Um Modelo de Cardiologia remodela Através constrição da Aorta Abdominal em Ratos

Resumo

A rat model of abdominal aortic constriction that induces cardiac hypertrophy and remodeling is described. An efficient, highly-reproducible, and minimally-invasive method is used to provide a simple yet useful platform for research in myocardial hypertrophy and dysfunction.

Resumo

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and fluid retention. Changes in myocardial structure, electrical conduction, and energy metabolism develop with heart failure, leading to contractile dysfunction, increased risk of arrhythmias, and sudden death. Hypertensive heart disease is one of the key contributing factors of cardiac remodeling associated with heart failure. The most commonly-used animal model mimicking hypertensive heart disease is created via surgical interventions, such as by narrowing the aorta. Abdominal aortic constriction is a useful experimental technique to induce a pressure overload, which leads to heart failure. The surgery can be easily performed, without the need for chest opening or mechanical ventilation. Abdominal aortic constriction-induced cardiac pathology progresses gradually, making this model relevant to clinical hypertensive heart failure. Cardiac injury and remodeling can be observed 10 weeks after the surgery. The method described here provides a simple and effective approach to produce a hypertensive heart disease animal model that is suitable for studying disease mechanisms and for testing novel therapeutics.

Introdução

A insuficiência cardíaca é uma síndrome complexa clínica, cujos sintomas incluem fadiga, dispneia, intolerância ao exercício, e retenção de líquidos nos tecidos periféricos. É a principal causa de morte em países desenvolvidos ^1. Além de cardiomiopatia hereditária causada por mutações em proteínas sarcômero ou canais iónicos ^2, disfunção miocárdica pode ser causada por uma variedade de condições médicas, incluindo a hipertensão, doenças de coração valvular, obesidade, diabetes e ^3. Mudanças na estrutura do miocárdio, condução elétrica, e chumbo metabolismo energético a capacidade inadequada de bombeamento cardíaco para atender às demandas do aparelho circulatório, que resulta em insuficiência cardíaca ^3,4. Investigar os mecanismos subjacentes insuficiência cardíaca, portanto, é crítico no domínio da investigação cardiovascular. Identificando os mecanismos moleculares que conduzem à progressão da insuficiência cardíaca, eventualmente, pode auxiliar na identificação de novos alvos terapêuticos ou biomarcadores úteis 1. Portanto, é importante para desenvolver modelos de insuficiência cardíaca de animais que compartilham características clínicas principais com insuficiência cardíaca em humanos ^5.

hipertrofia e remodelação cardíaca desempenha um papel crítico no desenvolvimento de insuficiência cardíaca. Doença cardíaca hipertensiva é o fator de contribuição chave da hipertrofia cardíaca ea remodelação maladaptive visto em pacientes humanos ^1. Para imitar essas condições humanas, os modelos animais são muitas vezes estabelecida através de procedimentos cirúrgicos. Em particular, a aorta abdominal transverso ou podem ser constrito para aumentar a resistência contra o ventrículo esquerdo, o que acaba por conduzir a uma sobrecarga de pressão no coração. Este fenómeno resulta geralmente em hipertrofia cardíaca, uma compensação fisiológica dos cardiomiócitos para satisfazer a exigência funcional do sistema cardiovascular. No entanto, a demanda funcional substitui os mecanismos compensatórios fisiológicas normais, levando a fibrose cardíaca e contraçãoimpairment telha. cirurgia transversal constrição aórtica (TAC) muitas vezes envolve procedimentos complicados, incluindo toracotomia, ventilação mecânica, e separação do timo e tecido adiposo do arco aórtico. Em contraste, a constrição da aorta abdominal mais simples requer técnicas experimentais ^6-8. A aorta abdominal, entre a esquerda e artérias renais direita, é contraída durante a cirurgia. Hipertrofia e remodelação cardíaca pode ser observado várias semanas após a cirurgia abdominal aórtica constrição ^6-8; eles produzem doença cardíaca hipertensa robusta semelhante à gerada pelo transversal cirurgia constrição da aorta ^9,10. Aqui, descrevemos um protocolo para conduzir a constrição da aorta abdominal em ratos utilizando um método eficiente, altamente reprodutível e minimamente invasiva. A aorta abdominal adjacente às artérias renais é limitado por um circuito de 0,72 milímetros formado por um fio de seda 4-0. Dez semanas após a cirurgia, hipertrofia cardíaca e remodeling pode ser observada. O modelo de rato de hipertrofia cardíaca induzida por constrição da aorta abdominal fornece uma plataforma para o estudo de mecanismos da doença e fisiopatologia, bem como o desenvolvimento de potenciais terapias.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, publicado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH publicação no. 85-23, revista em 1996). Este protocolo foi aprovado e em conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use na Universidade Nacional de Taiwan.

