SILAC Based proteômica Caracterização de exossomas de HIV-1 células infectadas

Resumo

Aqui, nós descrevemos um método proteómica quantitativa utilizando a técnica de marcação por isótopos estáveis ​​aminoácidos em cultura de células (SILAC) para analisar os efeitos da infecção por HIV-1 em proteomas exosomal hospedeiro. Este protocolo pode ser facilmente adaptado a diferentes células sob condições de stress ou infecções.

Resumo

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Introdução

Muitas doenças humanas, incluindo infecções virais, estão muitas vezes associados com os processos celulares distintos que ocorrem e em torno das células afectadas. Proteínas, muitas vezes agindo como os efetores celulares finais, mediar estes processos. Análise das proteínas muitas vezes pode fornecer informações valiosas quanto ao ambiente local das células afetadas e ajudar-nos a compreender o mecanismo subjacente da patogênese da doença. Entre as várias técnicas de análise de proteínas, proteômica detém particularmente grande promessa. Como uma ferramenta poderosa, em larga escala, proteómica pode fornecer uma compreensão sistémica de processos celulares, particularmente na área da função e da interacção de proteínas. A análise de proteínas específicas é simplificada através do desenvolvimento de técnicas de marcação, que permitem que os investigadores para monitorar a expressão de componentes celulares, particularmente proteínas, no local da investigação. Embora muitas análises proteomic foram realizados em celularescala proteoma, caracterizações proteômicas em compartimentos subcelulares provaram ser particularmente informativa ^1. Isto é exemplificado bem nos estudos de infecção por HIV-1.

Exossomos, 30-100 vesículas de membrana nm secretadas por uma ampla gama de tipos de células ^{2, 3,} são componentes essenciais da comunicação intercelular e de transporte molecular. Eles foram previamente descoberto para desempenhar papéis importantes no processo de VIH-1 de brotamento ^{4, 5.} Ao combinar a análise proteômica com dissecção funcional, descobrimos que exossomos libertados de HIV-1 células infectadas são compostos de uma única e quantitativamente diferentes assinatura proteína e porto moléculas regulatórias que afetam propriedades celulares em células receptoras, incluindo apoptose e proliferação celular ⁶ vizinho. Os métodos são descritos neste protocolo,nomeadamente SILAC (rotulagem isótopo estável por aminoácidos de cultura de células) ⁷ com base caracterização proteomic de exossomas a partir do HIV-1 de células infectadas. Abordagens semelhantes podem ser aplicados para entender melhor outros compartimentos subcelulares durante patogênese ajustando o esforço experimental para o compartimento ou fracção de interesse específico e fazer as mudanças necessárias para os procedimentos descritos.

Dado o recente desenvolvimento de métodos de proteômica quantitativos, há muitos a escolher de ao selecionar o método mais eficiente para uma experiência particular. Entre eles estão os iTRAQ com base química (marcas isobáricos para a quantificação relativa e absoluta) ⁸ eo MRM livre-label (monitoramento de reações múltiplas) ⁹ técnicas. Ambos os métodos são ferramentas poderosas e são boas opções para configurações específicas. Para um laboratório típico trabalhando principalmente com linhas celulares, no entanto, estes dois métodos têm relativelY custos mais elevados e são mais demorado quando comparado com o método baseado SILAC. SILAC é uma técnica de marcação metabólica com base que incorpora formas isotópicas de aminoácidos não radioactivos de meios de cultura para as proteínas celulares. Tipicamente, as experiências SILAC começar com duas populações de células, por exemplo, infectados e não infectados. Cada um está marcado diferencialmente em seu ambiente isotópica específica até rotulagem completa seja alcançada. Os exossomas marcados destas células são então submetidas a extracção de proteínas. Uma vez extraído, as proteínas marcadas são exosomal analisadas utilizando espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida ^10. Finalmente, os resultados de espectrometria de massa e as proteínas marcadas são significativamente submetido a análise estatística e bioinformática, bem como para a verificação bioquímica rigorosa. Nossos relatórios de investigação anteriores sugerem que os procedimentos SILAC / exossomo são mais apropriadas para linhas de células do que as células primárias, como linhas celulares são geralmente em umestado de proliferação ativa de marcação isotópica eficiente,

