopyridine	Sigma-Aldrich	714844-100ML	0.5 M in tetrahydrofuran
Triethylamine	Sigma-Aldrich	T0886-100ML
Toluene	Sigma-Aldrich	244511-100ML
Ethyl Acetate	Sigma-Aldrich	270989-100ML
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	401757-2L
400 MHz FT NMR spectrometer			See Bruker’s Avance User’s Manual, version 000822 for details