1. Cirurgia animal

1. Prepare um G agulha de seringa 22 por embotamento da ponta da agulha em uma pedra de afiar. Utilizando um alicate, plicate a agulha a um ângulo direito.
2. Antes da cirurgia, preparar os instrumentos cirúrgicos necessários e materiais, bem como uma gaiola de recuperação. Autoclave todos os instrumentos e material cirúrgico antes do uso.
3. Manter os ratos em torno de 200 g e mantê-los sob 12 h ciclo claro / escuro a uma temperatura controlada (21 ± 2 ° C), com livre acesso a comida e água. Incluir pelo menos 6 ratos em cada grupo. Anestesiar os ratos com pentobarbital(75 mg / kg em 0,5 ml, ip) ou um outro agente anestésico apropriado. Confirmar a profundidade da anestesia, testando o reflexo da cauda.
   NOTA: A ausência do reflexo da cauda é um indicador de anestesia adequada.
4. Coloque um rato na posição supina sobre uma plataforma de cirurgia com uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do corpo. Raspar a região abdominal do rato com um cortador de pêlos e cabelos loção removedor para evitar contaminações cirúrgicos. Esfregar o abdômen limpa raspada com betadine ou outro reagente de limpeza antes da cirurgia.
   NOTA: É importante manter um campo esterilizado durante todo o procedimento.
5. Adicione de 2 cm da incisão ao longo da linha média do abdómen com um bisturi. Usando solução salina normal, manter o órgão abdominal úmida durante a cirurgia. Deslocar os órgãos digestivos cuidadosamente para o lado usando bolas de algodão para expor a veia cava inferior, que se situa na região peritoneal posterior. Identificar a aorta abdominal, que se encontra justaposta e, geralmente, sobre aesquerda da veia cava inferior.
   NOTA: A aorta abdominal é o vaso que pulsa no tempo com o ritmo cardíaco.
6. Furar o peritônio com um par de fórceps para descobrir os vasos abaixo. Gentilmente isolar a aorta abdominal ao lado das artérias renais e passar a 8 cm de comprimento por 4-0 sutura de seda por baixo da aorta abdominal entre as origens do direito e artérias renal esquerda.
7. Faça um nó duplo solto com a sutura; deixar um loop 3 mm de diâmetro e coloque a agulha 22 G embotada e dobrada dentro do loop. Apertar o nó em torno da aorta e da agulha, e em seguida, remover a agulha imediatamente para alcançar uma constrição diâmetro 0,7 mm.
8. Fechar a cavidade abdominal com 6-0 material de sutura absorvível. Suturar o músculo ou da pele incisões com suturas interrompidas simples. Para prevenir a infecção, esfregue o local da cirurgia com uma tintura de iodo.
9. Observar o animal com cuidado até que ele recupera a consciência suficiente, como indicado pela livre circulaçãoe ingestão de alimentos. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Para prevenir a dor pós-cirurgia, o tratamento de ratos com acetaminofeno (300 mg / kg em 0,5 ml, ip).
   Nota: Os usuários devem administrar analgésicos conforme aprovado por políticas institucionais.

2. Tecidos e coleta de sangue

1. No pós-operatório de 10 semanas, pesar o rato e anestesiar com pentobarbital (75 mg / kg em 0,5 ml, ip). Antes da cirurgia, confirmar a profundidade da anestesia, testando o seu reflexo cauda. Coloque o rato em uma bandeja de metal.
2. Adicione de 2 cm da incisão ao longo da linha média do pescoço utilizando um bisturi. Deslocar os músculos cuidadosamente com uma pinça para expor a traqueia. Observe cuidadosamente para identificar as artérias carótidas, as quais são paralelas à traqueia e vibram no tempo com o ritmo cardíaco.
3. Recolhe-se o sangue a partir da artéria carótida dentro de um tubo de recolha de sangue revestido com EDTA. imediatamente centrífugao sangue durante 15 minutos a 2000 xg e recolher o plasma. Armazenar o plasma do sangue a -80 ° C até ser necessário.
4. Adicione 5 cm de incisão na região torácica, em torno da linha média do processo xifóide. Perfurar o diafragma com uma pinça afiada. Utilizando um par de tesouras, cortar e remover a caixa torácica ao longo das linhas médio-clavicular de ambos os lados para expor o coração. Extirpar o coração cuidadosamente ao longo das fronteiras cardíacas e vasculares. Retire o coração suavemente sem agarrar o tecido.
5. Monte o coração em um aparelho de perfusão Langendorff modificado por amarrar o tronco da aorta para a agulha de perfusão. Perfundir o coração com tampão de Krebs (contendo NaCl 110 mM, KCl 2,6 mM, 1,2 mM _de KH ₂ PO _4, 1,2 mM _MgSO4, 25 mM de NaHCO _3, e glucose 11 mM [pH 7,4]) para lavar o sangue. Pese o coração e calcular a relação coração de peso-para-corpo-peso. Corrigir o coração com 4% de paraformaldeído, em gelo. Lembre-se de usar uma máscara, uma vez que o vapor paraformaldeído é toxic.