Protocolo

1. Cultura celular e infecção HIV-1

NOTA: Antes de iniciar experimentos, recomenda-se verificar a viabilidade das células através de coloração com Trypan Blue ¹¹ e sua proliferação através de um ensaio de MTT ^12. Também é fundamental para usar o meio SILAC recém-preparado. Várias linhas de células podem ser utilizados, desde que eles se encontram numa fase activamente prolif erativa, e são susceptíveis a infecção por HIV-1, ou a condição de teste de escolha. Neste protocolo, utilize linha de células H9 como o exemplo.

1. Semente de 2 x 10 células H9 ⁶ em cada balão de cultura de células. Cresça um grupo em 10 ml rotulados meio RPMI 1640 contendo 10% de soro bovino fetal dialisado (FBS), 100 mg / L ¹³ C ₆ L-lisina e 100 mg / L ¹³ C ₆ ¹⁵ N ₄ L-arginina. Cresça o outro grupo não marcado em 10 ml de meio RPMI 1640, com 10% de FBS dialisado, 100 mg / l de L-lisina e 100 mg / l de L-arginina.
2. Crescer as células por seis duplicações da altura em que as proteínas das células no meio marcado são praticamente completamente marcadas (> 99%) com aminoácidos pesados. Adicionar meio fresco ou alterar meios regularmente (a cada 1-3 dias, dependendo do tipo de célula. Para células H9, mudança de meio cada 3 dias). No final de rotulagem, aumentar o volume de cultura (por exemplo, ~ 30 mL) para acomodar o crescimento de mais células.
   NOTA: Determinar célula exacto tempo de duplicação no início da experiência por meio da coloração com azul de tripano e contagem das células.
3. Infectar as células marcadas com o HIV-1 _NL4-3 utilizando padrão de HIV-1 do protocolo de infecção ^{de 13} durante 48 horas. Incubar as células com quantidades apropriadas de vírus com uma multiplicidade de infecção (MOI) em torno de 0,3. Verifique a infecção por HIV-1 por quantificação de p24 dos sobrenadantes de cultura utilizando um kit de antigénio p24 do VIH-1 ELISA. Executar um teste de imunofluorescência ¹⁴ para confirmar a infecção bem sucedida de células. Keep crescendo as células não marcadas não marcado em meio sem infecção VIH-1.
4. Colheita dos sobrenadantes de ambos os grupos no final da infecção (passo 2.1).

2. exossomo Isolamento

NOTA: Através de uma série de passos de ultracentrifugação, exosomal fracções de sobrenadantes de cultura são enriquecidas ^15. Executar todos os passos que se seguem a 4 ° C, com um rotor de ultracentrífuga que pode atingir uma velocidade de, pelo menos, 100.000 x g.

1. Recolhe-se os sobrenadantes das culturas em tubos cónicos de 50 ml, evitando células. Centrifugar as durante 10 minutos a 300 xg para remover as células restantes.
2. Recolhe-se os sobrenadantes em novos tubos de 50 ml e centrifugar cónicas-los durante 10 min a 2000 xg para remover as células mortas. Transferência resultante sobrenadantes para tubos comerciais de rotor-compatíveis que são capazes de resistir a ultracentrifugação.
3. Certifique-se de equilibrar os tubos de ultracentrífuga. Centrifugar os tubos durante 30 min a 10000 xg para removerDetritos celulares.
4. Recolher os sobrenadantes em tubos de ultracentrífuga e centrifugar por 70 minutos a 100.000 x g. Descartar o sobrenadante.
5. Ressuspender as ração rica em exossoma em 5 ml de PBS fresco. Transferir as soluções para tubos de ultracentrífuga frescos e centrifugar de novo durante 70 minutos a 100000 x g.
6. sobrenadantes de descarte. Para armazenar os exossomas a longo prazo, voltar a suspender as pelotas em 50 ul de PBS e armazenar a -80 ° C. Alternativamente, vá diretamente para a extração de proteínas, como mostrado abaixo.