3. tecido fibroso Quantificação

1. Colocar o tecido cardíaco fixo-paraformaldeído em um dispositivo de corte de tecido e cortado 2 mm de espessura. Coloque as secções de tecido em uma cassete de incorporação. Desidratar o tecido através de uma série de banhos de álcool graduado (50%, 75%, 95%, e 100% durante 1 h cada).
2. Se infiltrar o tecido com xileno, durante 1 hora e finalmente em cera, durante 1 h. Coloque o tecido infiltrado numa cassete de incorporação e incorporar com cera de parafina. Armazenar os tecidos embebidos em blocos de parafina à temperatura ambiente até microtoming.
3. Corte o tecido embebido em 4 mm de espessura. Coloque as secções em banho-maria 45 ºC. Mergulhar uma lâmina de vidro para o banho de água a um ângulo e gradualmente se aproxima das bordas parafina secção parcial para permitir a ligação à corrediça.
4. Mova o controle deslizante dentro e fora do banho para remover bolsas de ar potenciais sob a secção de tecido e para facilitar uma melhor fixação. Dry tele desliza a 37 ºC durante 1 hora e armazená-los à temperatura ambiente durante coloração histológica.
5. Coloque o slide em um tanque. Desparafinar o diapositivo com xileno durante 30 minutos e re-hidratar-o em álcool diluído sequencialmente (95%, 75%, e 50% durante 3 min cada) e finalmente com água destilada. Use solução vermelho de picrosirius suficiente para cobrir completamente as secções de tecido, durante 1 h. Lavar as lâminas em uma solução de ácido acético 0,5% para duas alterações, e depois executar duas lavagens em álcool absoluto.
6. Ar seco o slide e montar o slide em resina sintética com uma lamela. Fotografar o slide em um campo de luz visível.
   NOTA: A área vermelha na fotografia mostra uma zona positiva vermelho picrosirius sob um microscópio com ampliação de 200X. Calcular a percentagem da zona positiva vermelho de picrosirius sobre a área total, o que indica a extensão de fibrose ^11.

4. Sangue troponina Quantificação

1. Quantificar os níveis de troponina plasmausando um ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA). Ensaiar cada amostra em duplicado. Carga de 50 ul de plasma sanguíneo e de 50 ul de uma mistura de anticorpos nos poços apropriados. Selar a placa e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente num agitador de placas a 400 rpm.
   NOTA: A troponina cardíaca no plasma é um marcador de lesão cardíaca.
2. Aspirar o líquido e lavar cada cavidade com 250 uL de tampão de lavagem três vezes. Após a última lavagem, inverter a placa e apagá-lo contra toalhas de papel limpo para remover o líquido em excesso.
3. Adicionar 100 ul de substrato de tetrametilbenzidina a cada poço e incubar durante 10 min no escuro, num agitador de placas a 400 rpm. Adicionar 100 ul de solução de paragem a cada poço. Agitar a placa num agitador de placas durante 1 minuto para misturar. Grave a densidade óptica (OD) a 450 nm.
   NOTA: A concentração de troponina é proporcional ao valor OD.

Resultados

10 semanas após a cirurgia a constrição da aorta abdominal, foi analisada a patologia cardíaca resultante. A histologia cardíaco foi medido através do cálculo da razão entre o peso do coração para o peso corporal e detectando a quantidade de colagénio no coração. lesão cardíaca foi confirmada pela medição da concentração plasmática troponina.

Como mostrado na Figura 1A, o tamanho cardíaco ...

Discussão

Hypertensive heart disease, a major health problem that contributes greatly to morbidity and mortality, can lead to cardiac hypertrophy and heart failure⁵. The pathogenesis and progression of hypertensive heart disease in humans is complex, so an appropriate animal model is critical to investigate the underlying mechanisms and to test novel therapeutics that aim to improve cardiac structure and function⁵. The abdominal aortic constriction model, which simulates chronic heart disease, is an effective...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G syringe needle	BD Biosciences	309572
EDTA Blood Collection Tubes	BD Biosciences	REF365974
4-0 silk suture	Sharpoint™ Products	DC-2515N
6-0 silk suture	Sharpoint™ Products	DC-2150N
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	441244
Acetaminophen	Sigma Aldrich	A7085
Picrosirius red solution	Abcam	ab150681
Cardiac troponin kit	Abcam	ab200016
Imagequant	Molecular Dynamics
Langendorff	ADInstruments	ML870B2