3. Extração de Proteínas e Preparação

1. Dissolver pelotas exosomal isoladas em 100-200 ul RIPA lise e extração tampão com coquetéis inibidores da protease adicionados. O tampão é composto de Tris-cloridrato 25, cloreto de sódio 150 mM, 1% de NP-40, 1% desoxicolato de sódio, e 0,1% de SDS (dodecilsulfato de sódio), a pH 7,6. Os cocktails de inibidores da protease deverá conter uma variedade de inibidores de protease, tais como aprotinina, bestatina, leupeptin, pepstatina A e EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético), que pode inibir uma ampla gama de proteases.
2. Centrifugar as soluções dissolvidos durante 10 minutos a 13000 xg (4 ° C), e transferir os sobrenadantes para novos tubos compensados ​​microcentrífuga de 1,5 ml.
3. Quantificar a concentração de proteína de cada amostra de exossomos usando ácido bicincon�ico (BCA) ou um ensaio Bradford ^16.
4. Misturar uma quantidade igual de proteínas (2 ug) a partir de amostras marcadas e não marcadas e executar a mistura em partes iguais num gel de SDS-PAGE a 4-20%, a 120 mA / 200 V durante 30 min.
5. Gel mancha com Coomassie Blue seguido de descoloração ^17.
6. Usando uma lâmina de barbear, cortar a faixa amostra a partir do gel. Em seguida, corte a pista gel em 10-15 partes iguais. Colocar cada peça em um tubo de microcentrífuga de 1.5 ml fresco para um total de 10-15 tubos.
7. Imergir cubos em mM NH ₄ HCO ₃ 25 em 50% de acetonitrilo, vórtice, e descartar os sobrenadantes. Repita duas vezes. Secocubos em um concentrador de vácuo ^{18, 19.}
8. Reidratar cubos com ditiotreitol 10 mM (DTT), vortex e centrifugar brevemente. Incubar a 56 ° C durante 1 h. sobrenadante de descarte.
9. Mergulhe os cubos de gel em 55 mM de iodoacetamida, vortex e centrifugação. Incubar à temperatura ambiente no escuro durante 45 min. sobrenadante de descarte.
10. Mergulhe os cubos em 25 mM NH ₄ HCO _3, vortex, rotação, e descartar o sobrenadante.
11. Mergulhe os cubos em mM NH 25 ₄ HCO ₃ em 50% de acetonitrilo, vortex e centrifugação. Repetir 3,9 e 3,10.
12. Secam-se os cubos de um concentrador de vácuo. Adicionar tripsina modificada de grau de sequenciação de 25 uL em 25 mM NH ₄ HCO _3, incubar a 4 ° C durante 30 min, e descartar o excesso de solução. Imergir cubos em mM NH ₄ HCO ₃ 25 sem tripsina, e incubar durante a noite a 37 ° C.
13. Resumidamente girar cubos para baixo e transferir o péptido resultante adicionalCT para um novo tubo. Adicionar 30 ul de ácido fórmico a 5% em acetonitrilo a 50% para os cubos, vortex durante 30 min, e centrifugação. Combinar o sobrenadante com o extracto. Secam-se os extractos de péptido com um concentrador de vácuo a menos de 5 ul.
14. Enviar amostras para instalação de núcleo de espectrometria de massa para análise LC-MS / MS. A análise de dados MS, que pode ser gerada a partir de software de código aberto, geralmente inclui um número de registo para cada proteína identificada, rotulados rácios / não marcados eo número de péptidos únicos identificados.

4. Verificação Western Blotting

NOTA: Western blotting é recomendado para verificar os resultados de espectrometria de massa.

1. Siga os protocolos de mancha ocidental padrão e garantir que as quantidades iguais de proteína de cada grupo são carregados. Use anticorpos contra as proteínas de interesse (por exemplo, anexina A5, cadeia B da lactato desidrogenase) identificados por MS. detecção de transferência de Western, juntamente com Analysi densitometrias, pode reafirmar que a identificação de proteínas MS e quantificação estão corretas.

5. Análise de Dados proteômica

NOTA: A avaliação de qualidade de dados, pré-tratamento de dados, cálculo e determinação de candidatos significativas de proteínas são feitas separadamente para cada MS replicar. Uma vez que análises anteriores são concluídas, os dados analisados de repetições são comparados e combinados ^{6, 20, 21.}

1. Avaliar a qualidade dos dados de MS.
   1. Em primeiro lugar, LOG2 transformar o SILAC-MS rotulados / rácios não marcados de proteínas quantificados em um programa de planilha.
   2. Na elaboração de gráficos científicos e software estatístico, o grupo dos rácios em 40-100 lixeiras razão e traçar o número de rácios por bin para gerar um histograma. A distribuição normal dos histograma indica boa qualidade de dados MS ^6. Faça este passo para todos os MS replica.
2. Para aumentar a confiança e precisão dos rácios de peptídeos MS, considere remover proteínas que têm menos de dois peptídeos quantificados.
3. Para determinar os candidatos de proteína significativamente cima e para baixo-regulado, utilize os seguintes passos para calcular limiares de importância ^22.
   1. Na elaboração de gráficos científica e de software estatístico, gerar uma regressão não-linear ou de ajuste de curva para os dados da distribuição de frequência. Esta etapa produz valores que podem ser usados ​​para calcular os valores de corte. Calcular os valores de corte em mediana ± 1,96 σ para os limites de confiança de 95% ou 2,56 σ para os limites de confiança de 99%.
      NOTA: Os detalhes específicos do cálculo dos cortes pode ser encontrada em Emmott et al. ^22.
   2. Selecionar os candidatos de proteínas cujas proporções são ou maior que 1,96 (ou 2,56) desvios padrão acima da mediana (sobre-expressos de forma significativa) ou menor que 1,96 (ou 2,56) desvios padrão abaixo da mediana (significativamente sub-expresso).
4. Compare as repetições dos candidatos significativas acima identificado para atingir a consistência. Garantir que cumpram os seguintes critérios para passar esta etapa de seleção final: os candidatos devem ser consistentemente identificados em todas as repetições; e repetições de um candidato deve ser coerente com a sua direcção de regulação (de preferência, pelo menos, 2 de 3 repetições de um candidato deve ser ou regulado para cima ou para baixo-regulado).
5. Finalize dados para os candidatos que preencham os critérios acima mencionados pela fusão dos dados dos seus repetições.

6. Bioinformatics Verificação e Caracterização

NOTA: As informações existentes genômica e bioinformática oferece uma riqueza de informações para quase todas as proteínas. A mineração de dados e análise bioinformática em que a informação pode ajudar na obtenção de uma grande quantidade de insights sobre a propriedade e as funções dos candidatos significativos. este process é normalmente necessário para projetar adequados a jusante experimentos wet-lab.

1. Usando seus números de acesso do GenBank ou IDs UniProt, pesquisa nos candidatos em bancos de dados exossomo correntes (Exocarta ^23, Evpedia ²⁴⁾ para verificar se as proteínas candidatas tenham sido previamente encontrado em exosome. Esta etapa adiciona uma camada de confiança de que os candidatos são, de facto, em exossomos.
   1. http://www.exocarta.org/ Access, clique em "Consulta" e de entrada ou o nome / número de adesão gene ou proteína. A página de resumo aparecerá e as provas em exosome será mostrado, desde se houver qualquer.
2. Pesquisa os candidatos contra o HIV-1 e a proteína humana interação com o banco ^25. Em alternativa, procure os bancos de dados específicos que podem fornecer informações sobre a interação das proteínas candidatos e a condição de teste.
   1. Acessar o banco de dados no www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInterações. Na data de entrada 'nome de domínio de proteína ", digite os nomes dos candidatos ou números de acesso e clique em pesquisar. Os resultados da pesquisa podem fornecer informações sobre as interações entre o HIV-1 e os candidatos de proteína, e sugerir qual dos candidatos pode ser verdadeiramente HIV-1 associado.
3. Import GenBank números de adesão, ou UniProt IDs dos candidatos em software de análise de GO (como FunRich, enriquecimento funcional ferramenta de análise ²⁶⁾ e execute o software.
   1. Faça o download do software no http://www.funrich.org/. Após a instalação, abra o software, em análise enriquecimento, clique em "Adicionar conjunto de dados", e fazer o upload da lista de proteína / genes. Em seguida, selecione o tipo de gráfico para visualizar a análise GO.
      Observação: Vá resultados da análise serão visualizados na forma de gráficos de pizza. Este passo nos ajuda a ter uma visão global de associados com os candidatos nas áreas de Processo Biológico (BP), Cellular Componente (CC), e função molecular (MF).
4. Acesso DAVID em http://david.ncifcrf.gov/ ^27, clique no botão "ferramenta de anotação funcional" em seu site. Digite a lista de candidatos, selecionar o "Identificador" do gene, tais como o "UniProt ID", selecione "Lista de Gene" e pesquisa. Os termos enriquecidos GO, p-valores e outros parâmetros podem ser encontrados clicando na página "Resumo de anotação Resultados" na categoria "Gene_Ontology".
5. Para investigar possíveis interações dos candidatos com outras proteínas, usar banco de dados STRING abertamente acessíveis ²⁸ para elucidar interações proteína-proteína potenciais e possíveis vias bioquímicas.
   NOTA: GO Análise e anotação funcional (Seção 6,3-6,4) também pode ser realizada utilizando o software mais recente STRING.
   1. Acessar o banco de dados no http://string-db.org/. Introduza o ID proteína ou sequência para as s designadoscaixa de earch e selecionar as espécies corretas para análise. Clique em "Procurar". Os resultados lhe dará informações sobre ambas as associações diretas (físicas) e indiretos (funcionais). Os dez melhores jogos conhecidos para o candidato exosomal será exibido e deve ser considerado para seleção de candidatos significativo.
      NOTA: uma grande quantidade de informação associada com os candidatos podem ser analisados ​​usando as etapas acima. Os candidatos mais significativos podem ser escolhidos para posterior análise molecular e bioquímica a jusante.

Resultados

Figura 1A é um fluxograma descrevendo o procedimento de marcação SILAC ^21. A fim de purificar os exossomos, as amostras devem ser girado para baixo através de centrifugação. A Figura 1B mostra os passos de purificação exossomo por ultracentrifugação de série ^21. Uma vez purificado, os exossomas estão sujeitas a análise proteomic experimental tal como descrito no procedimento.

Discussão

Nos procedimentos descritos no presente documento, demonstramos a aplicação da técnica SILAC para investigar o efeito de infecção por HIV-1 no proteoma exosomal hospedeiro. Inicialmente, as células infectadas e não infectadas com HIV-1 são diferencialmente marcado com isótopo. Os exossomas marcados diferencialmente são então purificados antes de realizar a extracção de proteínas. Em seguida, a espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida é utilizada para analisar o proteoma exosomal. Fina...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
H9 cell line	ATCC	HTB-176
Trypan Blue	Thermo Fisher	15250061
MTT assay kit	Thermo Fisher	V13154
Dialyzed fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher	26400044
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640	Thermo Fisher	89982	DMEM version (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC	Thermo Fisher	88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC	Thermo Fisher	88431
HIV-1 NL4-3	NIH AIDS Reagent Program	2480
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit	PerkinElmer	NEK050001KT
Refrigerated super-speed centrifuge	Eppendorf	22628045
Refrigerated ultracentrifuge	Beckman Coulter	363118	Should be able to reach 100,000 x g
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher	14-432-22
Ultracentrifuge Tubes	Beckman Coulter	326823
SW 32 Ti Rotor	Beckman Coulter	369694
RIPA buffer	Thermo Fisher	89900
Protease Inhibitor Cocktails	Thermo Fisher	78430
ThermoMixer	Eppendorf	5384000020
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher	23250
Spectrophotometer	Biorad	1702525
SDS PAGE Gel apparatus	Thermo Fisher	EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels	Novex	XV04200PK20
Gel staining reagent	Sigma Aldrich	G1041
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
SpeedVac Concentrator	Thermo Fisher	SPD131DDA
Antibody to human annexin A5	Abcam	ab14196
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain	Abcam	ab53292
Graphing and Statistical Software	Systat	SigmaPlot	Or GraphPad Prism
Quantitative proteomics software suite	Max Planck Institue of Biochemistry	Maxquant
Software and databases	Various vendors		Refer to main text for details